Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1. Основные задачи и принципы промышленного культиви рования микроорганизмов
1.1.1. Методы культивирования микроорганизмов 11
1.1.2. Производственные питательные среды и требования, предъявляемые к ним
1.2. Питательные потребности микроорганизмов 23
1.3. Культивирование и микробиологический контроль отдельных вакцинных штаммов микроорганизмов
1.3.1. Питательные потребности чумного микроба 33
1.3.2. Питательные потребности лептоспир и листерий 36
1.4. Оптимизация питательных сред 40
Глава II. Материалы и методы исследований 50
2.1. Лабораторное и производственное оборудование, питательные среды, растворы, реактивы
2.2. Лабораторные животные, используемые в опытах 51
2.3. Исследование препарата «ЭСРМ» на безвредность 52
2.4. Исследование биологической активности препарата «ЭСРМ»
2.5. Контроль стерильности препарата «ЭСРМ» 53
2.6. Исследование химического состава препарата «ЭСРМ» 53
2.7. Характеристика штаммов микроорганизмов, использованных в работе, и изучение биологических свойств препара- 54 та «ЭСРМ»
2.8. Метод электронной микроскопии 61
2.9. Статистическая обработка результатов исследований 63
Глава III. Технология приготовления препарата «ЭСРМ» и его характеристика
3.1. Технология приготовления препарата «ЭСРМ» 67
3.2. Результаты отработки оптимального метода стерилизации ЭСРМ»
3.3. Некоторые показатели химического состава «ЭСРМ» 81
Глава IV. Изучение стимулирующего действия препарата «ЭСРМ» на рост некоторых вакцинных штаммов микроорганизмов..
4.1. Влияние препарата «ЭСРМ» на биологические свойства Listeria monocytogenes
4.2. Влияние препарата «ЭСРМ» на биологические свойства
* Leptospira interrogans
4.3. Влияние препарата «ЭСРМ» на биологические свойства 10fi
Yersinia pestis
Заключение 117
Выводы 129
Практические предложения 131
Список литературы 132
Приложения 162
- Основные задачи и принципы промышленного культиви рования микроорганизмов
- Лабораторное и производственное оборудование, питательные среды, растворы, реактивы
- Технология приготовления препарата «ЭСРМ»
Введение к работе
Актуальность. Одним из главных принципов промышленной биотехнологии, использующей в качестве биологических объектов микроорганизмы, является их культивирование на любом из производственных этапов, от поддержания штаммов до получения биомассы микроорганизмов в количестве, достаточном для обеспечения эффективности производства.
Основным условием для успешного культивирования, обеспечивающего максимальное накопление биомассы и поддержания активности штаммов, является подбор питательных сред в соответствии с питательными и другими физиологическими потребностями микроорганизма (Малахов Ю.А., Панин А.Н., Соболева Г.Л., 2000; Прозоркина Н.В., Рубашки-на Л.А., 2002; Ellinghausen Н., Faine S., 1982).
Большинством специалистов для подавляющей массы производственных микроорганизмов лучшими признаны питательные среды из естественного сырья: препараты крови, казеин, мясные гидролизаты, экстракты растительного и животного происхождения (Коротеева Л.А., Шишов В.П., Маслак А.А., 2001; Меджидов М.М., 2003; Faine S., 1982). Однако практика показывает, что многие предприятия биологической промышленности, традиционно использующие среды из такого сырья, часто испытывают серьезные затруднения, связанные со снижением объема наращиваемой бактериальной массы, необходимой для производства препаратов.
Не исключено, что проблема снижения стандартности питательных сред, важность которой подчеркивается многими исследователями (Зелют-ков Ю.Г., Зайцев В.И., 1997; Геладзе В.Ш. и др., 1998; Овсова Л.М. и со-авт., 2003), обусловлена, прежде всего, снижением качества продуктов природного происхождения в связи со сложной экологической обстановкой и антропогенным воздействием на окружающую среду. В частности, в мясных продуктах могут содержаться антибиотики, химикаты, нитраты, токсические продукты, что отрицательно отражается на культивировании
промышленных штаммов (Рябов В., Генкель В., Волкова Н., 1996; Wa-guespack М., 1986; Corrigan P.J., Seneviratna P., 1989).
