Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Классификация пектолитических ферментов 11
1.1.1 Пектинэстераза высших растений 17
1.1.2 Полигалактуроназа высших растений 19
1.2. Селекция и мутагенез микроорганизмов — 24
продуцентов пектолитических ферментов
1.3. Биосинтез пектолитических ферментов 32
микроорганизмами
1.4. Продуценты пектолитических ферментов 39
1.5. Аспекты практического применения 44
пектолитических ферментов
Глава II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 49
2.1. Материалы и методы исследований 49
2.1.1 Объекты исследований 49
2.1.2 Условия хранения посевного материала 49
2.1.3 Культивирование микроорганизмов 50
2.1.4 Влияние начального рН питательной среды 50
2.1.5 Влияние аэрации питательной среды на активность пектолитических ферментов50
2.1.6 Влияние возраста посевного материала 51
2.1.7 Получение концентрированных ферментных препаратов 51
2.2. Методы определения активности ферментов 51
2.2.1 Определение общей пектолитической активности 51
2.2.2 Определение эндо-полигалактуроназной активности 52
2.2.3 Определение пектинэстеразной активности 52
2.2.4 Определение ксиланазной активности 52
2.2.5 Определение целлюлолитической активности 53
2.2.6 Определение (З-Глюканазной активности 53
2.2.7 Определение хитиназной активности 54
2.3 Методы биохимического анализа 54
2.3.1 Определение содержания растворимого белка по 54 методу Лоури
2.3.2 Определение термостабильности 54 пектолитических ферментов
2.3.3 Определение рН-стабильности пектолитических 55 ферментов
2.3.4 Структура исследований 56
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 57
3.1. Сравнительная оценка микромицетов, синтезирующих пектолитические ферменты 57
3.1.2 Селекция штамма A.foetidus 37 с целью повышения его биосинтетической способности 59
3.1.2 Подбор условий для поддержания биохимической активности в посевной культуре61
3.2. Разработка ускоренного микробиологического метода отбора активных вариантов 64
3.3. Физиолого - биохимическая характеристика отобранного варианта 66
3.3.1 Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза пектолитичеких ферментов методом аддитивно-решетчатого описания объекта 66
3.4. Селекция и мутагенез родительского штамма
A.foetidus 72
3.4.1 Методика по ведению и хранению штамма 5 Aspergillus foetidus 379-K - продуцента пектолитических ферментов 78
3.4.1.1 Морфологическая характеристика продуцента пектолитических ферментов79
3.4.1.2 Описание процесса поддержания продуцента пектолитических ферментов вактивном состоянии80
3.4.1.3 Приготовление суспензии конидий Aspergillus foetidus 379-K 80
3.4.1.4 Рассев суспензии конидий продуцента пектолитических ферментов на агаризованную питательную среду в чашках Петри 81
3.4.1.5 Выращивание колоний микромицета Aspergillus foetidus 379-К в чашках Петри и проверка активности в отобранных колониях 82
3.4.1.6 Рассев активных колоний на косяки с 82 агаризованной питательной средой и определение активности пектолитических ферментов в култьтуре микромицета Aspergillus foetidus 379-K
3.5. Исследование процессов биосинтеза 84
экзопектиназ и состава ферментативного комплекса, продуцируемого грибом A.foetidus 379-К
3.5.1 Влияние начального рН на синтез пектолитических ферментов84
3.5.2 Влияние интенсивности аэрирования на биосинтез пектиназ85
3.5.3 Динамика накопления пектолитических ферментов и изменение рН в процессе роста культуры86
3.6. Получение комплексного ФП Пектофоетидин Г10ХиГ18Х 90
3.6.1 Изучение условий получения ФП 90 Пектофоетидин Г10Х и Г18Х и их биохимичекая характеристика
3.6.2 Изучение фракционного состава ФП 92 Пектофоетидин Г10Х, полученного на основе мутантного штамма Aspergillus foetidus 379-К
3.6.3 Сравнительная характеристика ФППектофоетидин Г10Х и Пектофоетидин П10Х 104
3.6.4. Изучение рН и термостабильности ФП пектиназ 105
3.6.5. Исследование эффективности действия ФП 109 пектиназ на деструкцию клюквенного сырья при получении соков
3.7. Заключение 113
ВЫВОДЫ 114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
ПРИЛОЖЕНИЯ 134
- Классификация пектолитических ферментов
- Материалы и методы исследований
- Сравнительная оценка микромицетов, синтезирующих пектолитические ферменты
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время большое внимание уделяется пектиновым веществам, деполимеризация которых осуществляется ферментами, входящими в пектолитический комплекс: пектингидролазами и пектинлиазами. Пектолитические ферменты имеют большое промышленное значение в различных отраслях биотехнологии: при; получении пектинов; для интенсификации производства соков из плодово-ягодного сырья и осветления вин; для получения пищевых красителей и таннинов; при обработке текстильных волокон; Потребность в этих ферментах стабильно растет.
