Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ГЛИКОСФИНГОЛИПИДЫ И ИХ СВОЙСТВА 8
1.1. Гликолипиды 10
1.2. Сфинголипиды 10
1.3. Цереброзиды 12
1.4. Свойства 15
1.4.1. Участие в межклеточных взаимодействиях 15
1.4.2. Проведение сигналов, индуцируемых Фактором Некроза Опухоли 16
1.4.3. Антигенная активность 16
1.4.4. Образованиерафтов 18
1.4.5. Ингибирование активации комплемента 18
1.4.6. Полиморфное поведение 19
1.5. БОЛЕЗНИ НАКОПЛЕНИЯ 23
1.6. НЕКОТОРЫЕ СПОСОБЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ГСФЛ 23
1.6.1. Общие методы 23
1.6.2. Частные методы 25
1.7. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ГЛИКОСФИНГОЛИПИДОВ В КОСМЕТИКЕ 27
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 30
2.1. Разработка процесса выделения гсфл из головного мозга свиньи 30
2.1.1. Разработка выделения ГСфЛ из головного мозга свиньи 31
2.1.2. Промышленное внедрение технологии выделения ГСфЛ. 50
2.2. Изучение выделенных липидов 53
2.2.1. Агрегационная устойчивость 55
2.2.2. Устойчивость к окислению 56
2.2.3. Потенциал 57
2.2.4. Размер и морфология частиц дисперсий 58
2.2.5. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) 63
2.2.6. рН-Зависимая проницаемость бислоя липосом 65
2.2.7. Определение С-реактивного белка 68
2.2.8. Влияние ГСфЛ на свойства эпидермиса (увлажненность, упругость, проницаемость лжидного барьера для воды) 69
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 75
3.1. Материалы и методы 75
3.2. Липидный состав 75
3.3. Выделение сфинголипидов 76
3.4. Получение пролипосом (полунанотрубок) 76
3.5. Определение концентрации малонового альдегида 77
3.6. Е-потенциал 77
3.7. Размер и морфология частиц дисперсий 79
3.7.1. Фотон-корреляционная спектроскопия 79
3.7.2. Электронная микроскопия 79
3.8. РН-зависимая проницаемость бислоя липосом 79
3.9. Дифференциальная сканирующая калориметрия 80
3.10. Определение c-реактивного белка 81
3.11. Влияние гсфл на свойства эпидермиса (увлажненность и упругость, проницаемость липидного барьера для воды) 81
4. ВЫВОДЫ 82
5. ПРИЛОЖЕНИЕ. АКТ ВНЕДРЕНИЯ 83
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 84
Введение к работе
Полярные липиды применяются в медицине и косметологии, в основном для получения липосомных препаратов. Репертуар используемых полярных липидов довольно узок: основу составляют фосфатидилхолин, холестерин, для придания особых свойств в состав липосом включают отрицательно заряженные природные фосфолипиды (фосфатидилсерин, фосфатидная кислота, фосфатидилглицерин, дифосфатидилглицерин); гидрированные природные фосфолипиды, реже синтетические липиды. С этой точки зрения перспективно изучение возможности использования в липосомных препаратах ГСфЛ, к которым относятся Ц, ЦС. Особый интерес в этом классе соединений представляет ЦС. Присутствие отрицательного заряда в молекуле ЦС, длинных насыщенных углеводородных цепей делает этот полярный липид очень полезным компонентом липосом для транспорта лекарственных веществ, так как отрицательный заряд и высокая температура фазового перехода должны увеличивать агрегационную устойчивость и уменьшать перекисное окисление липидов. Кроме того, литературный анализ показал, что Ц и ЦС также обладают уникальными физико-химическими и биологическими свойствами.
Недавние исследования показывают, что сфинголипиды участвуют в регуляции транскрипции, дифференцировке клеток, стрессовом ответе, и регуляции апоптоза, а также принимают участие в межклеточной сигнализации. Благодаря физико-химическим особенностям сфинголипиды биологических мембран взаимодействуют друг с другом, с другими компонентами мембран, образуя домены (rafts), которые принимают участие в регулировании мембранных процессов: эндо- и экзоцитоза, в функционировании мембранных рецепторов и ферментов. Все перечисленное говорит об актуальности разработки простых методов выделения ГСфЛ.
