Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Открытие Erysipelothrix rhusiopathiae 10
2.2. Распространение рожи свиней 10
2.3. Систематическое положение 11
2.4. Строение микробных клеток Erysipelothrix rhusiopathiae 11
2.5. Характеристика возбудителя 13
2.5.1. Морфологические и тинкториальные свойства 13
2.5.2. Культуральные свойства 14
2.5.3. Биохимические свойства 15
2.5.4. Антигенная структура 15
2.5.5. Устойчивость 16
2.6. Активность и специфичность шаммов возбудителя рожи свиней 17
2.7. Серологическая классификация бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae 20
2.8. Эпизоотические данные 26
2.9. Клинические признаки 27
2.10. Диагностики 28
2.10.1 Прижизненная диагностика 28
2.10.2 Посмертная диагностика 31
2.11. Иммунитет 33
2.11.1. Вакцины 33
2.11.2. Гипернммуная противорожистая сыворотка 36
2.12. Заключение по литературному обзору 37
3. Собственные исследования 40
3.1. Материалы 40
3.2. Методы 42
4. Результаты собственных исследований 47
4.1. Выделение и изучение фракционного состава белковых экстрактов клеток бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2 47
4.1.1. Получение и изучение фракционного состава ультразвукового гомогената бактерий рожи свиней 48
4.1.2. Получение и изучение фракционного состава щелочного гидролизата бактерий рожи свиней 54
4.1.3. Получение и изучение фракционного состава автолизата бактерий рожи свиней 57
4.1.4. Получение и изучение фракционного состава термоэкстракта бактерий рожи свиней 60
4.1.5. Анализ результатов получения и изучения фракционного состава белковых экстрактов и белков бактерий рожи свиней 62
4.2. Изучение серологической активности белковых экстрактов и выделенных белков в РА, РДП и ИФА 65
4.2.1 Исследование контрольных антиэризипелотриксных сывороток в реакции агглютинации 65
4.2..2. Изучение серологической активности белковых экстрактов и белков в реакции диффузионной преципитации (РДП) 67
4.2..3. Изучение серологической активности выделенных белков в иммуноферментном анализе (ИФА) 72
4.2.4. Определение антител в антиэризипелотриксных сыворотках в ИФА с использованием белков бактерий рожи 75
4.3. Получение гипериммунных сывороток мыши и изучение их активности и специфичности в серологических реакциях 77
4.3.1. Схема иммунизации и обработка сывороток 77
4.3.2. Изучение активности и специфичности гипериммунных сывороток мыши в РА и РДП
5 Изучение активности и специфичности сывороток мышей в ИФА
Разработка тест-системы ИФА для определения антиэризипелотриксных антител
Обсуждение результатов исследований
Выводы
Практические предложения
Список литературы
Приложения
- Открытие Erysipelothrix rhusiopathiae
- Материалы
- Выделение и изучение фракционного состава белковых экстрактов клеток бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2
Введение к работе
Актуальность темы. Рожа свиней, вызываемая бактерией Егу-sipelothrix rhusiopathiae - септическое антропозоонозное инфекционное заболевание, поражающее преимущественно свиней в возрасте от 3 до 12 месяцев, реже животных других видов, а также человека (Панин А.Н., 2000г., Малахов Ю.А., Душук Р.В., 2001г.). Болезнь широко распространена и наносит значительный экономический ущерб вследствие гибели, абортов, мертворо-ждаемости (Воронин Е.С., Романова М.В., 1987г.).
Эффективность противорожистых биопрепаратов во многом зависит от иммуногенных и антигенных свойств штаммов, используемых для их изготовления. Многие ученые приложили немало труда для изыскания биопрепаратов для диагностики и профилактики рожи свиней (Горбунова Н.В., 1988г., Душук Р.В., Подлесных Л.А., Тихонов Л.И., 1999г., Олейник А. В., 2002г., Клкжина В.И, Моисеева Н.А., 1998., Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., 2000г. и др.).
Однако, несмотря на наличие высокоэффективных средств профилактики в РФ, ежегодное количество вновь регистрируемых неблагополучных по роже свиней хозяйств уменьшается незначительно. По материалам официальных отчетов ветеринарных служб РФ показано, что по наличию выявленных неблагополучных пунктов и уровню летальности рожа свиней занимает 7 место среди 14 наиболее распространенных инфекционных болезней свиней. По проценту к общему количеству прививок рожа свиней занимает второе место (после чумы свиней) (Рахманов A.M., Яременко Н.А. 2003).
