Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1 Роль микроорганизмов в биологической защите растений 8
1.2 Факторы, влияющие на симбиоз микроорганизмов и растений 24
1.3 Характеристика фитопатогенных грибов 26
1.4 Способы повышения эффективности предпосевной обработки семян и пути снижения себестоимости биопрепаратов 31
1.5 Заключение 39
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 40
2.1 Объекты исследования 40
2.1.1 Бактерия Pseudomonas aureofaciens 40
2.1.2 Фитопатогенные грибы 40
2.1.3 Растительные объекты 42
2.1.4 Коммерческие биопрепараты
2.2 Состав и приготовление питательных сред 42
2.3 Постановка эксперимента 45
2.4 Аналитические методы 52
2.5 Статистическая обработка результатов 54
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 55
3.1 Изучение физиолого-биохимических характеристик бактерии Pseudomonas aureofaciens 55
3.2 Оптимизация среды на основе мелассы для культивирования Pseudomonas aureofaciens 67
3.3 Изучение фунгицидных свойств Pseudomonas aureofaciens 73
3.4 Исследование влияния бактериальной суспензии на ростовые показатели семян культурных растений 92
3.5 Предложение производству и практические рекомендации 114
Выводы 4
Список сокращений
- Факторы, влияющие на симбиоз микроорганизмов и растений
- Способы повышения эффективности предпосевной обработки семян и пути снижения себестоимости биопрепаратов
- Фитопатогенные грибы
- Оптимизация среды на основе мелассы для культивирования Pseudomonas aureofaciens
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время актуальной проблемой растениеводства является борьба с заболеваниями сельскохозяйственных культур, возбудителями которых являются различные фитопатогенные грибы. Используемые методы химической защиты имеют ряд существенных недостатков, поскольку их применение приводит к загрязнению окружающей среды, накоплению токсичных соединений в продуктах питания, что, несомненно, сказывается на здоровье людей и животных. Использование естественных обитателей почвы в качестве основных биоконтролирующих агентов позволяет устранить данные недостатки, а также способствует ее оздоровлению. В связи с этим актуальным является поиск наиболее активных штаммов микроорганизмов для борьбы с фитопатогенами и получение на их основе новых видов препаратов.
В настоящее время имеется большой опыт по использованию псевдомонад в сельскохозяйственной практике (Логинов О. Н., 2005). Данные микроорганизмы зарекомендовали себя как активные антагонисты грибов Fusarium spp., Alternaria spp., Phytophthora и т.д., вызывающих массовые заболевания сельскохозяйственных культур (Санин С. С, 2010; Баранова Е. В. с соавт., 2011; Jung W. J. et al., 2011; Perez-Garcia A. et al., 2011; Raio A. et al., 2011; Хархун E. В. с соавт., 2012).
При разработке технологии получения биопрепаратов большое внимание следует уделять повышению эффективности их действия и снижению себестоимости. Последнее возможно за счет использования отходов промышленности в качестве основы питательной среды. Известны способы культивирования бактерий на послеспиртовой барде (Лукаткин А. А., 2010), на нефтесодержащих субстратах (Анохина Т. О., 2011) и т.д. Перспективным субстратом является отход свеклосахарного производства - меласса. Однако, сведений о ее применении в качестве основного компонента питательной среды для культивирования псевдомонад недостаточно (Goksungur Y. et al., 2004; Kiiciikaik F. et al., 2011). Данный подход позволит расширить спектр применения мелассы и снизить себестоимость полученного бактериального препарата.
Цель исследования. Изучение свойств отселекционированного штамма бактерии Pseudomonas aureofaciens и оптимизация условий его культивирования на мелассной среде с целью получения высокоактивного биопрепарата для защиты от фитопатогенных грибов и стимуляции роста сельскохозяйственных культур.
Задачи исследования.
-
Исследовать основные физиолого-биохимические свойства отселекционированного штамма бактерии P. aureofaciens.
-
Оптимизировать состав среды на основе мелассы и подобрать условия культивирования, обеспечивающие максимальный рост бактерии.
-
Изучить фунгицидное действие P. aureofaciens по отношению к ряду фитопатогенных грибов.
-
Исследовать ростостимулирующие свойства полученного биопрепарата в лабораторных и полевых условиях.