Ц и ЦС присутствуют в мембранах лейкоцитов, эритроцитов, в эпителиальных клетках почек и кишечника, оболочке глаза, но основное количество этих ГСфЛ содержится в головном и спинном мозге. Во взрослом мозге ЦС составляют 3-8% от общей сухой массы всех липидов. Поэтому именно мозг животных может рассматриваться как главный источник ГСфЛ.
Основными задачами исследования были:
Разработать технологичный метод выделения гликосфинголипидов (Ц, ЦС) из мозга
свиньи;
Отработать способы получения стабильных липосом на основе выделяемых ГСфЛ;
Для водных дисперсий ГСфЛ исследовать физико-химические свойства,
определяющие их возможное использование в косметике и медицине;
Изучить возможность их использования как рН-чувствительных липосом;
Изучить воздействие липосомных дисперсий с ГСфЛ на кожу.
Сфинголипиды
История изучения ГСфЛ развивалась в двух направлениях, первое - исследование химического состава мозговой и нервной ткани, второе - исследование липидов, накапливающихся в тканях пациентов, - "гликолипидоз".
Впервые ГСфЛ были обнаружены в головном мозге в 1865 г. Liebreich [1], который описал наличие уникального гликозида, растворимого в горячем этиловом спирте и осаждаемом при охлаждении. Состав этого гликозида был описан как постоянный среди множества разновидностей, и получил название "протагон", выражая, что это самый важный химический объект мозга. В 1874 - 1876 г.г. лондонский хирург-химик Thudichum [2], описал химический состав мозга и наличие цереброзида (или мозговой галактозида), его точный химический состав, включая уникальный алифатический алкалоид названный "сфингозином". Результаты его систематического исследования компилировались в монографию, которая теперь является монументальным классификатором химии мозга [3, 4].
В 1935 г. Klenk [5] выделил из мозговой ткани ребенка, умершего от инфантильной идиотии (болезнь Тея-Сакса) новый тип липидов. Blix в 1938 г [6] доказал, что те же липиды содержится в малом количестве в нормальной мозговой ткани. Несколькими годами позже Klenk [7, 8] идентифицировал липиды с высоким содержанием углеводов в мозге крупного рогатого скота и назвал их ганглиозидами. При анализе продуктов гидролиза Klenk обнаружил жирные кислоты, сфингозин, галактозу, глюкозу и сиаловую кислоту. Помимо этих продуктов большинство ганглиозидов содержало также гексозамин. Blix [6] в тоже время обнаруживает в мозге 9% гексозамина, но характеризует этот состав как D-галактозамин только в 1952 г. [5,9].
Цереброзиды формируют группу липидов, которые Thudichum выделил из мозга и установил [10, 11], что полученные липиды не содержат фосфор, а сфингозин, жирные кислоты и гексоза являются продуктами гидролиза. Точная идентификация углеводного остатка - галактозы - была выполнена Braun и Morris [12], a Thierfelder и Klenk [13] получили продукт частичного гидролиза цереброзидов - психозин (галактозид сфингозина), чей дальнейший гидролиз дает гексозу, которая связана гликозидной связью с одной из гидроксильных групп сфингозина. Так же было показано, что психозин содержит свободную аминогруппу.
На вопрос, связанна ли гексоза с первичной или вторичной гидроксильной группой основы, нашли ответ Yamakawa [14], Carter и Greenwood [15], которые доказали связь сахара и концевого атома углерода сфингозина.
Цереброзидсфингозины, выделенные Klenk [16], в отличие от психозина не имели свободной аминогруппы, и позже Franklin и Bielshovski были названы церамидами.
Самые простые гликолипиды и цереброзиды ранее подразделялись на цереброн, керазин (или френозин), нервон, и оксинервон, согласно строению жирно-кислотных остатков в Ц, которые значительно влияют на его растворимость.
