Содержание к диссертации
Введение
3. Обзор литературы: Флавоноиды красного винограда: нахождение в природных источниках сырья, биологические свойства, анализ, выделение, очистка 10
3.1. Структура флавоноидов 11
3.2. Полифенолы, содержащиеся в ягоде винограда 11
3.2.1. Фенолокислоты 11
3.2.2. Флавонолы 12
3.2.3. Антоцианы 13
3.2.4. Катехины, лейкоантоцианидины, проантоцианидины 14
3.3. Содержание фенольных соединений в винограде 16
3.3.1. Содержание катехинов и танинов 17
3.3.2. Содержание лейкоантоцианинов 19
3.3.3. Содержание антоцианов 19
3.3.4. Содержание флавонолов 20
3.4. Окислительный стресс. 20
3.4.1. Классификация АФК 20
3.4.2. Функции радикалов кислорода 22
3.4.2.1. Супероксид 22
3.4.2.2. Окись азота 24
3.4.2.3. Действие радикала коэнзим Q 25
3.4.3. Методы изучения свободных радикалов 25
3.4.3.1. Биохимические методы 25
3.4.3.2. Биофизические методы 26
3.4.4. ПОЛ 27
3.4.5. Биологические последствия ПОЛ 28
3.5. Свойства полифенолов красного винограда, определяющие их 29
перспективность для косметики 29
3.5.1. Ингибирование СРО полифенолами красного винограда 29
3.5.2. Определение антиоксидантной активности отдельных компонентов экстракта винограда. Индекс активности антиоксиданта 34
3.5.3. Антиоксидантные свойства полифенолов винограда in vivo 36
3.5.4. Зависимость антиоксидантной активности от структуры полифенолов 37
3.5.5. Зависимость антирадикальной активности от структуры полифенолов 40
3.5.5.1. Использование метода QSAR при анализе антирадиальной активности
флавоноидов 41
3.5.6. Влияние олигомерного проантоцианидина на волокна коллагена 44
3.5.7. Влияние олигомерного проантоцианидина на коллаген и эластин 44
3.5.8. Солнцезащитное действие 45
3.5.9. Противовоспалительное действие 46
3.5.10. Р - Витаминная активность 46
3.5.11. Антимикробные свойства 47
3.5.12. Противопухолевая активность 48
3.5.13. Антимутагенная активность...! 48
3.6. Методы выделения и очистки полифенолов винограда 49
3.6.1. Предварительная очистка субстрата 49
3.6.2. Экстракция 49
3.6.3. Хроматографическая очистка 50
3.6.4. Разделение в двухфазных системах 51
3.7. Стабильность антоцианов 51
3.7.1. Термическая устойчивость антоцианов 51
3.7.2. рН-устойчивость полифенолов 52
3.8. Определение полифенолов винограда 52
3.8.1 Определение суммы полифенолов 52
3.8.2. Определение антоцианов 53
3.8.3. Определение катехинов 53
3.8.4. Определение флавонолов 53
3.8.5. Определение лейкоантоцианидинов 54
3.8.6. Методы качественного определения полифенолов винограда 54
3.9. Применение флавоноидов в косметике 58
3.9.1. Синергизм антиоксидантов 58
4. Обсуждение результатов 60
4.1. Определение полифенолов 61
4.2. Идентификация веществ 63
4.2.1. Определение полифенолов 65
4.3. Технология получения антоцианов из виноградного жмыха 66
4.3.1. Подготовка сырья 66
3.3.1. Подбор экстрагента 66
4.3.1. Поиск оптимального температурного режима 70
4.3.4. Характеристика "Комплекса биофлавоноидов красного винограда" ...71
4.3.5. Дробная экстракция виноградного жмыха 73
4.3.6. Очистка антоцианов с помощью сорбции на тальке 74
4.3.7. Выделение танинов красного винограда 75
4.3.8. Колоночная хроматография полифенолов на силикагеле 75
4.3.9. Осаждение кофейного эфира М-З-г 77
4.3.10. Технологическая схема выделения флавоноидов 77
4.4. Свойства полифенолов винограда 79
4.4.1. Определение антиоксидантной активности регистрацией МА 79
4.4.2. Определение антирадикальной активности по скорости восстановления ДФПГ ; 80
4.4.3. Связь структуры и антирадикальной активности 82
4.4.4. Определение гидрофобности флавоноидов 87
4.4.5. Способность к ингибированию Sacharomyces cerevisiae 88
4.4.6. Защита кожи от УФ-излучения 90
4.4.7. Влияние экстракта красного винограда на набухание эпидермиса 91
4.4.8. Влияние экстракта красного винограда на спонтанную сократительную
активность кровеносных сосудов кожи и связь ее с антиоксидантной активностью 92
4.4.9. Устойчивость антоцианов к окислению в косметических композициях 95
4.4.10. Устойчивость флавоноидов красного винограда при различных рН 96
5. Экспериментальная часть 99
5.1. Материалы и методы 100
5.2. Выделение полифенолов винограда ....101
5.2.1. Подготовка сырья 101
5.2.2. Экстракция 101
5.2.2.1. Подбор растворителя 101
5.2.2.2. Определение оптимального температурного режима экстракции 101
5.2.2.3. Дробная экстракция 101
5.3. Применение хроматографических методов 101
5.3.1. Очистка антоцианов с помощью флэш-хроматографии на тальке ; 101
5.3.2. Сорбция антоцианов на тальке 102