Для повышения качества сред в их состав добавляют различные биологически активные вещества, нивелирующие отрицательные воздействия и стимулирующие биологические свойства микроорганизмов. В некоторые среды добавляют такие питательные добавки, как казеиново-дрожжевой экстракт, экстракт кормовых дрожжей, сыворотку крови животных, углеводы, пептон, желатин и другие компоненты, выступающие в роли дополнительных источников ростовых веществ (Бузолева Л.С., 2001; Гариб Ф.Ю., 2002; Саяпина Л.В., 2002; Brubaker R.R., Surgalla M.S., 1964). В отличие от питательных добавок микроэлементы, витамины, аминокислоты добавляют к питательным средам в минимальных количествах. Подобные биологически активные вещества в таких количествах не являются питательными компонентами, а выполняют роль активаторов роста или катализаторов (Никитина В.А., Бобрышев В.И., Кафизова Ф.И., 1979; Macfarlane D.E., Elian-Jones Т.Е., 1980), участвующих в сложнейших биохимических реакциях.
Однако все питательные добавки и стимуляторы роста обладают селективным действием по отношению к большинству микроорганизмов, а при избыточном добавлении некоторых из них отмечается даже эффект ингибирования ростовых свойств микробов (Брильков А.В., Печуркин Н.С., 1990; Глазунов А.В., Аргунов СВ., Капульцевич Ю.Г., 1993; Gadgii M.D., 1967). Хороший стимулирующий эффект с возможностью использования для широкого перечня микробов при их культивировании может обеспечиваться при использовании питательных смесей, сочетающих различные ростостимулирующие компоненты (Мейнелл Дж., Мейнелл Э., 1967).
В связи с вышеизложенным, изыскание наиболее универсальных стимуляторов роста и размножения микроорганизмов, которые можно ис-
пользовать для совершенствования традиционных питательных сред при выращивании большинства микробов, остается актуальной задачей.
Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилась разработка на основе эмбриональных и внезародышевых тканей куриного яйца нового стимулятора роста микроорганизмов (ЭСРМ), изучение его влияния на их биологические свойства и ростостимулирующего эффекта на некоторые вакцинные штаммы.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи.
Изыскать оптимальные и рациональные биотехнологические приемы, способствующие накоплению и сохранению в препарате «ЭСРМ» оптимального набора и соотношения биологически активных веществ, обеспечивающих ростостимулирующую активность микроорганизмов.
Отработать методы стерилизации, обеспечивающие 100% стерильность и максимальную сохранность всех компонентов «ЭСРМ».
Исследовать стимулирующее действие препарата на жизнеспособность Listeria monocytogenes, Leptospira interrogans, Yersinia pestis.
Определить опытным путём минимальную и оптимальную дозы стимулятора роста в зависимости от тестового микроорганизма и среды, используемой для его выращивания.
Изучить влияние «ЭСРМ» на морфологические, тинкториаль-ные и культуральные свойства тестовых микроорганизмов, выращенных на питательных средах с использованием «ЭСРМ».
Изучить химический состав препарата «ЭСРМ».
Исследовать возможность использования препарата в составе питательных сред для получения биомассы микроорганизмов в производственных целях, с последующим изучением изготовленных биопрепаратов по основным показателям согласно нормативной документации (НД).
Научная новизна. Разработан и экспериментально апробирован но-. вый тканевой биологически активный препарат, обладающий стимули-
рующими свойствами на рост микроорганизмов, изготовленный по оригинальной технологии из инкубированного куриного яйца.
Впервые изучено и обнаружено стимулирующее действие препарата на рост чумного микроба, листерий, лептоспир и отработаны оптимальные дозы стимулятора роста для тестовых микроорганизмов при их культивировании на разных жидких и плотных питательных средах.
Установлено, что препарат «ЭСРМ» при добавлении в питательные среды не изменяет морфологические, тинкториальные, культуральные свойства культивируемых микроорганизмов.
Проведены исследования экспериментальных серий вакцин против лептоспироза и чумы, изготовленных из бактериальной массы, выращенной на питательной среде с использованием стимулятора роста микроорганизмов «ЭСРМ» в соответствие нормативной документацией. Установлено, что изготовленные экспериментальные серии вакцин отвечают всем требованиям НД по изготовлению вакцин против лептоспироза и чумы.