Научная новизна работы. Впервые исследованы основные физиолого-биохимические особенности нового штамма бактерии P. aureofaciens и биологически активные метаболиты (индолил-3-уксусная кислота (ИУК) и антибиотические вещества феназинового ряда). Впервые оптимизирована среда на основе свеклосахарной мелассы для культивирования бактерии P. aureofaciens и получен высокоактивный биопрепарат, характеризующийся стабильным высоким титром и жизнеспособностью клеток в процессе хранения. Выявлено наличие фунгицидного действия полученной культуральной жидкости (КЖ) в отношении ряда фитопатогенных грибов. При обработке семян злаковых культур бактериальной суспензией (БС) отмечен выраженный ростостимулирующий эффект в лабораторных и полевых условиях.
Научно-практическая значимость работы. Оптимизированы условия получения биопрепарата комплексного действия с использованием высокоэффективного штамма бактерии P. aureofaciens. В качестве основного питательного субстрата предложено использование
свеклосахарной мелассы, позволяющее снизить себестоимость целевого продукта. Результаты исследования, проведенного в условиях открытого грунта, свидетельствуют о высокой эффективности использования БС P. aureofaciens для предпосевной обработки, позволяющей снизить степень заражения культурных растений и увеличить биологическую урожайность. Экспериментальные результаты и методики, изложенные в работе, используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий по курсу «Теоретические основы биотехнологии» на кафедре биотехнологии ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарёва». Основные положения, выносимые на защиту.
Изучены физиолого-биохимические свойства отселекционированного штамма бактерии P. aureofaciens.
Оптимизирован состав мелассной среды и условия культивирования бактерии P. aureofaciens.
Полученный биопрепарат обладает ростостимулирующим и фунгицидным действиями, проявление которых обусловлено синтезом биологически активных веществ фитогормональной (ИУК), антибиотической (феназиновые соединения) и ферментативной природы (гидролитические ферменты).
Связь работы с научными программами. Представленные результаты были получены в ходе исследований при поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «У.М.Н.И.К.» (проект № 13168) по теме «Разработка состава оболочки для обработки семян и изучение ее свойств».
Личный вклад автора. В работе приведены результаты, полученные лично автором, при выполнении работ в рамках совместной деятельности, кроме идентификации штамма бактерии, которая проводилась во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП Гос НИИ Генетика. Постановка проблемы, методическая разработка, планирование и проведение экспериментов, обработка полученных данных и апробация осуществлялись автором. Публикация полученных результатов проводилась в соавторстве, доля личного участия пропорциональна числу соавторов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены для обсуждения на научных конференциях: Огаревские чтения в Мордовском государственном университете им. Н.П. Огарева (Саранск, 2010-2012); на научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2010-2012); Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010), Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экология родного края: проблемы и пути их решения» (Киров, 2010), Международной научная конференция «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), 2-м Международном Конгресс-Партнеринг и Выставке по биотехнологии и биоэнергетике «ЕвразияБио-2010» (Москва, 2010), Всероссийской конференции «Проблемы и перспективы изучения естественных и антропогенных экосистем Урала и прилегающих регионов» (Стерлитамак, 2010), международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2012» (Москва, 2012), 7 международной конференции «Проблемы лесной фитопатологии и микологии» (Ульяновск, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 работы, в том числе 4 в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 146 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа включает 50 рисунков и 19 таблиц. Список цитируемой литературы включает 260 источников, в том числе 125 на иностранных языках.
Благодарности. Автор выражает сердечную благодарность за неоценимую помощь, понимание и поддержку на всех этапах работы над диссертацией всем сотрудникам кафедры биотехнологии Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарёва, особенная
благодарность научному руководителю - д.б.н., профессору Ревину В.В. и к.б.н. Ибрагимовой С.А.
Факторы, влияющие на симбиоз микроорганизмов и растений
Интенсивное применение в сельском хозяйстве химических средств защиты растений приводит к загрязнению окружающей среды, нарушению экологического равновесия в природе и появлению резистеЕггных к химическим препаратам форм фитопатогенов (Захаренко В. А. с соавт., 2000; Сухорученко Г. И., 2001; Тютерев С. Л., 2001; Wang S. et al., 2002а, 2002b, 2002с; Rangarajan S. et al., 2003; Lee J. et al., 2003). Альтернативой данным веществам может быть использование биологических объектов. Микроорганизмы, используемые в эюй области, называют биокон-тролирующими агентами (Лещинская 14. Б., 2000; Pal К. et al., 2001; Смирнов О. В. с соавт., 2011). Они эффективны в очень малых концен грациях, и для защиты растений требуется небольшое количество действующего вещества (Barelmana I. et al., 2002; Асабина Е. А., 2009). Интегрированная защита подразумевает не полное подавление вредящего организма за счет проведения предупредительных и истриби-тельных действий, а сдерживания его развития на безопасном для растения уровне. Чаще всего такую защиту стали называть контролем, а при использовании полезных микроорганизмов - биологическим контролем. Биоконтроль имеет как положительные, так и отрицательные стороны (Санин С. С, 2010). Так, к положительным относятся меньшая затратность и экологическая безопасность; а к огрицатель-ным - сравнительно меньшую техническую и хозяйственную эффективность и большую зависимость от условий применения. Также, преимуществами биологической защиты перед химической являются и такие показатели, как избирательность действия и безвредность для позвоночных; возможность длительного существования в природе, сохранение активности в экологическом и эволюционном масштабе действия; меньшая вероятность проявления мутантов, устойчивых к химикатам.