Эффективность расщепления пектинсодержащих веществ зависит не только от применения биопрепаратов-источников активных пектолитических ферментов, но и от соотношения пектиназ различной специфичности и механизма действия в составе пектолитического комплекса; что: обусловлено физиологическими и культуральными особенностями; штамма-продуцента. Одним из основных источников получения пектолитических ферментов являются микромицеты, которые обладают характерной особенностью синтезировать широкий спектр активных внеклеточных пектиназ.
Работы многих исследователей посвящены созданию активных штаммов-продуцентов пектиназ и технологиям производства и применения ФП пектолитического действия (Бравова Г.Б.1981, Михайлова Р.В., Сапунова Л.И. 1992, Синицын А.П., Семенова М.В.2003, Бутова С.Н.2004, Римарева Л.В., Курбатова Е.И.2004).
Ранее широкое применение в сокоморсовой? промышленности и виноделии имел ФП отечественного производства Пектофоетидин ШОХ. В биотехнологии Пектофоетидина использовали гриб Aspergillus foetidus, культивируемый твердофазным методом. Однако, в настоящее время предприятия, основанные на поверхностном культивировании продуцентов-ферментов, отсутствуют.
8 На современном этапе перспективным направлением науки является
создание с использованием генетических и селекционных методов нового
высокоэффективного штамма-продуцента пектолитических ферментов для
глубинного культивирования, с целью разработки научных основ
ферментных технологий для перерабатывающих отраслей АПК. Применение
отечественных биокатализаторов позволит не только интенсифицировать
существующие биотехнологические процессы в пищевой промышленности
и создать конкурентоспособную продукцию нового поколения с заданными
свойствами, но и произвести импортозамещение, так как высокая цена
биопрепаратов ограничивает их широкое применение в России.
Цель и задачи исследования. Основная цель диссертационной работы заключалась в скрининге активного штамма - продуцента внеклеточных пектиназ, подборе оптимальных условий его глубинного культивирования для получения ферментного комплексного препарата пектолитического действия.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
скрининг и селекция штаммов- продуцентов внеклеточных пектиназ;
мутагенез селекционированного штамма для, повышения его биосинтетической способности;
изучение физиолого-морфологических и биохимических особенностей отобранного продуцента;
- подбор оптимальных условий для получения ферментного
препарата и исследование его биохимической характеристики;
оценка эффективности применения препаратов для^ биокатализа полисахаридов растительного сырья.
Научная новизна работы. Впервые методами селекции и мутагенеза осуществлен скрининг нового штамма Aspergillus foetidus 379-К -продуцента комплекса пектолитических ферментов и исследованы его культуральные и морфолого-биохимические признаки. На основе установленных физиологических особенностей селекционированного
штамма подобраны условия, позволяющие продуцировать ферментативный
комплекс с доминирующими ферментами пектолитического действия и сопутствующими — ксиланазой, целлюлазой, (3-глюканазой, хитиназой, маннаназой. Разработан новый экспресс-метод отбора активных вариантов при селекции микромицетов-продуцентов пектиназ. Получены, новые экспериментальные данные по составу ферментного комплекса, продуцируемого A.foetidus 379-К. Показана возможность регуляции биосинтеза отдельных ферментов комплекса штаммом A.foetidus 379-К путем изменения условий культивирования» (рН, температура, время культивирования). Получен новый ферментный препарат Пектофоетидин методом глубинного культивирования и исследована его биохимическая характеристика.
Практическая значимость работы. В результате изучения свойств,
отселекционированного штамма разработана и экспериментально обоснована
новаяі технология ферментного препарата Пектофоетидин. Штамм
депонирован во Всероссийской коллекции промышленных
микроорганимзмов под номером F-962. Разработаны паспорт на штамм Aspergillus foetidus 379-К, методика по ведению и хранению продуцента пектолитических ферментов, ТУ на ферментный препарат Пектофоетидин Г10Х и ТИ по получению ФП.
Проведены производственные испытания нового ФП на ОАО-«Уржумский спирто-водочный завод» в технологии получения спиртованных соков.