5.3.3. Хроматография антоцианов на силикагеле 102
5.3.4. Определение растворимости антоцианов в хроматографических системах... 102
5.3.5. Разделение антоцианов красного винограда. Разделение антоцианов красного винограда 103
5 5.3.6.Выделение 3',4'-дигидроксифенил 3,4-дигидро-2Н-хромен-3,5,7-триола. 103
5.3.7. Выделение 3,5,7,3',4'-пентагидроксифлавона 104
5.3.8. Выделение 4,,3,5,7-тетрагидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорида 104
5.4. Очистка веществ осаждением 104
5.4.1. Осаждение 3-0-Р-В-глюкозилокси-(6-0-(3,4-дигидроксициннамоил))-4',5,7-
тригидрокси-3',5'-диметоксифлавилиум хлорида 104
5.4.2. Получение 1,3,7-триметилксантана 105
5.5. Определение антоцианов методом ТСХ в сочетании с оптической денситометриеи 105
5.6. Определение редуцирующих веществ по Бренстеду 106
5.7. Определение нелетучих веществ 109
5.8. Определение термической устойчивости антоцианов в кремах 109
5.9. Определение коэффициента распределения флавоноидов в системе октанол-вода 109
5.10. Изучение свойств полученных веществ 109
5.10.1. Определение ПОЛ 109
5.10.2. Определение антирадикальной активности по отношению к ДФПГ 110
5.10.3. Способность антоцианов к ингибированию Sacharomyces cerevisiae ПО
5.10.4. Определение солнцезащитных свойств фракции антоцианов 111
5.10.5. Исследование явлений резонанса кожи при увлажнении и набухании
эпидермиса 111
5.10.6. Исследование вазомоторной активности кожи 112
5.11. Статистическая обработка результатов 112
6. Выводы 115
7. Благодарности 117
8. Список литературы 118
Структура флавоноидов
Виноград - вид пищевых плодов семейства Vitaceae. Основная, в настоящее время используемая, разновидность винограда - Vitis vinifera относится к европейским сортам и составляет до 95% производства винограда [1]. Виноград - богатейший источник флавоноидов, содержащий множество полифенольных соединений. Немецкие ученые [11], анализировавшие красное вино сорта Рислинг с помощью ВЭЖХ обнаружили в нем 73 вещества, относящиеся к фенольным соединениям. К настоящему времени было идентифицировано более 500 полифенолов содержащихся в винограде, причем около 160 из них относятся к сложным эфирам. Состав и количество полифенольных соединений зависит от разновидности виноградников, от погоды, типа почвы, и методов культивирования [12].
Фенолокислоты
В красном винограде содержатся два типа фенолокислот (рис. 3): производные гидроксибензойной и гидроксикоричной кислот. К производным гидроксибензойной кислоты относятся: присутствующая в незначительных количествах салициловая кислота, несколько более распространенные: галловая,протокахетовая и п-гидроксибензойная кислоты. Также в винограде были найдены: ванилиновая, сиреневая, гентизиновая и о-пирокахетовая кислоты. Из гидроксикоричных кислот в винограде наиболее распространены: п-кумариновая, синаповая, кофейная и феруловая кислоты. Красный виноград значительно более богат фенолокислотами чем белый. Большинство фенолокислот содержатся в виде эфиров, которые распадаются при гидролизе.
Кверцетин-3 -глюкозид был обнаружен в белом винограде, позднее были найдены кемпферол, мирицетин и их гликозиды. Основным флавонолом виноградной грозди является кверцетин-3-глюкозид его содержание составляет до 56-58% от общей суммы флавонолов. Флавонолы находятся в красном и белом винограде примерно в равных количествах [13]. 3.2.3. Антоцианы
Цвет ягоды красного винограда также как и многих ягод и цветущих растений обеспечивается антоцианами (рис. 5). Антоцианы - это растворимые в воде гликозиды, обычно D-глюкозиды [2, 13] полигидроксифлавилиумхлорида и их эфиры с производными бензойных и гидроксикоричных кислот. Наиболее распространены сложные эфиры антоцианов ацилированные кумаровой, феруловой, кофейной и уксусной кислотами. Находятся антоцианы в винограде в виде сложных эфиров кумаровой, кофейной или уксусной кислот [13]. По сравнению с флавонолами, система из 8 сопряженных двойных связей флавилиумхлорида приводит к. образованию 8 возможных резонансных структур, что и объясняет многообразие цветовых возможностей этих соединений. Цвет антоцианов зависит не только от характера заместителей, значения рН но также и от образования комплексных соединений с ионами металлов, в том числе и металлов переменной валентности: Са2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+, Mn2+ [2]. Антоцианы сосредоточены в кожице виноградной ягоды, и красный виноград значительно более богат антоцианами, чем белый [13].