Для биологической защиты растений от бактериальных и грибных болезней, а также для управления биоценозами почв стали использовать штаммы природных микроорганизмов, выделенных из различных видов почвы, в качестве биостимулп-рующих агентов, продлевая тем самым допестицидный период выращивания растений (Hallmann J. et al., 1997; Чекалова К. В., 2004). К таким микроорганизмам чаще всего относятся бактерии p. Bacillus, Pseudomonas, Xantomonas, грибы p. Trichoderma, Gliocladium, Fusarium (Алимова Ф. К., 2005; Мелентьев А. И. , 2007; Четвериков С. П. с соавт, 2009; Смирнов О. В. с соавт., 2010; Tahal М. М. et al., 2010; ХархунЕ. В., 2013).
Выявлены биологически активные штаммы грибов и бактерий-антагонистов, обладающие комплексной активностью (фунгицидной, бактерицидной и немати-цидной) с высокой биологической, хозяйственной и экономической эффективностью в борьбе с комплексом фитопаразитов, включая нематод-вирусоносителей, на разных сельскохозяйственных культурах (Michrina J. et al., 1995; Montesios E. et al., 2002; Монастырский О. А. с соавт., 2009; Perez-Garcia A. et al., 2011).
Наиболее широко изученная и применяемая в области биометода группа -это микроорганизмы, населяющие ризосферу корневой системы и околокорневой зоны (Lodewyckx С. et al., 2002; Park М. et al., 2005; Marchia G. et al., 2009). Совокупность корневой системы с почвой представляет собой сложную экологическую нишу - ризосферу, заселенную полезными, вредными и нейтральными для растений микроорганизмами (Воронин А. М., 1998). Секреция клетками корня различных веществ обеспечивает питательными субстратами микроорганизмы, которые образуют с ним прочные ассоциации как в ризоплане (корневой поверхности), так внутри ризодермы (корневых тканей). При этом ризосферпые бактерии обеспечивают регуляцию роста и развития, а также защиту растений от вредителей за счет обогащения почвы азотом и фосфором, продукции фитогормонов, витаминов, антибиотиков, сидерофоров и других веществ (Ермолова Н. И. с соавт, 1992; Воронин А. М., 1998; Меепа В. et al, 2002; Nelson L., 2004; Saikia R. et al, 2011).
Несмотря на различные способы существования, все микроорганизмы используют несколько одинаковых механизмов для защиты растения и «борьбы» с фитопатогенами (Bloemberg G. V. et al, 2001).
По типу действия микроорганизмов-антагонистов на вредители можно условно разделить их на две группы: 1. прямое воздействие, когда есть место физическому контакту; 2. опосредованное воздействие различными метаболитами (Whipps J. et al., 2001). Также распространены такие механизмы, как конкуренция за экологическую нишу и субстрат (Welbaum G. Е. et al., 2004); антибиоз (Michrina J. et al., 1995); выделение различных ингибирующих веществ; микопаразитизм; обезвреживание и разрушение вирулентных и/или токсичных соединений; вызов системной и локальной устойчивости у растений (Jian-Hua G. et al., 2004; Алимова Ф. К., 2005).
Наиболее перспективными агентами биологического контроля считают бактерии рода Psendomonas (Ермолова Н. И. с соавт., 1992; Меепа В. et al., 2002; Peix A. et al., 2007; Баранова E. В. с соавт., 2011), представляющие собой прямые или слегка изогнутые грамотрицательные песпорообразующие палочки размерами 0,5-1,0x1,5-5,0 мкм. У многих видов после окраски Суданом обнаруживается поли-Р-гидроксибутират, представляющий собой запасной источник углерода (Хоулт Д. и др., 1997).