Классификация ГСфЛ базировалась на строении углевода в зависимости от замещенных групп таких как: нейтральные гликолипиды, сульфатиды (содержащие сульфо-группу), и ганглиозиды (содержащие сиаловую кислоту).
Гликолипиды - известны еще с прошлого века, но особенно интенсивное изучение их было начато в последние годы, главным образом, в связи с бурным развитием исследований в области молекулярной биологии мембран. Существует два основных типа гликолипидов: гликосфинголипиды (ГСфЛ) и гликозилдиглицериды (ГДАГ) [17].
У гликолипидов полярную голову молекулы образуют гидрофильные ковалентно связанные углеводные группы, чаще всего D-галактоза. Простейшими гликолипидами являются ГДАГ, обнаруженные в растениях и микроорганизмах.
Полярные липиды являются основными компонентами мембран, составляя от 20 до 80% их массы. Согласно современным представлениям, липиды организованы в мембране преимущественно в виде бислоя. Белки могут быть включены в бислой или связаны с его поверхностью. Одна из главных функций мембран состоит в формировании замкнутых барьеров типа плазматической мембраны или мембран внутриклеточных органелл. Свойства этих барьеров определяются прежде всего физическими характеристиками молекул липидов. Однако липиды не только формируют инертный липидный матрикс, исследования показали, что они имеют и другие функции.
Разработка выделения ГСфЛ из головного мозга свиньи
Исследование состояло из двух этапов: определение оптимальных параметров всех стадий процесса и разработка промышленной технологии выделения ГСфЛ на основе полученных экспериментальных данных.
Стадия ацетоновой экстракции
Задача данной стадии обезвоживание и возможно более полное отделение нейтральных липидов.
Целью экспериментального исследования стадии ацетоновой экстракции являлось изучение влияния объема экстрагента и времени экстракции.
Для обезвоживания исходного сырья и извлечения нейтральных липидов используют, как отмечалось выше, холодный ацетон (-10-0С) в количестве, составляющим в зависимости от типа используемого сырья, 4-Ю массовых частей ацетона от массы сырья. Исследование этой стадии проводилось на лабораторной установке, состоящей из лабораторного вакуумно-роторного испарителя (ВРИ), обогреваемой воронки Бюхнера и водоструйного насоса.
В ходе эксперимента исходное влажное сырье в количестве 100 г загружали в колбу ВРИ, объемом 1000 мл. В колбу заливали ацетон, который предварительно охлаждали в морозильной камере при температуре -18-22С. В баню роторного испарителя помещали охлаждающую смесь (вода-соль-лед), для поддержания необходимой температуры экстракции. Скорость вращения ротора составляла 60-80 об/мин. Время экстракции 2 ч. (Рис. 16).
В процессе эксперимента определяли оптимальный расход экстрагента и его распределение по стадиям. Для определения эффективности обезвоживания сырья гравиметрически определяли содержание влаги в нем.
Из графика на Рис. 16 видно, что оптимальное время экстракции составляет 120 мин., а его увеличение не значительно влияет на процесс дегиратации.
Для оценки количества добавляемого экстрагента на данной стадии введем коэффициент ПА, который показывает какое количество ацетона (по массе) приходится на одну часть исходного влажного материала.
Как видно из Рис. 17 при экстракции четырьмя объемами ацетона степень обезвоживания исходного сырья составляет 94% и дальнейшее увеличение объема экстрагента не целесообразно.
Итак, оптимальными параметрами для проведения стадии обезвоживания исходного сырья (первая ацетоновая экстракция) являются:
температура экстрагента (ацетона) -18-22С;
время экстракции 120 мин.;
4 части ацетона (по массе) на одну часть исходного влажного сырья.
Из графика на Рис. 18. видно, что при добавлении 3.5-4.0 частей ацетона по отношению к влажной массе мозгов на первой стадии экстракции извлекается не более 30% нейтральных липидов. На этой стадии происходит обезвоживание исходного сырья. Основная масса нейтральных липидов извлекается на второй стадии экстракции (80-85%).