Приоритетность выполненных исследований подтверждена уведомлением о положительном результате формальной экспертизы на изобретение, заявка от 24.05.2004, № 2004115830/13 (016861).
Теоретическая и практическая значимость. На основании проведенных исследований по приготовлению и испытанию препарата «ЭСРМ» разработана и утверждена техническая документация (Технические условия). Научные разработки используются в работе ФГУЗ Ставропольского научно-исследовательского противочумного института и ФГУП «Ставропольская биофабрика». Получены положительные результаты по эффективному применению препарата «ЭСРМ» в качестве стимулятора роста микроорганизмов. Результаты исследований используются в учебном процессе медико-биолого-химического факультета Ставропольского ГУ, Воронежского ГАУ им. К.Д. Глинки, Кабардино-Балкарской ГСХА, Пятигорской ГФА, Ставропольском филиале МГОПУ им. М.А. Шолохова в каче-
стве дополнений к учебным материалам по дисциплинам «Микробиология» и «Биотехнология».
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
доложены и обсуждены на межрегиональной научно-практической конфе
ренции «Приоритеты культуры и экологии в образовании» (апрель 2003 г.,
филиал МГОПУ им. М.А. Шолохова, г. Ставрополь); межрегиональной
научной конференции «Студенческая наука - экономике России» (апрель
2003 г., Сев.-Кав. ГТУ, г. Ставрополь); межрегиональной научной конфе
ренции «Проблемы развития биологии и экологии на Северном Кавказе»
(апрель 2004 г., Ставропольский ГУ); межрегиональной научно-
практической конференции «Образование, здоровье и культура в начале
XXI века» (апрель 2004 г., филиал МГОПУ им. М.А. Шолохова, г. Ставро
поль); межрегиональной научной конференции «Проблемы развития био
логии и экологии на Северном Кавказе» (апрель 2005 г., Ставропольский
ГУ); Всероссийской студенческой конференции «Актуальные проблемы
і современной биологии» (апрель 2005 г., г. Астрахань); Международной
научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и образования» (март 2005 г., Самарская ГСХА); научных чтениях, посвященных 200-летию Московского общества испытателей природы «Биотехнология, экология, охрана окружающей среды (Московский ГУ им. М.В. Ломоносова, 2005); I ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН (апрель 2005 г., г. Ростов-на-Дону.).
Препарат был представлен на Всероссийской выставке-ярмарке научно-исследовательских работ и инновационной деятельности студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений РФ «ИННОВ-2003», «ИННОВ-2005» (2003, 2005 гг. ЮРГТУ, г. Новочеркасск), IV-V Московском международном салоне инноваций и инвестиций (г. Москва, 2004, 2005 гг.) и награжден 5 дипломами и 5 серебряными медалями.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 10 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 рисунками, 10 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и приложений. Список использованной литературы содержит 259 источников, в том числе - 45 зарубежных авторов.
Положения, выносимые на защиту:
Технология приготовления стимулятора роста микроорганизмов «ЭСРМ».
Результаты исследования стимулирующего влияния полученного препарата «ЭСРМ» на жизнеспособность тестовых микроорганизмов и его оптимальные дозы.
3. Результаты влияния «ЭСРМ» на морфологические, тинкториаль-
t ные, культуральные и антигенные свойства исследуемых микроорганиз
мов.
4. Результаты производственной апробации препарата «ЭСРМ» в ка
честве стимулятора роста в биотехнологическом цикле вакцины полива
лентной «ВГНКИ» против лептоспироза животных и вакцины чумной жи
вой сухой из штамма ЕВ.
Основные задачи и принципы промышленного культиви рования микроорганизмов
Глубинный способ культивирования в биопромышленности является основным при производстве большинства биопрепаратов. Он осуществляется, как правило, в реакторах (ферментерах) большой емкости (Рубан Е.А., 1995; Тутов И.К., Ситьков В.И., 1997; Ярцев М.Я., и др., 1998; Карпов А.А., 2004; Теппер Е.З. и др., 2004). В настоящее время в промышленных условиях для выращивания микроорганизмов используют реакторы усовершенствованных конструкций. Они оснащены термостатирующими устройствами, механическими мешалками, с магнитожидкостными уплотнителями, сифонами, воздушными фильтрами и системой трубопроводов, обеспечивающих надежную стерильность, подачу и отвод воздуха, воды и пара (Субботин В.В., Кестельман В.Н., Веселов А.И., 1970; Рубан Е.А., 1996; Тутов И.К., Кравцов В.А., Каменский Н.И., 1996; Ярцев М.Я. и др., 1998; Конопаткин А.А., 2001; Achorn G.B., Schwab J.L., 1948).