Известно множество штаммов псевдомопад, подавляющих или сдерживающих рост фитопатогенов. Бактерии рода Pseudomonas обладают целым рядом механизмов ингибирующего действия (Weller D. et al., 2002; Ryu С. et al., 2005; Egamberdieva D. et al., 2011). Флуоресцирующие псевдомопады синтезируют соединения, оказывающие ростостимулирующее действие на растения, либо угнетающие развитие фитопатогеиных грибов (Montesinos Е., 2002; Ramamoorthy V. et al, 2002а; 2002b; Garcia L. et al., 2003; Zehnder G. W. et al., 2001). Стимуляторы роста растений представлены у бактерии данного рода фитогормонами (индолил-3-уксусная кислота (ИУК) и цитокинипы, гиберрелины) (Benizri Е. et al., 2001; Pal К. et al., 2001; Park M. et al., 2005; Raio A. et al., 2011), сидерофорами - низкомолекулярными соединениями, образующими комплекс с ионом Fe3+ и тем самым облегчающими транспорт железа как в микробные клетки, так и в клетки корня (Suzukil S. et al., 2003; Pedraza R. et al., 2004). В данной части литературного обзора более подробно рассмотрим синтез фитогормональных веществ, сидерофоров и антибиотиков.
Способы повышения эффективности предпосевной обработки семян и пути снижения себестоимости биопрепаратов
Определение энергии прорастания и всхожести семян. Наблюдения за ростовыми характеристиками семян злаковых культур проводили по стандартным методикам определения всхожести семян сельскохозяйственных культур (ГОСТ 12038-84, 1986). Энергию прорастания определяли на 3 сутки, а всхожесть - на 7 сутки. Для определения энергии прорастания семена в количестве 100 штук для каждого варианта обработки кратковременно погружали в исследуемые растворы, затем подсушивали и переносили в чашки Петри на фильтровальную бумагу. Важным условием было поддержание влажности зерна, для этого фильтровальную бумагу с семенами периодически смачивали водой. Расход воды 10 мл на 100 семян. Для определения всхожести семена злаков после обработки в количестве 100 штук высаживались в грунт. Семена инкубировали в климатической камере MLR-352 фирмы Sanyo (Япония) при константных условиях температуры, влажности и освещения. В течение 14 суток исследовали количество жизнеспособных клеток на поверхности обработанных семян методом предельных разведений.
Изучение влагоудержпвающей способности семян. Проводили обработку семян БС с добавлением крахмала в концентрации 0,1 % (опыт). Контроль - замачивание в водопроводной воде. Семена подсушивали в течение 24 часов и определяли исходную массу зерен с точностью 0,0001 г на электронных аналитических весах AUX-220 фирмы «Shimadzu» (Япония). На дно лотка размером 12x21 см помещали стекло меньшего размера, обернутое фильтровальной бумагой. Лоток заполняли водопроводной водой ниже уровня высоты стекла. На поверхность фильтровальной бумаги помещали исследуемые семена. В течение 8 часов (с интервалом 2 ч) определяли массу семян. По разнице массы до и после помещения в лоток проводили расчет количества связанной воды.
Изучение степени адгезии бактерии проводили на корнях проростков. Для этого семена пшеницы стерелизовали смесью 70 % этилового спирта в течение 5 мин, трижды промывали стерильной водопроводной водой и раскладывали па КГА в чашки Петри. Семена проращивали в течение 5 сут при 25 С. Полученные корни разрезали на сегменты длиною 1см и по 90 - 100 мг вносили в центрифужные пробирки, содержащие по Змл суспензии бактерии P. aweofaciens. Клетки осаждали при 2000 мин"1 20 мин, трижды отмывали Na-K-фосфатным буфером рН 7.0, ионной силой 0,05. Пробирки, содержащие корни в суспензии бактерий, помещали на качалку и встряхивали со скоростью 130 мин"1 при комнатной температуре (20 ± 2 С). После инкубации с бактериями корни трижды отмывали стерильным физиологическим раствором в течение 2-3 мин, гомогенизировали в ступке и доводили объем физиологическим раствором до 10 мл. Количество прикрепившихся жизнеспособных клеток определяли по численности выросших колоний (КОЕ) на модифицированной пептонно-дрожжевой среде, вышеуказанного состава, в чашках Петри после посева 0,1 мл суспензии из десятикратных разведений и пересчитывали на 1 г сырой массы (Гордиенко А. С. с соавт., 2009).
Для изучения динамики численности P. aureofaciens в ризосфере корней пшеницы бактерии выращивали на жидкой картофелыю-глюкозной среде при 150 мин"1, 28 ± 2 С в течение 24 ч, центрифугировали и осадок суспензировали в физиологическом растворе (0,85 % NaCI). Непосредственно перед посадкой семена замачивали па 5 мин в бактериальной суспензии и затем подсушивали. Обработанные семена помещали на минеральную вату в чашки Петри и выдерживали в климатической камере при 25 С. Для проведения микробиологических анализов через 1, 2 и 4 недели отбирали образцы субстрата с корнями растений. Наличие бактерий в субстрате оценивали на модифицированной пептонно-дрожжевой среде методом Коха.
