Содержание к диссертации
Введение
I, ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Характеристика бактерий рода Proteus 10
1.2. Резервуар и распространение инфекции 15
1.3. Патогенность протеев 21
1.4. Идентификация бактерий рода Proteus 27
1.5. Устойчивость 30
1.6. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике 31
1.6. ЬФаго идентификация бактерий и фаготипирование 31
1.6.2. Развитие фаговых корпускул в клетке хозяина 37
1.6.3. Реакция нарастания титра фага (РНФ) 40
II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 47
2.1. Материалы и методы 47
2.2. Результаты собственных исследований 55
2.2.1. Выделение бактерий рода Proteus из патологического материала
и объектов окружающей среды 55
2.2.2.Изучение спектра литического действия коммерческого коли-протейного бактериофага 59
2.2.3. Поиск бактериофагов Proteus и селекция клонов фагов 63
2.2.4. Изучение биологических свойств фагов бактерий рода Proteus 69
2.2.5. Характеристика выделенных фагов бактерий рода Proteus, выбранных для конструирования диагностического препарата 78
2.3. Разработка технологических параметров изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Proteus 88
2.4. Разработка метода выделения и ускоренной идентификации бактерий рода Proteus с использованием фагов 96
2.5. Разработка оптимальных условий постановки РНФ 100
2.5.1 .Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение 103
2.5.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное заимодействие фага с бактериями 106
2.5.3. Использование РНФ для обнаружения бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора 111
2.5.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями рода Proteus, с помощью РНФ 112
2.5.3.2. Исследование комбикорма, контаминированного бактериями рода Proteus, с помощью РНФ П 4
2.5.3.3. Исследование проб фекалий, контаминированных бактериями рода Proteus, с помощью РНФ 116
2.5.3.4. Исследование мяса, контаминированного бакіериями рода Proteus, с помощью РНФ 117
2.5.3.5. Результаты исследований фекалий от больных диареей поросят с помощью РНФ 120
2.6. Изучение эффективности поливалентного фагового биопрепарат 123
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 124
ВЫВОДЫ 131
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 133
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ
ИСТОЧНИКОВ 134
ПРИЛОЖЕНИЯ 154
Введение к работе
Актуальность работы
В последние годы, благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей, расширилось представление о роли энтеробактерий рода Proteus в патологии животных и человека (Papapetropoulou, Pagonopoulou, Kouskouni, 1997; Золотухин, 2004; 2005).
Представители данного рода широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий животных и человека. Некоторые штаммы входят в состав нормальной микрофлоры кишечника (Lamikanra, Fayinka, Olusanya, 1989; Золотухин, 2002). В то же время представители этого рода являются возбудителями внутрибольничных инфекций, энтеритов у детей и взрослых людей, способны вызывать воспалительные процессы мочевыводящих путей, быть причиной послеоперационных и ожоговых осложнений, сепсиса, дисбактериоза, токсикоинфекций и других заболеваний (Бутакова, Илинская, Юрова, 1991; Ба-кулов, Смирнов, Васильев, 2003; Зыкин, 2003; Заркуа, Мечурчлишвили, Гадуа, 2005; Чанишвили с соавт., 2005; Золотухин, Каврук, Васильев, 2005).
Также имеется множество экспериментальных данных о патогенности названных микроорганизмов для животных. Протеи выделяются при маститах, эндометритах, раневых инфекциях и других воспалительных процессах у различных видов животных. Особое внимание заслуживают работы по изучению этиологической роли протея в возникновении желудочно-кишечных заболеваний новорожденных животных (Каврук, Бритова, Гиряева, 1983; Каврук, 1986; 1994; Парайко, Парайко, 1990; Мищенко с соавт., 1999; Золотухин, 2004, Золотухин, Каврук, Васильев, 2005).
В настоящее время лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых протеем, основана на выделении чистой культуры микроорганизмов и их идентификации по общепринятым тестам. Этот метод трудоемок и требует затрат
времени, питательных сред и реактивов. Поэтому перед исследователями стоит задача изыскания более простого и доступного для лабораторий любого уровня метода индикации и идентификации названных микроорганизмов.
В ветеринарной практике для ускоренного обнаружения некоторых родов микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды предложены индикаторные бактериофаги с использованием реакции нарастания титра фага РНФ (Гольдфарб, 1961; Капырина, Бакулов, 1972; Ганюшкин, 1988; Русалеев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990; 1992; Натидзе с соавт., 2005). Методы индикации и идентификации микроорганизмов с помощью бактериофагов специфичны, не требуют больших затрат времени, материалов и общедоступны.
Цель исследования
Разработка технологических параметров по индикации и идентификации бактерий рода Proteus с помощью специфических бактериофагов. Задачи исследования:
Изучить распространение бактерий рода Proteus в хозяйствах, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка сельскохозяйст-веных животных.
Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Proteus.
Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу, морфологию фаговых корпускул, изменение литической активности при хранении) выделенных бактериофагов.
Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат-диагностикум.
Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Proteus.
Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.
