Введение к работе
Актуальность проблемы. В современном мире неуклонно растет понимание чрезвычайной социально-экономической значимости глобального распространения различных инфекционных болезней Особенностью сложившейся эпидемиологической ситуации является не только повсеместная активизация практически всех известных инфекционных заболеваний, которые традиционно находятся под контролем санитарно-эпидемиологических служб, но и возникновение очагов новых и возвращающихся инфекций бактериальной и вирусной природы (Онищенко Г Г, Кутырев В В , Кривуля С Д и соавт, 2006, Локтев В Б, 2007)
Важной задачей в борьбе с инфекционными заболеваниями является обнаружение и идентификация возбудителей, решение этой проблемы обеспечивается широким арсеналом методических приемов от классических методик микробиологического и вирусологического тестирования до современных им-мунохимических и генетических методов
Достижения последних десятилетий в области химии, биохимии, биотехнологии способствовали к разработке принципиально новых материалов - сорбентов для разделения и очистки биополимеров, матриц для их иммобилизации и т п (Брыкалов А В , 1993, Кузнецов С И , Барашкова Л Н , Носикова и соавт , 1998, Коваленко Г А , Комова О В , Симаков А В и соавт, 2002, Кунижев С М , Воробьева О В , Денисова Е В и соавт, 2002, Лисецкий В И , Лисецкая Т А , Меркушева Л И и соавт, 2004 и др) Внедрение таких материалов в практику лабораторной диагностики инфекционных заболеваний привело к значительному повышению качества лабораторного анализа, выражающегося как в увеличении чувствительности и специфичности методов, так и достоверности результатов (положительных и отрицательных) Перспективными для применения в диагностике и идентификации патогенов являются различные гранулированные иммуносорбенты, в том числе с магнитными свойствами, так называемые магноиммуносорбенты (МИС) (Ефременко ВИ, 1996, Тюменцева ИС, 1996, Жарникова И В , 2004, Василенко Н Ф 2004 и др )
Их внедрение в лабораторную практику может существенно помочь в реализации задач, изложенных в Программе «Предупреждение чрезвычайных ситуаций эпидемического характера и санитарная охрана территории Южного Федерального округа Российской Федерации от заноса и распространения инфекционных болезней (2007-2011 гг)», принятой Советом Глав субъектов РФ ЮФО (протокол №А52-7801-34ДК от 29 11 2006 г) Это связано не только с
риском заноса заболеваний, но и наличием многих природных очагов особо опасных инфекций (чумы, бруцеллеза, сибирской язвы, туляремии, Крымской геморрагической лихорадки, лихорадки Западного Нила (ЛЗН) и др )
Ставропольский край в силу своих природных условий (жаркий засушливый климат, обилие водоемов, комаров и клещей, большая масса перелетных птиц и др) представляют большой интерес в отношении изучения циркуляции вируса лихорадки Западного Нила и его роли в патологии человека Такие исследования на территории Ставропольского края ранее никогда не велись
В связи со сказанным, совершенствование методов лабораторной диагностики ЛЗН и мониторинга природных очагов этой инфекции является актуальной задачей (Онищенко Г Г, 2000, Онищенко Г Г, Кутырев В В , Кривуля С Д с соавт, 2006)
Цель исследования: разработка биотехнологии нового аффинного сорбента на основе высокодисперсного кремнезема, изучение возможности его применения в экспресс-диагностике лихорадки Западного Нила
Основные задачи исследования:
-
Изучить возможность использования природного кремнезема в качестве твердофазной матрицы при получении сорбционного материала и охарактеризовать его химический состав
-
Провести модификацию поверхности сорбента с целью образования на ней активных функциональных групп, способных к иммобилизации белковых лигандов
-
Установить оптимальные параметры и условия синтеза магноим-муносорбента, его физико-химические и иммунохимические свойства
-
Разработать условия постановки сочетанных методов МИС + ИФА, МИС + ПЦР в эксперименте
-
Определить диагностическую ценность разработанного магноим-муносорбента при исследовании на ЛЗН полевого и клинического материала, собранного на территории Ставропольского края
Научная новизна работы.