Многочисленные исследования посвящены изучению белков эризи-пелотриксов и направлены на поиск иммунизирующих антигенов, обеспечивающих иммуногенные свойства противорожистых вакцин.
Так, имеются несколько сообщений Kobayashi S. et al., 1991г., Sato Н., Yamazaki Y. et al., 1998г., посвященных выделению и изучению антигеноак-тивных белков Е. rhusiopathiae, способных защитить от рожи свиней. Оказа 7 лось, что многие вакцинные штаммы, например, Marienfelde, AN-4, SE-9, 2179, Agata, Koganei и др. отнесенные к различным серовариантам (1а, 2, 5, 10, 20), продуцируют в культуральную жидкость в больших концентрациях белки с молекулярной массой 64-65 кДа, которые и являются, по мнению исследователей, иммунодоминантными белками, играющими значительную роль в защите от инфекции.
В настоящее время среди средств специфической профилактики рожи свиней самым распространенным препаратом является сухая живая вакцина из штамма ВР-2, обладающая наиболее высокими иммуногенными свойствами и слабой реактогенностью (Скичко Н.Д., Мельник Н.В, Зенов Н.И., 1996г., Ярцев М.Я., 1993 г. и др.).
Однако в доступных нам литературных источниках обнаруживаются цишь незначительные сведения о антигеиноактивных белках штамма ВР-2 бактерий рожи свиней, их иммунобиологических особенностях и участии в выработки антител. Поэтому более детальное исследование белков бактерий рожи свиней штамма ВР-2 является актуальным.
Цели и задачи исследования. Целью наших исследований являлось выделение и изучение фракционного состава и серологической активности белковых компонентов бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- разработать методы получения белковых экстрактов и отдельных белков бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2;
- изучить серологическую активность полученных белковых экстрактов и отдельных белков;
- получить гипериммунные сыворотки на мышах на белковые компоненты и выделенные белки и изучить их активность и специфичность в РА, РДП, ИФА;
- разработать тест-систему ИФА для определения уровня антител в гипериммунных антиэризипелотриксньгх сыворотках. Научная новизна. Впервые выделены белки с м. м. 300, 250, 65, 25 и 12 кДа бактерий рожи свиней штамма ВР-2 и изучена их серологическая активность и иммунизирующие свойства.
Впервые установлено, что белок с м. м. 25 кДа, выделенный из бактериальной клетки вакцинного штамма ВР-2 является видоспецифическим и может быть использован для определения антиэризипелотриксных антител.
Установлено, что белок с м. м. 12 кДа является тапоспецифическим и может быть использован для оценки поствакцинального иммунитета.
Разработана тест-система ИФА на основе белков с м. м. 12 кДа и 25 кДа для определения уровня антител в противорожистых сыворотках.
Практическая значимость исследований, На основании результатов проведенных исследований:
1. Разработаны технология получения компонентов и тест-система ИФА на основе белков м. м. 12 кДа и м. м. 25 кДа, которые могут быть использованы для выявления антиэризипелотриксных антител в сыворотках крови животных.
2. Разработаны проект нормативно-технической документации на тест-систему ИФА и методика определения антиэризипелотриксных антител к роже свиней, которые рассмотрены на методической комиссии ВНИТИБП и утверждены директором института.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 29-ой научной студенческой конференции МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, г. Москва (19-20 мая 2003 г.); на международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», г. Щелково (5-6 октября 2004 г.); на международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 35-летию ВНИТИБП, г. Щелково (26-27 мая 2005 г.).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 10 научных статей. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 124 страницах компьютерного текста, и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы и практические предложения, список литературы, включающий 247 наименований, из которых 173 отечественных и 74 зарубежных источников, и приложение. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами, 16 рисунками.
Открытие Erysipelothrix rhusiopathiae
Данное заболевание открыли независимо друг от друга Пастер (1882), Леффлер (1886) [2,8,24], выделив возбудителя от павшей свиньи. У людей болезнь впервые описал Розенбах (1884) [2,84], выделивший культуру эризи-пелотриксов из кожи больного человека и трижды прививший её себе. Данное заболевание Розенбах назвал ползучей эритемой Бейкера или эризипе-лоидом. Идентичность обоих микроорганизмов установил Г.Д. Вияявин (1955) [2,4,84].