Апробация работы. Основные положения представлены на следующих симпозиумах и конференциях: Международных симпозиумах «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК (Москва, 2004); «Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК» (Москва, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы создания продуктов здорового питания. Наука и технологии» (Углич,2006);
10 «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях»
(Москва,2008)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них статей- 7.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего {СО источника, из них Ш отечественных, /С иностранных. Работа изложена /00 страницах машинописного текста, включает / таблиц и Jt/рисунков.
Классификация пектолитических ферментов
Пектолитические ферменты (ПФ) были открыты в 1840 году (цит. по В.И.Смирнов, В.В.Котелев, 1971). Дальнейшие исследования позволили установить, что это сложный комплекс, по мере изучения которого выявлялись новые представители, различающиеся по специфичности в структуре субстрата, месту атаки и механизму действия. Неоднократно предпринимались попытки классифицировать ПФ. Наибольшее распространение в свое время получили классификационные системы Димейна и Фара (Demain, Phaff, 1957) и Доуела и Штуца (Deuel, Stutz, 1958).
Жоуел и Штуц разделяют пектиновые а-1,4 - гликозидазы на 3 класса на основании способа действия и отношения к степени метилирования субстрата: разжижающая полиметилгалактуроназа и осахаривающая полигалактуроназа.
В основе классификации Димейна и Фафа лежит тип атаки на субстрат.
Степень гидролиза и рН оптимум действия используются для дальнейшего разделения внутри основной группы.
Эти классификационные системы были предложены в- 1987 году, а спустя три года Альберсхейм с соавторами (Albtracheim et аК, Л 960) выделил фермент, расщепляющий пектиновые вещества;трансэлиминативным: путем. Поэтому, согласно классификации и номенклатуре ферментов (1962); ПФ разделяют на две основные группы, учитывая связи полимера, на которые они действуют. Первая:группа представлена;пектинэстеразош(ПЭ), которая : отщепляя метильные группы от метилового? эфира;галактуроновой кислоты деметоксилирует пектин; с образованием пектовой кислоты и; метилового -спирта. ПЭ относится: к гидролазам эфиров карбоновых кислот и называется пектингидролазой пектинов Во? вторую; группу входят ферменты гидролизирующие а — 1,4 -гликозидные связи-пектинов гидролитическим и трансэлиминатинвым путем:; Классийикация этих ферментов, учитывает субстрат для- действия; способ? действия (гидролиз или трансэлиминирование);. а также механизм, действия (расщепление неупорядоченным образом; или с конца цепи полимера,, т.е. эндо- и экзоферменты).
Молекулярный вес пектиновых веществ, колеблется в пределах 2500-100000. Соотношение: компонентов с различными молекулярными весами зависит, главным образом, от происхождения пектина и метода его получения. Более детальные сведения о химическом строении пектиновых веществ, их свойствах, методах определения; их распространения и значении можно найти в ряде обзоров (ВіВ; Арасимович с соавт., 1970 Е.В.Сапожникова, 1971; В.П.Тищенко, К.В; Сапожникова, 1972).
Изучение состава пектиновых веществ показало наличие двух фракций: нейтральной и кислой. Первая составляющая 10-12% от общего пектина, представлена арабан-галактановым комплексом, а вторая (80-90%) — частично этерифированными пектиновыми кислотами, содержащими различные количества нейтральных Сахаров. Основой молекулы пектина
является полигалактуроновая кислота. Это полимер состоит из звеньев галактуроновой кислоты, соединенных между собой а — 1,4- гликозидной связью в линейную цепь:
Материалы и методы исследований
На этапе селекционных работ были исследованы штаммы: 6 штаммов-A.foetidus, 2 штамма.-А, usami, 1 штамм — A.niger, 1 штамм — A.fumigatus, 1 штамм — A.oryzae, 1 штамм — Rhizopus delemar, 1 штамм — Rhizopus tonkinensis, 1 штамм - Pen.citro-viride, 1 штамм - A.awamori, 1 штаммrichoderma reset
В качестве исходной культуры использовали штамм Aspergillus foetidus 379-К, полученный селекционным путем из родительского штамма Aspergillus foetidus 37. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером F-962. Преимуществом штамма является его способность синтезировать при глубинном культивировании комплекс пектолитических ферментов и сопутствующих - гидролитических.
Условия хранения посевного материала
Хранение культуры осуществляли на агаризованной среде, содержащей солодовое сусло 7Б, водопроводную воду и агар-агар — 3%. рН среды 5,0-5,5. Выращивание штаммов проводили в течение 10 суток при 30С. В дальнейшем культуру хранили в условиях холодильника при температуре 4С.