Разработать схему идентификации протеев с помощью бактериофагов.
Научная новизна
Получены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении штаммов бактерий рода Proteus, выделенных из объектов ветеринарного надзора. Изучены основные биологические свойства выделенных фагов.
Впервые разработаны биотехнологические параметры фагоиндикации и фагоидентификации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора. Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью.
Практическая значимость
Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, которые используются для изготовления диагностических препаратов. Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата из выделенных фагов и схемы фагодиагностики.
Для конструирования биопрепарата были отобраны два фага, которые депонированы в государственной коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов ФГУ «ВГНКИ» (Справка о депонировании штамма бактериофага П-16 УГСХА от 21.02.2006 №263-3/19; Справка о депонировании штамма бактериофага П-261 УГСХА от 21.02.2006 №263-4/19) для получения патентов.
Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных протейных бактериофагов П-16 УГСХА, П-261 УГСХА», одобренная Ученым Советом Ульяновской ГСХА и утвержденная ректором академии 17.01.2006.
Для врачей-бактериологов предложены «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Proteus в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденные Отделением ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук (РАСХН) (26.06.2006).
Результаты изучения биологических свойств бактериофагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА и индикации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора методом РНФ подтверждена актом производственных испытаний (от 10.01.2006), актами комиссионных испытаний в Ульяновской Государственной сельскохозяйственной академии (от 30.01.2006), актами комиссионных испытаний в Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ) (от 17.02.2006).
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
Усовершенствована схема выделения бактериофагов применительно к протеям, изучены биологические свойства выделенных и селекционированных фагов.
Сконструирован биопрепарат-диагностикум из селекционированных фагов и разработаны технологические параметры его изготовления для фагоди-агностики бактерий рода Proteus.
Разработаны схемы ускоренной индикации бактерий Proteus в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и идентификации протеев с использованием созданного биопрепарата.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Региональные проблемы народного хозяйства» (Ульяновск, 2004), Научно-
практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов «Аграрная наука - развитию агропромышленного комплекса» (Ульяновск, 2004), Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск, 2005), Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI» (Ульяновск, 2006), Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006).
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» в рамках научно - исследовательской темы кафедры «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных» при творческом сотрудничестве с сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГиЭ).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические предложения, список литературных источников, 197 источников, в том числе 150 отечественных, и приложения. Работа изложена на 166 страницах и иллюстрирована 36 таблицами, 9 рисунками.
Характеристика бактерий рода Proteus
Впервые бактерии этого рода (P. mirabilis) выделил из гниющего мяса немецкий ученый G. Hauser в 1885 году. Способность бактерий менять внешнее проявление роста на агаровых пластинчатых средах послужила основанием для наименования Proteus (в честь сына Посейдона - водяного божества Протея, способного менять свой облик).
В 1953 году в соответствии с решением Подкомитета кишечных бактерий Номенклатурного комитета Международной ассоциации микробиологов род Proteus включал 4 вида: P. vulgaris, P. mirabilis, P. morganii, Р rettgeri, отличия между которыми основывались на биохимических (ферментативных) признаках. Такой же классификации придерживался F. Kauffmann (1959), но уже спустя несколько лет он предложил новую классификацию бактерий семейства Епerobacteriaceae, принятую в 1963 году. В соответствии с этой классификацией F. Kauffmann (1963) род Proteus включал лишь два вида - P. vulgaris и P.mirabilis, а другие виды протея были выделены в самостоятельные роды -Morganella, Rettgerella и Provldencia. Его классификация имела расхождение с «Определителем бактерий Берджи», изданного в 1974 году, в котором протей насчитывал 5 видов: P. vulgaris, P. mirabilis, P. morganii, P. rettgeri, P. incon-stans. Следует отметить, что в то время существовала и другая классификация указанных бактерий, разработанная американскими исследователями P.R. Edwards и W.H. Ewing (1972), по которой в трибу Proteae входили 2 рода-Proteus и Provldencia. Род Proteus, как и в «Определителе бактерий Берджи» 1974 года, включал те же виды протея, за исключением P. inconstans, который был выделен в отдельный род Provldencia с двумя видами Р, alcalifaciens и P. stuartii. (Золотухин, Каврук, Васильев, 2005).
В настоящее время все эти своеобразные бактерии составляют предмет дискуссий микробиологов по поводу их таксономического положения, причем некоторые из них считают протеев лишь отдаленно связанными с семейством Enterobacteriaceae (Hantula, Korhonen, Bamford, 1990; Блохина и др., 1992), Авторы обосновывают отдаленность рода Proteus на базе данных о строении генома. Известно, что семейство Enterobacteriaceae содержит в своем составе бактерии с вариациями содержания ГЦ - пар в ДНК от 38 до 60 %. Бактерии родов Proteus и Providencia значительно отличаются по составу ДНК от других родов семейства (на 10-20 %), что и послужило в свое время поводом для предложений по выделению этих родов в самостоятельное семейство Proteaceae.
