Введение к работе
Актуальность темы.
Начиная с двадцатого столетия животноводство многих экономически развитых стран мира несет большие убытки от эпидемических вспышек ящура. Недавние инфекционные вспышки ящура в Тайване (1997) и Великобритании (2001) существенно усилили обеспокоенность производителей и потребителей мяса сельскохозяйственных животных во многих странах мира. Основным способом контроля возникновения вспышек заболевания ящуром в настоящее время является вакцинация сельскохозяйственных животных вакцинами на основе инактивированного вируса. Несмотря на то, что иммунизация препаратами инактивированного вируса достаточно эффективна, такие вакцины имеют ряд существенных недостатков. Наиболее серьезные из них – проблемы безопасности, связанные с возможной утечкой не полностью инактивированного вируса, а также сложность достоверного диагностического различия вакцинированного животного от заболевшего, необходимость использования специальных лабораторий для их получения и недостаточно высокая скорость получения в условиях возникновения очага заболевания.
В связи с этими недостатками предпринимаются попытки разработать альтернативные вакцины против вируса ящура. В настоящее время разрабатываются методы использования в качестве вакцины фрагментов структурных и неструктурных белков вируса, например структурного белка VP1 или пустых вирусных капсидов, ослабленных вирусов, например с делецией участка капсидного белка VP1 или протеиназы Lpro. Такие вакцины не имеют некоторых недостатков традиционных вакцин, однако на сегодняшний день они менее эффективны по сравнению с вакцинами, созданными на основе инактивированного вируса. Поэтому задача получения альтернативной вакцины против ящура остается актуальной.
В настоящее время перспективной и представляющей огромный интерес для биотехнологических компаний системой получения белка является растение. Главными преимуществами использования растений для получения белка являются низкая конечная стоимость и биобезопасность продукта вследствие отсутствия у растений и животных общих патогенов. Рекомбинантные белки в растениях могут быть получены двумя методами: с помощью генетической трансформации или транзиентной экспрессии с помощью вирусных векторов. Создание трансгенного растения, а значит и получение белка из него, требует значительных временных затрат. Уровень экспрессии целевых белков трансгенными растениями обычно низок, что определяет высокую стоимость продукта вследствие сложности его очистки. Получение белка с использованием фитовирусной системы транзиентной экспрессии в растениях имеет ряд преимуществ; в первую очередь более высокий уровень экспрессии, биобезопасность и короткое время, необходимое для создания и тестирования экспрессионной системы.
Настоящая работа посвящена получению вакцинных белков вируса ящура, способных индуцировать иммунитет против заболевания ящуром у лабораторных животных, и разработке систем экспрессии этих белков в бактериях и растениях.
Цель и задачи исследований.
Целью работы является конструирование рекомбинантных вакцинных белков вируса ящура и разработка систем их экспрессии в бактериях и растениях.
Для этого в работе решались следующие задачи:
1. Создание систем транзиентной экспрессии предшественника капсидных белков Р1 и 3С-протеазы или отдельных капсидных белков вируса ящура (изолята O/Тайвань/99) в клетках растений Nicotiana benthamiana с помощью фитовирусных векторов;
2. Конструирование рекомбинантного гена, кодирующего искусственный белок НPE, содержащий набор иммуногенных В- и Т-клеточных эпитопов вируса ящура О-серотипа
3. Создание систем экспрессии белка НРЕ в клетках Escherichia coli и в растениях Nicotiana benthamiana;
4. Проверка иммуногенных свойств выделенных из клеток бактерий и растений препаратов белка НРЕ на лабораторных животных.
Научная новизна.
Впервые получен рекомбинантный вакцинный белок, содержащий комбинацию В- и Т-клеточных эпитопов вируса ящура в составе одной полипептидной цепи. Разработаны методы конструирования и получения такого полиэпитопного белка НРЕ, состоящего из фрагментов структурных (VP1, VP4) и неструктурных (2C, 3D) белков вируса ящура изолята О/Тайвань/99, в бактериальной системе экспрессии, а также методы его выделения и очистки.
Разработаны методы получения высокоочищенных препаратов белка НРЕ из растений N.benthamiana в количествах, достаточных для проведения биологических испытаний.
Высокая иммуногенность белка HPE, его способность обеспечивать полную защиту лабораторных животных от инфекции вирусом ящура серотипа О, определяют перспективность использования белка HPE в качестве основы для разработки рекомбинантных противоящурных вакцин.
Научная новизна подтверждена положительным решением о выдаче патента Российской Федерации.
Практическая значимость работы.
Разработанные методы конструирования и получения вакцинного белка НРЕ могут быть использованы для создания новых недорогих эффективных рекомбинантных противоящурных вакцин. Показано, что такой вакцинный белок можно получать на достаточно высоком уровне в различных гетерологичных системах. По мере изучения антигенных сайтов вируса возможно включение эпитопов, находящихся в этих сайтах, в последовательность полиэпитопного белка. Такой подход к созданию полиэпитопного белка, предполагающий соединение наиболее иммуногенных эпитопов в составе одной полипептидной цепи, может быть использован для разработки подходов к созданию противоящурных вакцин против других серотипов вируса, других вирусных инфекционных патогенов человека и животных.
Личный вклад соискателя заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Апробация результатов диссертации.
Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва - Пущино, 2009), 16-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука ХХI века» (Пущино, 2012), конференции «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, 2009).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, входящем в перечень ВАК. Получен 1 патент на изобретение РФ.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста и включают 25 рисунков и 3 таблицы. Диссертация состоит из разделов: “Введение”, “Цель и задачи работы”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты”, “Обсуждение”, “Выводы”, “Cписок публикаций по теме диссертации”, “Cписок цитируемой литературы”, который содержит 1 отечественный и 217 иностранных источника.