Впервые предложен отечественный природный кремнезем для получения твердофазной матрицы сорбента, изучен его химический состав
Для образования функционально-активных групп на поверхности кремнезема, способных к ковалентному связыванию с остатками аминокислот бел-
ковых лигандов, разработан метод химической модификации его поверхности карбоксиметилированным лигнином и карбодиимидом (1-Циклогексил-3 (2-морфолинил-4-этил) карбодиимидметил-п-толуолсульфонатом)
Разработанная новая биотехнология позволяет получать аффинный сорбент с магнитными свойствами, обладающий высокой сорбционной емкостью, стабильностью структурных характеристик, высокой чувствительностью и специфичностью, для выявления возбудителя лихорадки Западного Нила
Результаты проведенных исследований дополняют новыми научными данными сведения о твердофазных носителях и химической модификации их поверхности с целью использования в биотехнологии получения аффинных сорбентов, тем самым пополняя и намечая направления изысканий в области усовершенствования иммунодиагностики инфекционных заболеваний, в том числе и лихорадки Западного Нила
Практическая значимость работы.
Впервые на территории Ставропольского края при исследовании объектов внешней среды с использованием аффинного сорбента выявлена циркуляция вируса ЛЗН и определен его основной переносчик - комары рода Aedes
Установление факта циркуляции возбудителя ЛЗН на территории Ставропольского края диктует необходимость проведения дальнейшего расширенного, углубленного эпидемиологического и эпизоотологического мониторинга для изучения природного очага этой вирусной инфекции
Применение сконструированного аффинного сорбента в сочетании с экспрессными методами лабораторной диагностики (ИФА и ПЦР) позволяет увеличить их чувствительность и специфичность, тем самым повышая выявляе-мость инфекционного патогена в 2,5 раза в ИФА и в 1,8 раза в ОТ-ПЦР, одновременно сокращает время проведения исследования с 20-21 часа до 1-3 часов за счет ускорения манипуляций и исключения ряда этапов в ходе анализов, что повышает их экспрессность, информативность и достоверность
По результатам выполненных исследований получен патент РФ № 2290641 от 27 12 2006 г «Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА)»
Внедрение результатов в практику.
Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ
6 №9 от 27 10 2005 г), «Применение органокремнеземного аффинного сорбента для селективного концентрирования возбудителя ЛЗН и последующего проведения экспресс-анализов (ИФА и ПЦР)», утвержденных директором СтавНИПЧИ (протокол Ученого совета СтавНИПЧИ №2 от 28 февраля 2007 г) Положения, выносимые на защиту:
-
Предложенный метод химической модификации поверхности природного кремнезема обеспечивает образование функционально-активных групп для прочного присоединения белкового лиганда, что придает сорбенту биоспецифические свойства
-
Созданная биотехнология изготовления аффинного твердофазного микрогранулированного лигнинсодержащего композиционного сорбента позволяет использовать его для избирательного концентрирования вируса лихорадки Западного Нила при проведении экспрессных методов лабораторной диагностики, что повышает их чувствительность и специфичность
-
Высокая эффективность разработанного ЛЗН-сорбента позволила впервые установить циркуляцию вируса ЛЗН на территории Ставропольского края
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были обсуждены на расширенной научной конференции лабораторий и отделов Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Роспотреб-надзора (Ставрополь, 14 июня, 2007) и представлены на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006), VII Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников содружества Независимых Государств (Оболенск, 3-5 октября, 2006), Втором съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных сил Российской Федерации «Современные проблемы военной профилактической медицины, пути их решения и перспективы развития» (Санкт-Петербург, 15-17 ноября, 2006), расширенном пленуме проблемной комиссии «Арбовирусы» РАМН и научно-практической конференции «Арбовирусы и арбо-вирусные инфекции» (Астрахань, 17-20 октября, 2006)
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 21 опубликованной научной работе
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы Она изложена на 130 страницах, содержит 7 таблиц и 11 рисунков Список литературы включает 269 источников, из них 218 отечественных и 51 зарубежный