С целью предотвращения спонтанной мутации и сохранении исходных свойств продуцента 1-2 раза в год проводили скрининг с проверкой функциональной активности. Для этого суспензию спор рассевали на чашки
Петри с агаризованной питательной средой, выбирали наиболее типичные колонии и проверяли их способность к биосинтезу комплекса пектолитических ферментов путем глубинного культивирования на ферментационной среде. .Культивирование микроорганизмов
Культивирование микроорганизмов осуществляли глубинным способом в колбах Эрленмейера со 100 мл ферментационной среды на микробиологической качалке со скоростью 220 об/мин. в течение 72-96 часов при температуре 30-35С в зависимости от условий эксперимента.
.Влияние начального значения рН питательной среды
Влияние начального значения рН питательной среды на биосинтез ферментов изучали при культивировании продуцента в колбах Эрленмейера с начальным значением рН питательной среды от 4,0 до 7,0 (частота изменения - 0,5), которое устанавливали с помощью растворов NaOH и НС1.
Влияние аэрации питательной среды на активность пектолитических ферментов
Исследование влияния аэрации на накопление пектолитических ферментов проводили в колбах Эрленмейера с различным объемом питательной среды: 25,50,75 и 100см3.
.Влияние возраста посевного материала
Возраст посевного материала изучали при культивировании продуцента в колбах Эрленмейера при засеве питательной среды посевным материалом различного возраста: от 3 до 10 суток.
Получение концентрированных ферментных препаратов
Препараты степени очистки Г10Х получали путем осаждения при постоянном помешивании фильтрата культуральной жидкости продуцента этиловым спиртом в соотношении 1:3. Осаждение проводили предварительно охладив растворитель до температуры — 5 - —10 С. Осажденный белок отстаивали в течение 15-20 минут, после чего прозрачную надосадочную жидкость декантировали, а ферментный препарат центрифугировали и высушивали на воздухе до постоянного веса.
Для получения ультраконцентратов культуральную жидкость фильтровали через два слоя фильтровальной бумаги. Концентрирование препарата осуществляли на мембране марки УПМ-10.
Сравнительная оценка микромицетов, синтезирующих пектолитические ферменты
Обзор микроорганизмов, используемых для промышленного производства столь разнообразных веществ, дает представление о громадном народнохозяйственном значении микробиологической промышленности. Дальнейшее развитие ее в первую очередь связано с выведением и внедрением в производство высокоактивных штаммов продуцентов. Решающую роль в этом деле должны сыграть генетика и селекция.
В селекционных исследованиях был применен разработанный нами ускоренный микробиологический метод скрининга, позволяющий по окрашенным зонам гидролиза субстрата, образующимся вокруг гигантских колоний, отбирать активные варианты.
Исходный штамм
Приготовление споровой суспензии
Высев суспензии на различные селективные агаризованные среды
Отбор клонов по окрашенным зонам гидролиза
Отсев отобранных вариантов на скошенный сусло-агар Тестирование по пектолитической активности
Суспензию высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей цитрусовый, арбузный, яблочный пектин с различной степенью метоксилирования. Колонии с наибольшими окрашенными зонами гидролиза питательной среды высевали вновь на чашки Петри.
После образования гигантских колоний культуру отсевали на скошенный сусло-агар. Каждая выросшая культура представляла собой отдельный клон, который затем проверяли на пектолитическую активность при глубинном культивировании на жидкой питательной среде.
В результате селекции было получено более 500 различных популяций исходного штамма Aspergillus foetidus 3 7.
Среди проверенных популяций было отобрано 8 вариантов, которые отличались от исходного штамма по морфологическим признакам и по уровню активности синтезируемых пектолитических ферментов при культивировании на натуральной питательной среде.
Наибольшей способностью к синтезу пектиназ обладал штамм Aspergillus foetidus - 37-4, который секретировал внеклеточную пектиназу с активностью 1,0-1,2 ед/см (рис.2).
Культивирование продуцентов осуществляли в колбах Эрленмейера на питательной среде следующего состава (%): неосветленные свекловичные волокна -3,0, (NH4)2S04 - 0,3, КН2Р04 - 0,1, MgSO4-0,l в течение 4-х суток при температуре 28-3 0С. В качестве посевного материала применяли культуру, выращенную в течение 7 суток на сусло-агаре.
После выращивания колоний на агаризованных средах, содержащих солодовое сусло и пектины, полученные из различных источников растительного сырья с различной степенью метоксилирования, осуществляли отбор клонов по окрашенной зоне гидролиза субстрата среды, после чего отсевали отобранные клоны на скошенный сусло-агар и определяли активности пектолитических ферментов методом глубинного культивирования продуцентов на питательной среде для синтеза пектолитических ферментов.