Полевые исследования.
Ростостпмулирующпе свойства БС P. aureofaciens определяли в полевых условиях на территории опытно-производственного хозяйства «1 Мая» Октябрьского района Республики Мордовия в 2010 - 2012 гг. Исследования проводили на растениях овса (Avena sativa L.) сорта Аллюр, ячменя (Hordeiun vulgare L.) сорта Заозерный 85, яровой пшеницы {Triticum aestivum L.) сорта Тулайковская-10. Сорта районированы и возделываются в средней полосе РФ.
Семена обрабатывали на протравителе СП-10 (Россия, ОАО «Заря») БС P. aureofaciens. В качестве прилипателя использовали 0,1 % раствор крахмала. Контролем служилії семена тех же видов растений без обработки.
Учетная площадь каждой из делянок составляла 2000 м" (повторность 10-кратная); ширина делянки-полосы - 15-16 м, контрольную полосу не выделяли. Посев и обработку производили сплошь по всему полю (Доспехов Б. А., 1979). С начала появления первых всходов и до конца вегетации растений, выборным учетом (40 метровых площадок) у контрольных и опытных растений определяли: - массу корней с использованием электронных аналитических весов AUX-220 фирмы «Shimadzu» (Япония); - объем корневой системы методом Д. А. Сабинина и И. И. Колосова (Лукаткий А.С. с соавт., 2004); - чистую продуктивность фотосинтеза (ЧПФ) по А. Н. Бегешеву (Баславская С. С. с соавт., 1973); - массу 1000 семян в фазу восковой спелости (ГОСТ 12042-80, 1981). Для определения влажности растительных объектов и семян использовали термогравиметрический инфракрасный влагомер МАЗ5 фирмы Satorius AG (Германия).
Для изучения прикорневой микрофлоры злаков опытных и контрольных растений проводили смыв с корней и рассев полученной суспензии на КГА. Инкубирование чашек проводили при 28 ± 2 С в течение 7 дней. Выросшие колонии окрашивали по Граму и микроскопировали с помощью иммерсионной системы три-нокулярного микроскопа МС100 ТХР фирмы Micros (Австрия) при увеличении 10x100.
Определение концентрации белка. Концентрацию белка в культуральной жидкости бактерии определяли по методу Бредфорд (Нетрусов А. И., 2005). В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Для определения концентрации белка отбирали по 0,1 мл культуральпой жидкости, добавляли по 5 мл раствора Coomassie Brilliant Blue G-250, выдерживали 2 мин и измеряли оптическую плотность при 595 нм на спектрофотометре UVmini-1240 фирмы Shimadzu (Япония) против контроля. В качестве контроля использовали 0,1 мл дистиллированной воды, к которой добавляли 5 мл раствора Coomassie Brilliant Blue G-250. Концентрацию белка находили по калибровочной кривой. Определение редуцирующих Сахаров. Редуцирующие сахара определяли феррицианидным методом с использованием феррициаиидного реактива (Егоров Н. С, 2004). Для приготовления реактива 6 г Ыа2СОз растворяли в 500 мл дистиллированной воды, добавляли 0,6 г красной кровяной соли Кз[Те(СМ)б] и доводили до 1 л дистиллированной водой.
КЖ отфильтровывали через бумажный фильтр и центрифугировали 15 мин при 6000 мин"1. 1 мл супернатанта помещали в химическую пробирку, добавляли 3 мл приготовленного феррициаиидного реактива и помещали в кипящую водяную баню на 10 мин. После этого пробу охлаждали и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре UVmini-1240 фирмы Shimadzu (Япония) при X = 400 им. Концентрацию редуцирующих Сахаров находили по калибровочному графику. Для его построения готовили исходный (маточный) раствор глюкозы концентрацией 150 мкг/мл и использовали диапазон концентраций от 20 до 150 мкг/мл. С увеличением концентрации Сахаров интенсивность окраски снижалась.