Резервуар и распространение инфекции
Протеи выделяют из воды, почвы, фекалий животных и человека. Некоторые виды, вероятно, входят в состав нормальной микрофлоры кишечника. Но штаммы патогенных серогрупп способны вызывать вспышки гастроэнтеритов у и токсикоинфекций у детей и взрослых людей.
А.В. Алешукина, Л.Д. Мартьшенко, Р.Г. Ловердо (1991) обследовали 380 детей в возрасте от 20 дней до 5 лет (310 - больные острыми кишечными инфекциями (ОКИ), находящихся на стационарном лечении, 70 - здоровые дети) и установили, что 23 % случаев заболеваний ОКИ обусловлены бактериямт рода Proteus. Проводя расшифровку этиологии заболевания у 2870 лиц с острыми кишечными инфекциями М.Ш. Садыкова, М.Я. Якубова, А.Х. Рахимова (1991) установили, что в 22,7 % случаев ОКИ были обусловлены бактериями семейства энтеробактерий. Чаще всего высевались бактерии рода Proteus, что составило 35% случаев. Высеваемость бактерий в течение года была равномерной с некоторым увеличением в мае-июне. Г.П. Давиденко, Н.Р. Назарметова. Н.Ш. Хусаинова (1991) исследовали гнойное отделяемое с поверхности ожоговых ран второй и третьей степеней тяжести. В 31 % случаев золотистый ст афиллококк выделялся в ассоциации с гра-мотрицательными бактериями (клебсиеллами и протеем). Ю.Б, Белоусов, В.П. Комарова. О.В. Ефременкова (1998) сообщают, что при амбулаторном обследовании 60 пожилых больных с инфекцией нижних дыхательных путей в 10 % случаев выделяли Citrobacter, Acinetobacter, Enterobacter, Proteus и P. aeruginosa. J. Martinez-Beltran., E. Loza, M.J. Bautista et al. (1991) в период 1988-1990 гг. наблюдали 1012 эпизодов бактериемии, вызванных грам отрицательными микроорганизмами, среди которых 5 % приходилось на P. mirabilis. При исследовании мочи больных хроническим пиелонефритом было доказано наличие бактериоурий. В 24,2 % случаев выделялись протеи (Мерджа-нов, Велев, Петков, 1991). Э.В. Жукова, А.А. Ризаева, Л.К. Чарыева (1992) изучали частоту и этиологическую структуру ВБКИ на примере 177 детей до 3 лет поступивших в стационар с диагнозом гастроэнтерит и установили, что частота ВБКИ составляет 11,85 %, причиной в 1,1 % случаев был P. mirabilis.
Материалы и методы
Штаммы бактерий. В работе были использованы как гомологичные, так и гетерологичные штаммы бактерий. В качестве гомологичных бактерий использовали 40 штаммов бактерии рода Proteus. 14 музейных штаммов из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА: P. mirabilis Тр.1 Культ., P. mirabilis 95/98, P. mirabilis 31/82, P. mirabilis №14 З ТГ, P. mirabilis 4/2 З ТГ, P. mirabilis 31/32, P. mirabilis 523, P. mirabilis 491. P. vulgaris Куз.с/х Тр.1 сел, P. vulgaris Куз. с/х фекал., Р, vulgaris 82/98, P. vegans З ТГ №3, P.vulgaris 85/98, P. VM/ garis 55 А. 14 музейных штаммов из лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГиЭ: 4 P. mirabilis 4, P. mirabilis Тр. 13, P. mirabilis "ЗП", P. mirabilis 9, P. vulgaris Тр. 12, P. vulgaris Куз. Тр. 5, P. vulgaris 71, P. vulgaris 8, Р, vulgaris 25, P. vulgaris 6\, P. vulgaris 18, P. vulgaris 16, P. vulgaris 13, P. vulgaris 34. 12 штаммов выделены из объектов ветеринарного надзора и патологического материала: P. vulgaris 261, P. vulgaris 7, Р, vulgaris 2, P. vulgaris 3, P. vulgaris 4, P. vulgaris 5, P. vulgaris б, P. vulgaris 7, P. vulgaris 8, P. vulgaris 9, P. vulgaris 10, P. mirabilis 1.
Культуры бактерий были выделены из разных источников и обладали типичными для данного рода культурально-морфологическими и биохимическими свойствами. В качестве гетерологичных штаммов бактерий использовалиследующие виды, рода и семейства. Бактерии рода Escherichia. В опытах использовали 46 штаммов, которые были получены из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ УГСХА. Бактерии кишечной палочки обладали типичными для данного рода биологическими свойствами. Бактерии рода Citrobacter. В опытах использовали 6 штаммов, которые были получены из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ УГСХА. Цитробак-теры обладали типичными для данного рода биологическими свойствами. Бактерии рода Enterobacter. В опытах использовали 4 штамма, которые были получены из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ УГСХА. Энтеро-бактеры обладали типичными для данного рода биологическими свойствами. Бактерии рода Morganella. В опытах использовали 6 штаммов, которые были получены из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ УГСХА. Бактерии рода Morganella обладали типичными для данного рода биологическими свойствами.