Заметим, что дальнейшее увеличение экстрагента на каждой стадии приводит к медленному увеличению степени извлечения. Рекомендуемая температура при ацетоновых экстракциях обычно составляет -10С. Это связано во-первых, с большой окисляемостью фосфолипидов при более высоких температурах, во-вторых возрастает доля экстрагированных полярных липидов; при температуре выше 5С в экстракт переходят фосфолипиды, что сказывается отрицательно на последующих стадиях выделения.
Исследования степени извлечения нейтральных липидов на каждой стадии показали, что оптимальное время экстракции составляет 2 ч (Рис. 19).
Достичь полного извлечения нейтральных липидов, используя 3.5-4.0 частей ацетона на каждой стадии процесса, не удается. Полностью удалить нейтральные липиды возможно, лишь значительно увеличив количество ацетона. Однако, это не целесообразно, т.к. ведет к значительному увеличению затрат на разделение (в частности, на последующую регенерацию ацетона). При проведении стадии экстракции количество добавляемого экстрагента, как правило, принято делить пополам, используя так называемую дробную экстракцию [84]. Такой прием позволяет повысить эффективность процесса разделения, используя то же самое количество экстрагента. Однако заметим, что в исследуемом случае использование трех и более экстракций, а следовательно 2-х и менее частей ацетона не целесообразно т.к. из-за недостаточной смачиваемости экстагентом сырья и высокой вязкости системы, соответственно, затрудняется перемешивание экстракта. Удаление остаточных нейтральных липидов, как будет показано ниже, экономически выгоднее проводить на стадиях кристаллизации и промывки.
Материалы и методы
Растворители и реактивы марки х.ч. или о.с.ч. приобретены в компании «ХимМед», Россия.
Мозг свиньи, свежезамороженный был получен от Кузнецовского свинокомплекса Нарофоминского района Московской области, хранился при температуре -12С. Яичные фосфолипиды были получены ООО «Биотех - М», хранились при температуре -12С. IIIV, ЦС (95% по данным ТСХ), Lipotec (code ES043, BATCH E25G12), получены от компании Дау Корнинг, США, Silica gel 60 (размер частиц 60x40 мкм, .05 М цитратный буфер (рН 5.0), 0.1 М глициновый буфер, арсеназо III, ацетон, буфер PBS (рН 7.4), бычий сывороточный альбумин, приобретен в «СИГМА», фосфатно-солевой буфер (рН 7.2).
Моноламеллярные липосомы получали с помощью экструдера LiposoFast Basic (Avestin Inc., Канада).
Содержание ГСфЛе спиртовом экстракте определяли гравиметрически. Микробиологические показатели безопасности ГСфЛОпределяли по СанПиН 1.2. Физико-химические показатели ГСфЛОпределяли по СанПиН 1.2.681-97. Качественный состав 0.5 мг смеси липидов растворяли в 5 мл хлороформа. Проводили ТСХ в системе растворителей хлороформ :метанол: вода (65:25:4) [107]. Образцы наносили на алюминиевую пластинку с силикагелем; на эту же пластинку наносили образцы индивидуальных липидов.
Количественный анализ 227 мг смеси липидов растворяли в 1.5 мл системы хлороформ-метанол-вода (70:10:1) и наносили на хроматографическую колонку заполненную 15 г силикагеля. В качестве элюента использовали вышеуказанную систему растворителей, а после выхода из колонки ЦС элюирование проводили системой растворителей хлороформ-метанол-вода (60:30:1). Сфингомиелины смывали с колонки смесью растворителей метанол-вода-аммиак (80:20:1). Процесс разделения исследуемой смеси контролировали ТСХ. Растворитель из полученных фракций удаляли на вакуумном роторном испарителе, а остаток сушили при пониженном давлении до постоянной массы. 4 г смеси липидов из спинного мозга крупного рогатого скота растворяли в 80 мл смеси хлороформ:метанол (2:1) и добавляли раствор 0.7 г КОН в 25 мл метанола, смесь перемешивали 3 ч при 35-40С и промывали 30 мл физраствора. Органический раствор упаривали, остаток промывали ацетоном (3x10 мл).