Определение индол ил-3-уксусной кислоты. Определение содержания индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) проводили колориметрическим методом (Gordon S. A. et al., 1951). Бактерии выращивали в жидкой мелассной среде при 28 ± 2 С. Клетки осаждали центрифугированием при 14000 мин"1 5 минут. К 1 объему супернатанта добавляли 0,5 обьема реактива Сальковского (0,05 М FeCl3 в 35 %-й хлорной кислоте). Оптическую плотность определяли через 1 час при длине волны 540 нм на спектрофотометре UVmini-1240 фирмы Shimadzu (Япония). Определение уровня ИУК в супернатанте проводили с помощью калибровочной кривой, построенной с использованием раствора синтетической ИУК. Для этого готовили раствор ИУК с начальной концентрацией 1 мг/мл в 96 % спирте. Делали серию калибровочных растворов с концентрацией ИУК от 3 до 50 мкг/мл в мелассной среде и реактивом Сальковского. В качестве контроля использовали мелассную среду без добавления ИУК с реактивом Сальковского (Анохина Т. О., 2011).
Изучение феназиновых веществ в бактериальной суспензии. Разделение пигментов проводили методом препаративной тонкослойной хроматографии (Власова Е. П., 2011) через каждые 7 - 10 суток хранения бактериальной суспензии с помощью автосемплера-апликатора Atomatic TLC-Sampler 4 фирмы Camag (Швецария). Пигменты экстрагировали хлороформом, разделение осуществляли с использованием пластинок «Силуфол» 20 х 20 см (Чехия) в системе хлороформ-метанол - 25 % водный раствор аммиака (90 : 25 : 1). Окрашенные соединения анализировали по хроматографической подвижности Rf. Полученные пятна на пластинках собирали для анализа спектров на ИК-Фурье спектрометре IRPrestige-21 фирмы Shimadzu (Япония).
Фитопатогенные грибы
Таким образом, по результатам проделанной работы можно заключить, что исследуемый штамм бактерии P. aureofaciens обладает высокой фунгицидной активностью, степень которой зависит от вида фитопатогена. Данный эффект характерен и для КЖ бактерии и обусловлен действием микробных метаболитов.
Для сравнения фунгицидного действия БС P. aureofaciens с коммерческими препаратами проводилось культивирование фитопатогенов методом блочков (Егоров Н.С., 2004) на КГА. Использовали препараты «Фосфатовит» и «Азотовит». В качестве тест-объектов использовали наиболее распространенные фитопатогены - F. culmorum, A. infectoria и Т. tritici (возбудитель головни злаковых культур). Контроль - среда без внесения бактериальных суспензий. На чашке Петри стерильным шпателем Дригальского растирали по 0,1 мл исследумых суспензий (один вид на чашку), через сутки инкубирования подсевали блочками фитопатогены. Через 10 суток рассчитывали степень ингибирования грибных колоний (%) по формуле Эббота (1).
Полученные результаты показали, что рост грибов в опытных вариантах значительно отличался от контрольного, где мицелий был представлен в виде хорошо разветвленных гиф, заполняющих всю чашку Петри. В опытных вариантах отмечено большое количество бактериальных колоний, сдерживающих рост грибов. Минимальное действие отмечено при использовании биопрепарата «Азотовит» (таблица 3.7).
Процент ингибирования роста грибов при культивировании с бактериальными суспензиями, % Тест-объект Используемый препарат, % КЖ P. aureofaciens «Фосфатовит» «Азотовит» F. culmorum 87,5 89 13,1 A. infectoria 90,4 94,3 58,2 Т. tritici 77,4 51,6 0 Во всех вариантах с тест-объектами получен минимальный процент ингибирования. Так, с Т. tritici чашка Петри полностью заросла грибом, биопрепарат не оказал фунгицидного воздействия (рисунок 3.26). При использовании КЖ бактерии P. aureofaciens и биопрепарата «Фосфатовит» отмечена высокая степень ингибирования. Подавление роста грибов происходило практически в равной степени, однако, в варианте с Т. tritici развитие гриба в присутствие псевдомонад практически отсутствовало. в г а - КЖ P. aureofaciens; б - «Фосфатовит»; в - «Азотовит»; г - контроль.