При глубинном выращивании микроорганизмов их культуры могут находиться в периодических или «закрытых» и хемостатных (непрерывных) — «открытых»— системах.
«Закрытой» называют такую систему (культуру), когда хотя бы один из компонентов питательной среды или она вся не может ни поступать в систему, ни покидать ее. В такой системе скорость роста микроорганизмов должна после ускорения стремиться к нулю из-за недостатка субстрата или из-за гибели микробных клеток вследствие накопления ими продуктов метаболизма. Следовательно, периодические культуры микроорганизмов находятся в неустойчивом состоянии (Бирюков В.В., Кантере В.М., 1985; Боринских И.И., Оборин Г.А., Сычев Д.И., 1988; Ануфриев В.В., Жерегеля B.C., Суханова Н.В., 1997; Озеренко О.А., 2004).
Открытая система - это система, когда все питательные компоненты могут поступать в реактор, в котором выращивается тот или иной микроорганизм, и удаляться из реактора в виде продуктов синтеза микроорганизмов (антибиотики, витамины, ферменты и т.д.) или биомассы самих микроорганизмов. При этом скорость поступления питательной среды в реактор и удаление из него продуктов синтеза или биомассы можно регулировать в нужной нам фазе размножения микроорганизмов (Непрерывное культивирование микроорганизмов. М., 1968; Ярцев М.Я. и др., 1998; Ярцев М.Я., 2000).
В периодическом состоянии динамика роста и размножения микроорганизмов в жидкой питательной среде обладает рядом особенностей, общих для бактерий, актиномицетов, микроскопических грибов, мико-плазм и других прокариотных и эукариотных микроорганизмов. При индивидуальном развитии им свойственна высокая скорость размножения. Оно происходит в виде последовательных фаз. Фазы роста микроорганизма отражают количественные и качественные изменения в их биомассе и окружающей среде. В простой гомогенной периодической культуре микроорганизмов разные авторы различают от 4 до 8, и даже до 16 фаз.
Каждая фаза является суммированным выражением размножения и отмирания клеток в микробной популяции. Причинами отмирания микробной популяции являются истощение среды и накопление в ней большого количества токсических продуктов метаболизма. В период стадии отмирания общее количество биомассы уменьшается, что чаще всего происходит за счет автолиза. Продолжительность стадии отмирания у различных микроорганизмов не одинакова. В этот период в культуре находят значительные изменения клеток. Появляются инволюционные формы. Клетки плохо прокрашиваются, у них изменяются биохимическая и антигенная активность (Прозоркина Н.В., Радчук Н.А., 1991; Воробьев А.А. и др., 1998; Субботин В.В., Майский В.Г., 2000; Конопаткин А.А., 2001; Ру-башкина Л.А., 2002).
Развитие хемостатного культивирования открыло возможность управлять процессом, контролируя рост и поведение микроорганизмов, а при необходимости — вмешиваться в этот процесс, изменяя скорость роста до задаваемых пределов путем воздействия на такую культуру внешними факторами (Непрерывное культивирование микроорганизмов. М., 1968; Руководство по микробиол. диагностике инфекц. болезней. М., 1973; Бас-накьян И.А., 1982; Дрю С, 1983; Баснакьян И.А., 1992; Рубан Е.А., 1995; Тутов; И. К., Ситьков В.И., 1997; Ярцев М.Я. и др., 1998; Ярцев М.Я., 2000; Hemert Р., 1974; Vrana D. et all, 1982).
Способ выращивания микроорганизмов на поверхности плотных питательных сред называется поверхностным культивированием. Выращивание микробов на плотных питательных средах в бактериологических лабораториях различного направления является одним из основных методов изучения свойств микроорганизмов (Карклинь Р.Я., 1983; Дьяконов Л.П.,
Глухов В.Ф., Дьяконов Л.П., 1996; Воробьев А.А., 1998; Равилов А.З., Гильмутдинов Р.Я., Хусаинов М.Ш., 1999).