Остаток (1.6 г) хроматографировали на колонке с 86 мг силикагеля. Элюировали (4.5 мл/мин) смесями хлороформ-метанол 95:5 (130 мл), 90:10 (150 мл), 85:15 (150 мл), 80:20 (600 мл). Получали: 130 мг Ц с нормальными жирными кислотами, один компонент (Rf 0.66), 230 мг Ц, два - (Rf 0.66 и 0.62); а также 120 мг ЦС с нормальными жирными кислотами, один компонент (Rf 0.38; т. пл. 224.1-225.3С (с разложением)), и 190 мг ЦС, два компонента (Rf 0.38 и 0.36, т. пл. 237.5-238.8С (с разложением).
Определение содержания плазмалогепов 50 мг смеси липидов кипятили 2 ч с 4.5 мл 2.5% раствора НС1 в метаноле [108]. С посощью колоночной хроматографии определяли количество не гидролизовавшихся ФХ и ФЭ. Количество ФЭ и ФХ уменьшалось на 28 и 21% соответственно.
Содержание белка [109] К 100 мкг смеси липидов в 0.1 мл метанола добавляли 5 мл реагента (100 мг кумасси бриллиантового синего G-250 растворяли в 50 мл 95% этанола; добавляли 85% фосфорной кислоты, доводили водой до 1 л) и перемешивали. Через 30 мин измеряли поглощение при 595 нм относительно чистого реагента. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.
Гидратация ГСфЛ Для получения 1% дисперсии к 50 мл воды, при 20С, методом наслаивания присыпают 0.5 г смеси ГСфЛ и оставляют при комнатной температуре до полной гидратации (4-6 ч).
Метод наслаивания - это постепенное, равномерное наслоение (послойное насыпание тонкодисперсного порошка на поверхности растворителя) диспергируемого вещества на поверхность растворителя.
Гидратированные ГСфЛ перемешивают на мешалке ( 500 об/мин) в течении 30-40 мин.
Получение липосом из гидратированных ГСфЛ нагреванием Гидратированные ГСфЛ перемешивали при 30-35С в течении 15-20 мин. Получение липосом с помощью ультразвукового дезинтегратора Один грамм ГСфЛ диспергировали в холодной воде (100 мл), полученную дисперсию озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗД-А (22 кГц) по 1-3 мин с перерывом 3 мин при охлаждении льдом до прекращения изменения интенсивности рассеивания света. Дисперсию центрифугировали при 5000 об./мин. 1 мин. для удаления металлических частиц зонда. Оценка агрегационной устойчивости Измеряли изменение оптической плотности до (Di) и после (D2) центрифугирования (3000 об./мин. в течение 5 мин.). DOTH= D2/ Dj. 3.5. Определение концентрации малонового альдегида Пятьсот мкл 1% водной дисперсии липосом различного состава: 1) яФХ, 2) яФХ с добавлением 1% ЦС, 3) на основе ГСфЛ и 0.3 мл свежеприготовленного реагента (15 г ТХУ и 0.67 г ТБК в 100 мл дистиллированной воды) перемешивали и нагревали в кипящей водяной бане 30 мин., инкубировали, добавляли Fe2+. Измеряли оптическую плотность анализируемого образца относительно реагента при 580 и 532 нм и рассчитывали содержание в пробе малонового альдегида по формуле: c=(Ds32-D58o)x6xlOOO/155[110] 3.6. -Потенциал
Измерение электрокинетического -потенциала дисперсии ГСфЛ проводили методом электрофореза, определяя скорость перемещения границы раздела золь-контактная жидкость в электрическом поле [111]. В качестве контактной жидкости использовали воду.
Электрофорез проводили в U-образной градуированной стеклянной трубке (1) (Рис. 43), снабженной двумя кранами (2), диаметры каналов которых равны диаметру трубки. Резиновым шлангом (3) трубка соединена с сосудом (4), в который наливали исследуемую дисперсию. Внешняя разность потенциалов (5) подавалась к металлическим электродам.