Таким образом, бактерия P. aureofaciens обладает высоким фунгицидным эффектом наряду с такими микроорганизмами как бациллы, широко используемые в сельскохозяйственной практике (Монастырский О. А. с соавт., 2009; Perez-Garcia A. et al., 2011; Максимов И. В. с соавт., 2011), и превышает действие микроорганизмов рода Azotobacter. Необходимо также подчеркнуть, что бактерия Р. aureofaciens в составе КЖ, полученной на мелассной среде, обладала выраженным фунгицидным эффектом против широкого спектра фитопатогенных грибов, причем данное свойство отмечено и при отделении бактериальных клеток от КЖ. В условиях глубинного культивирования показан лизис грибного мицелия на множественных его участках. Одними из важных метаболитов, обеспечивающих фунгицидный эффект бактерий, являются антибиотики и ферменты (Zhang Z. et al., 2001; Nielsen Т. 1-І. et al., 2002; Morello J. E. et al., 2004; Price-Whelan A. et al., 2006; Validov S. Z. et al., 2010). Поэтому па следующем этапе работы мы исследовали супернатант КЖ P. aureofaciens на наличие антибиотиков и гидролитических ферментов. Основная роль в мшсопаразитическом воздействии отводится веществам антибиотической природы (Логинов О. Н., 2005; Raio A. et al., 2011; Puopolo G. et al., 2013). Чтобы достоверно оценить антагонистическую способность необходимо установить способность культуры к образованию антибиотических веществ и образованию более активных сидерофоров, чем у фитопатогенпых грибов, что позволят культуре конкурировать по субстрату.
Наличие антибиотических веществ в КЖ P. aureofaciens определяли методом тонкослойной хроматографии. Опыты проводили в отцентрифугированной КЖ на 3, 5, 10 и 14-е сутки хранения. Полученные результаты приведены в таблице 3.8.
Хроматографическая подвижность феназиновых веществ. Время хранения КЖ, сутки Rfx 100 Структура 3 30 2-гидроксифеназин-1-карбоновая кислота 5 15 30 Феназин-1-карбоновая кислота 2-гидроксифеназин-1 -карбоновая кислота 10 51 2-гидроксифеназин 14 14 28 46 Феназин-1 -карбоновая кислота 2-гидроксифеназин-1 -карбоновая кислота 2-гидроксифеназин
Через 3-е суток хранения в КЖ был обнаружео антибиотик феназинового ряда 2-гидроксифеназин-1-карбоновая кислота (Rf 30). С увеличением сроков хранения число антибиотических веществ увеличилось, так на 5-е сутки дополнительно обнаружена феназин-1-карбоновая кислота. На 10-е сутки хранения выявлен только 2-гидроксифеназин, но уже на 14-е сутки - все три антибиотических вещества (рисунок 3.27). 2-гидроксифе назин-1 -каобоновая кислота С 3 сутки сутки сутки сутки
Таким образом, в процессе хранения КЖ P. aureofaciens отмечено наличие антибиотиков феназинового ряда, состав которых не постоянен, что возможно, связано с их взаимным превращением друг в друга. ИК-спектроскопия выделенных веществ показала определенную зависимость наличия в них определенных группировок (рисунок 3.28 а, б, в).
Сравнительный анализ ИК спектров этих соединений показал, что они практически идентичны. Во всех случаях была обнаружена полоса поглощения в области 3000 - 3700 см"1, характеризующая валентные колебания гидроксильных групп, включенных в водородную связь; в области проявления колебаний С-0 связей 1100 - 1200 см" наблюдается широкая интенсивная полоса с максимумами 1080 и 1150 см" , относящаяся к различным спиртовым и эфирным группировкам (Сильвер-стейн Р. с соавт., 1977; Коваленко В.И. с соавт., 2003).
Оптимизация среды на основе мелассы для культивирования Pseudomonas aureofaciens
По мере прохождения онтогенеза стимулирующий эффект КЖ псевдомонад на продуктивность фотосинтеза снижался; показатели опытного варианта в этом случае были выше контроля на 9 %. Возможно, это объясняется тем, что в этот период происходит перераспределение питательных веществ в связи с наступлением процессов гаме-тогенеза. У ячменя была отмечена иная картина: на более ранних этапах развития растений ЧПФ увеличилась по сравнению с контрольным вариантом в среднем на 6 %. В фазе колошения фотосинтетическая продуктивность продолжала расти; ее прирост по сравнению с контролем составил 10 %.
У опытных растений яровой пшеницы ЧПФ также увеличилась, но в меньшей степени, чем у выше описанных культур (на 2-3 % по сравнению с контролем в период начала стеблевания и на 4,5 % в фазе колошения).
Важный параметр характеристики развития растений является их урожайность. Поэтому в фазу восковой спелости с каждой учетной делянки определяли биологический урожай по массе 1000 семян. Полученные результаты показали, что предпосевная обработка семян БС P. aureofaciens способствовала увеличению биологического урожая по сравнению с контролем на 9 у овса, 23 - ячменя и 6 % - яровой пшеницы (рисунок
Несмотря на то, что самые высокие показатели прироста объема и массы корневой системы были зафиксировали у растений овса, наибольшие значения биологического урожая отмечены у растений ячменя. Предположительно в этом случае существует определенная корреляция между массой семян и чистой продуктивностью фотосинтеза, которая продолжала увеличиваться у этого вида растений по мере их развития.