Лабораторное и производственное оборудование, питательные среды, растворы, реактивы
Лабораторное и производственное оборудование: микроскоп «Био-лам» Р-11; микроскоп «Микромед»; конденсор темного поля; осветитель с точечной лампой типа ОЙ-19; сублимационная установка LZ-45.27 и ТГ-5; центрифуги ОПН-8 и Т-23 (Германия); электронные весы ВАКТ-500 (Россия); холодильники производственные и бытовые; инкубатор бытовой ИПХ-10; полупроводниковый низкочастотный лазерный аппарат АЛ-01 «Семикон»; прибор контроля качества яиц ПКЯ-10; аминолизатор ААА-332Т производства Чехословакии; размельчитель тканей РТ-1; суховоз-душный шкаф ТС-80; шкафы сухожаровые КВС G-100/250; фильтрующие элементы; оптические стандарты мутности с концентрацией 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 млрд. микробных клеток в 1 мл, изготовленные ГИСК им. Л.А. Та-расевича; пробирки стеклянные; флаконы вместимостью 0,1; 0,2; 0,5 л; колбы емкостью 0,5-1,0 л; цилиндры мерные; пипетки мерные стеклянные 0,1-50,0 мл; пипетки пастеровские; бактериологические петли; спиртовые горелки; пластины с лунками для постановки РМА; чашки Петри; стекла предметные и покровные.
Фотографирование мазков, окрашенных по Граму, осуществляли при помощи компьютерного комплекса визуализации изображения на базе микроскопа «Микмед-2» и цифровой фотокамеры «Olympus-5060».
Питательные основы и среды: мясопептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), мясопептонно-печеночный бульон (МППБ), агар Сабуро, водно-сывороточныя среда, агар Дифко, агар и бульон Хоттинге-ра, дрожжевой агар, среда для определения подвижности листерий производства «HiMedia Laboratories Pvt. Ltd (Индия).
Растворы и реактивы: забуференный физиологический раствор (рН 7,2), 3% перекись водорода, фуксин основной, генцианвиолет, фуксин Пфейффера, раствор Люголя, спирт этиловый, масло иммерсионое, раствор глюкозы, пептон, желатина, хлорид натрия, дистиллированная вода, натрий фосфорнокислый двузамещенный, натрий сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, спирт 70, метилвиолет, сернистокис-лый натрий, натрия хлорид.
Лабораторные животные, используемые в опытах
В работе были использованы самцы и самки белых мышей (п=60), массой 18-20 г, белых крыс (п=20), массой 200-240 г, морских свинок (п= 18), массой 350-400 г, кроликов породы «шиншилла» (п=36), массой 2,5-3,5 кг. Животных получали из питомника Ставропольского научно-исследовательского противочумного института и вивария ФГУП Ставропольская биофабрика. В процессе содержания животных поддерживали рекомендуемый режим питания согласно приказу № 1179 (М., 1983).
Все процедуры на экспериментальных животных, включая эвтаназию, проводили согласно методических рекомендаций (Карпенко В.В., СачковаВ.И., 1985; Куфулина С.А., Павлова Т.Н., 1985).
Исследование препарата «ЭСРМ» на безвредность
Исследование на безвредность препарата при его подкожном введении проводили путем определения острой токсичности, предусматривающее изучение симптомокомплекса отравления, общей и местной реакции, по характеру влияния на организм лабораторных животных при поступлении препарата в различных дозах (Метод, указания по технологической оценке новых препаратов для лечения и профилактики незаразных болезней животных от 29 января 1987 года Главного управления ветеринарии). Для проведения испытаний использовали животных двух видов: белых крыс и кроликов, из которых были сформированы опытная и контрольная группы. Опытной группе крыс и кроликов препарат вводили подкожно в дозе 1 мл/кг живой массы тела однократно. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор в той же дозе.
Технология приготовления препарата «ЭСРМ»
Основой для обеспечения вышеизложенных требований, предъявляемых нами к разрабатываемому стимулятору роста микроорганизмов в соответствии с качественными, количественными и техническими характеристиками, является перечень технологических манипуляций, определяющих технологический цикл.