Рожа свиней - септическое антропозоонозное инфекционное, широко распространенное в мире, заболевание, поражающее свиней преимущественно в возрасте от 3 до 12 месяцев [1,8,71,84]. Особенно неблагополучны по этой инфекции страны Центральной, Южной и Юго-Восточной Европы, реже страны Скандинавского полуострова. Рожа наблюдается также в странах Азии и отмечена в Австралии [1,4,12,38,71,150].
Первые сведения о роже свиней в России относятся к 1883 г. В 1962 г. в 123 свиноводческих хозяйствах острая септическая форма рожи регистрировалась в 91,9%, подострая - в 1.1% случаев [1,2,8,12,150]. В 1965 г. выявлено 6945 неблагополучных пунктов по роже свиней, где заболело 201900 животных, из которых пало и вынужденно убито 60500 голов [38,71,84,150]. В настоящее время рожа в стране распространена повсеместно. Ее регистрируют в виде спорадических случаев или энзоотических вспышек [2,8,24].
В Республике Беларусь (РБ) ежегодно против рожи вакцинируют все поголовье свиней, однако стойкого благополучия по этому заболеванию не достигнуто. В период с 1991 по 1998 гг., на территории РБ установлено 140 неблагополучных пунктов, в которых заболело 2990 свиней, 770 пало. По статистике в республике ежегодно регистрируется от 6 до 26 неблагополучных пунктов по данному заболеванию [84,122]. По материалам официальных отчетов ветеринарных служб РФ показано, что по наличию выявленных неблагополучных пунктов и уровню летальности рожа свиней занимает 7 место среди 14 наиболее распространенных инфекционных болезней свиней. По проценту к общему количеству прививок рожа свиней занимает второе место (после чумы свиней) и составляет 23,3% [122].
Несмотря на наличие в РФ высокоэффективных средств профилактики ежегодное количество вновь регистрируемых неблагополучных хозяйств уменьшается незначительно. Отмечают годы, когда число неблагополучных хозяйств и процент заболеваемости резко увеличиваются, что объясняется многообразием путей заноса возбудителя, склонностью к стационарному течению болезни, наличием широко распространенного бактерионосительства [103,104].
Материалы
В качестве антигенов использовали:
1) цельные бактериальные клетки штамма ВР-2;
2) препараты, полученные ультразвуковой обработкой цельных бактериальных клеток;
3) препараты, полученные щелочным гидролизом цельных бактериальных клеток;
4) препараты, полученные с помощью автолиза цельных бактериальных клеток;
5) препараты, полученные автоклавированием цельных бактериальных клеток;
6) Белки с м. м. 300, 250, 65, 25 и12 кДа.
В исследованиях применяли гипериммунные сыворотки: мышей, полученные на цельные бактериальные клетки, ультразвуїсовой гомогенат, белки с м. м. 300, 250, 65, 25 и 12 кДа; 125 сывороток от свиней из СШС «Новое
Литвинове», взятые после вакцинации сухой противорожистой вакциной штамма ВР-2.
В качестве контрольных свиных антиэризипелотриксных сывороток использовали: референс-сыворотку к штамму ВР-2 (ВГНКИ); интернациональный стандарт к серотипу N (International Standard for swine erysipelas serum, anti-N, Великобритания); производственную противорожистую сыворотку на штаммы (1329, 1689-серотип 1, 1933-9/2-серотип 2), полученную с Армавирской биофабрики; отрицательные и специфические сыворотки к другим инфекциям.
Получение и изучение фракционного состава ультразвукового гомогената бактерий рожи свиней
Известно, что эффективность противорожистых препаратов во многом зависит от иммунобиологических и антигенных свойств штаммов, используемых для их изготовления. Однако немногие штаммы рожи свиней обладают особо благоприятной антигенной структурой и высокой иммунизирующей способностью. Отсюда понятна важная роль изучения антигенной структуры рожистых бактерий для создания иммуногенных вакцин. В настоящее время лиофилизированная вакцина штамма ВР-2 является самым распространенным препаратом среди средств специфической профилактики рожи свиней [2,4,49]. Однако до сегодняшнего дня не ясно, какие белки штамма ВР-2 обладают антигенностью.
Настоящий раздел работы посвящен выделению и изучению фракционного состава белковых экстрактов бактерий рожи свиней штамма ВР-2. Выделение белковых экстрактов проводили из сухой противорожистой вакцины штамма ВР-2 и баккультуры бактерий ролей с концентрацией клеток 3-4 млрд./мл (см. рис. 4).
Полученную отмытую бактериальную суспензию использовали для изготовления белковых экстрактов - ультразвукового гомогената, щелочного гидролизата, термоэкстракта и автолизата.