На основании проведенного исследования в хозяйстве ОАО «Племенной завод «Александровский» был получен акт, подтверждающий эффективность действия БС P. aureofaciens на урожайность растений ячменя в условиях открытого грунта, согласно которому показатель опытного участка превосходил контроль на 3 ц/га (приложение 3).
Таким образом, установлено, что под влиянием БС P. aureofaciens, используемой для предпосевной обработки семян, стимулируется развитие корневой системы, происходит оздоровление прикорневой микрофлоры, увеличивается прирост ЧПФ и биологического урожая у растений овса, ячменя и яровой пшеницы.
При исследовании биопрепаратов одной из задач является изучение механизмов их действия. Согласно литературным данным бактерии рода Pseudomonas характеризуются синтезом веществ фитогормональной природы, в частности ИУК, которая способствует развитию корневой системы (Мордухова Е. Л. с соавт., 1991; 1998; Олюнина Л.Н. с соавт., 1996; Pedraza R. et al., 2004). Известно, что максимальное количество ИУК бактерии образуют в стационарную фазу роста (Моргун В.В. с соавт., 2009). Уровень ИУК в супернатанте КЖ P. aureofaciens, хранившейся в течение 28-ми суток, определяли с помощью реактива Сальковского спектрофотометрическим методом. Данные представлены на рисунке 3.46.
Анализируя результаты, можно отметить, что в фазе активного роста бактерии (24 - 48 ч) содержание ИУК в центрифугате КЖ минимально. В дальнейшем зафиксировано волнообразное изменение концентрации ИУК с образованием двух пиков. Первый максимум отмечен на 12-е сутки хранения КЖ, второй - на 19-е сутки (0,38 мкг/мл). Оба максимума имели равные значения и были непродолжительными во времени. Определение титра в культуральной жидкости на данный период показал наличие большого количества клеток (109 КОЕ/мл). При увеличении сроков хранения наблюдалось снижение концентрации ИУК в среднем на 54 %. С 22-х по 30-е сутки хранения КЖ уровень ИУК оставался на постоянном уровне. Образование двух пиков может быть связано с некоторым отмиранием культуры к 12-м суткам, разложению внутри- и внеклеточных белковых веществ до предшественника ИУК - триптофана и последующим его превращением в фитогормон. Способность ряда бактерий к синтезу ИУК в фазе замедления роста установлена ранее (Олюнина Л. Н. с соавт., 1996). В данном случае причина наличия двух пиков может быть связана с замедлением роста бактерии и лимитированием питательных субстратов. На наш взгляд выделение ИУК бактериями в неблагоприятных условиях может иметь большое значение для сохранения ростостимулирующих свойств БС, что позволит использовать ее для обработки семян растений в течение длительного периода хранения.
На основании полученных данных оптимизированы условия получения биопрепарата в виде концентрата культуральной жидкости методом глубинного культивирования на оптимизированной мелассной среде. Стандартная технология получения препарата методом глубинного культивирования представлена на рисунке 3.47. С помощью дозаторов 1 и 2 компоненты сред поступают в биореакторы 4 и 5. Полученные среды доводятся слабыми растворами кислоты или щелочи до значения рН 7,0. Подготовленные для культивирования среды стерилизуют острым паром из, парогенератора 8, затем в рубашку ферментеров подается холодная вода для охлаждения до температуры 28 ± 2С. Оба ферментера снабжены мешалкой и рубашкой для поддержания постоянной температуры ферментации 28 ± 2С. Готовый препарат 1- дозатор компонентов для приготовления среды для инокулята; 2 - дозатор компонентов для приготовления мелассной среды; 3 - исходная культура на скошенном питательном агаре; 4 - ферментер для получения инокулята; 5 - ферментер для получения биопрепарата; 6 - парогенератор; 7 - сборник КЖ
В биореактор 4 стерильно вносится посевной материал 3, культивирование продолжается в течение 19 - 24 ч, после чего полученный инокулят передается в биореактор 5 из расчета 10% от объема засеваемой среды. После достижения стационарной фазы роста КЖ выводится из нижней части ферментера и поступает в емкость для сбора КЖ 7. В лабораторных условиях определяют титр полученного препарата, который должен составлянь не менее 10 КОЕ/мл. Затем биопрепарат поступает на линию упаковки в емкости объемом 50 - 1000 мл. Упакованный препарат хранится в сухом темном помещении при температуре 4 ± 2С. В таблице 3.16 приведен предварительный расчет текущих затрат для получения биопрепарата.