Основные технологические манипуляции переработки исходного субстрата направлены на:
- сохранение и увеличение концентрации большинства химических и биологических компонентов яйца и эмбриона, в соответствие с питатель ными и другими физиологическими (дыхание, размножение, рост) потреб ностями микроорганизма;
- повышение активности имеющихся биологически активных ве ществ и дополнительное выделение и накопление в субстрате в свободном состоянии веществ, обладающих ростостимулирующими или катализи рующими свойствами в минимальных дозировках (биогенных стимулято ров, широкого спектра свободных аминокислот, липидов, пептидных био регуляторов клеточного метаболизма - низкомолекулярных пептидов, в том числе цитаминов, цитокинов, микро - и макроэлементов и других).
Наиболее рациональным технологическим приемом, который способен максимально обеспечить вышеуказанные требования, является, по нашему мнению, методика получения тканевых препаратов по В.П. Фил атову (1946), взятая нами в качестве базовой и модифицированная в соответствии с промежуточными задачами для обеспечения требований, предъявляемых к разрабатываемому препарату.
В качестве прототипа, подтверждающего это, нами был избран «СТЭМБ» (Ржепаковский И.В., 2003), используемый для биологической стимуляции физиологических показателей организма животных. Однако, он имел ряд недостатков в технологии, которые не позволяли использовать его в качестве стимулятора роста микроорганизмов. Например, входящий в состав препарата формалин, использованный для стабилизации и консервации иммуномодулятора.
В связи с этим, первая модификация нового препарата представляла собой нестабилизированный полуфабрикат препарата «СТЭМБ» (без добавления формалина), который был апробирован на предварительном этапе работы. Это позволило установить основные положительные стороны и недостатки отдельных технологических приемов, наметить и реализовать пути их поэтапного устранения (технологическое обоснование отдельных этапов представлено ниже), что обеспечило получение принципиально нового препарата, обладающего свойствами стимулятора роста микроорганизмов.
Для удобства в процессе работы весь технологический цикл получения препарата разделили на три основных стадии (подготовительную, основную и заключительную). Целесообразность этапов работ, предусмотренных на каждой стадии, отрабатывали в процессе эксперимента в соответствие с промежуточными технологическими задачами и спецификой основных технологических манипуляций.
Подготовительная стадия состояла из 4 этапов и заключалась в обработке сырья.
1. На первом этапе приготовления препарата проводили отбор куриных яиц из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Яйца брали среднего размера, правильной формы, без трещин, насечек, известковых наростов и загрязнения скорлупы. Многочисленными исследованиями доказано, что длительное хранение ведет к ухудшению качества инкубационных яиц (Третьяков Н.П., Крок Г.С., 1968). Для закладки в инкубатор мы использовали только свежие яйца.
2. На втором этапе проводили непосредственную закладку куриных яиц в инкубатор бытовой ИПХ-10 с температурным режимом 37,6-37,8С. Основной целью этого этапа являлось получение высокоактивного яично-эмбрионального субстрата, используемого для дальнейшей обработки по методу В.П. Филатова в нашей модификации. Повышение биологической активности яично-эмбриональной массы достигали путем облучения яиц на 5, 6, 7, 8 сутки инкубации. В работе использовали полупроводниковый низкочастотный лазерный аппарат АЛ-01 «Семикон», который применяется в медицине. Низкоинтенсивное лазерное излучение при действии на биоткани вызывает широкий спектр фотофизических и фотохимических изменений, результатом чего является интенсификация структурно-метаболических процессов, не связанных с нарушением целостности зон облучения. Воздействие лазерного излучения вызывает различные реакции организма, например, обнаруживаются конфармационные перестройки в мембранах, увеличивается содержание щелочной фосфатазы, иммуноглобулинов G- и Т-лимфоцитов в крови, отмечается увеличение окислительно-восстановительного потенциала, повышение фагоцитарной активности лейкоцитов и фибринолитической активности крови, выявляется повышение митотического индекса. Поглощение лазерного излучения компонентами дыхательной цепи в клетке приводит к увеличению наработки в митохондриях АТФ, а это в свою очередь, ведет к подъему биоэнергетического статуса клетки и организма, используемого для построения определенных структур и активации работы трансмембранных каналов (Козлов В.И., Буйлин В.А., Самойлов Н.Г., Марков И.И., 1993).