Определение полифенолов
Пятна антоцианов плохо различимые на пластинках после ТСХ просматривали под УФ при длине волны 254 нм. Для определения следовых количеств антоцианов пластинки проявляли 20% раствором серной кислоты, используя способность антоцианов к увеличению интенсивности окрашивания при уменьшении рН. Прочие полифенолы на пластинках ТСХ проявляли с помощью следующих реагентов: 1% метанольного раствора треххлористого железа, 5% раствора гидроксида натрия.
При мягком щелочном гидролизе флавоноиды (в данном случае на рис. 21 показаны антоцианидины) образуют окрашенные в синий, фиолетовый или зеленый цвета хиноидные соединения (А), называемые ангидрооснованиями. При дальнейшем действии щелочей или сильном разбавлении раствора ангидрооснование гидратируется, превращаясь в бесцветное карбониевое основание, - псевдооснование (Б).
Танины определяли по реакции с 1% раствором ванилина в 70% серной кислоте. Образующаяся малиновая окраска свидетельствовала о наличии, у исследуемых полифенолов, характерного для танинов, флороглюцинового или резорцинового ядра. Содержание флавонолов определяли спектрофотометрически при 415 нм по реакции реакции с водным FeCb. Калибровочную кривую строили по кверцетину.
При взаимодействии полифенолов с хлоридом железа (III) флавонолы (рутин, кверцетин, кемпферол) образуют комплексы, окрашенные в зеленый цвет (рис. 22), а полифенолы с восстановленной Сг-Сз связью в кольце С: дигидрофлавонолы и катехины образуют комплексы, окрашенные в коричневый цвет (рис. 23).
Для определения неокрашенных веществ, не поглощающих в УФ-области, пластинку проявляли раствором перманганата или обрабатывали 20% серной кислотой с последующим нагреванием.
В ходе работы из жмыха красного винограда нами были выделены и охарактеризованы следующие соединения: 3-0-р-0-глюкозилокси-4 ,5,7-тригидрокси-3 ,5 -диметоксифлавилиум хлорид - М-З-г (I); его кумаровый - 3-0-р-0-глюкозилокси-(6-0-(4-гидроксициннамоил))-4 ,5,7-тригидрокси-3 ,5 -диметоксифлавилиум хлорид (II); кофейный - 3-0-Р-В-глюкозилокси-(6-0-(3,4-дигидроксициннамоил))-4 ,5,7-тригидрокси-3 ,5 -диметоксифлавилиум хлорид (III) эфиры рис. 24, и катехин - 3\4 -дигидроксифенил-3,4-дигидро-2Н-хромен-3,5,7-триол, V (рис. 25).
Также были выделены агликоны, полученные кислотным гидролизом экстракта красного винограда, - мальвидин - 4 ,3,5,7-тетрагидрокси-3 ,5 -диметоксифлавилиум хлорид (IV) и кверцетин - 3,5,7,3 ,4 - пентагидроксифлавон (VI) рис. 25.
Данные УФ-, масс-, и Н-ЯМР-спектров, выделенных нами, веществ соответствовали литературным данным. В спектрах всех выделенных полифенольных соединений присутствуют сигналы протонов фенольных колец в области (6,12 - 9,0 м. д.). Сигнал 8,85-8,95 м. д., соответствует протону Н4 всех производных мальвидина, а пара сигналов 6,8-7,1 м. д. - Н-8 и Н-6 протонам. Симметрично расположенные протоны кольца
64 В: Н-2 и Н-6 проявляются в области 8,0 - 8,05 м. д., а синглетный сигнал двух симметрично расположенных метильных групп в области 3,77-3,90 м. д. Протоны двойной связи коричной кислоты а и Р проявляются в виде двух дублетов соответственно: 6,21 и 7,49 м. д. На спектре кофейного эфира М-З-г кроме сигналов двух протонов кольца В: Н-2" 7,1 м. д. и Н-6" 7,85 м. д. имеется также сигнал 6,65 м. д. принадлежащий протону Н-5". На спектре кумарового эфира М-З-г виден сигнал симметрично расположенных 5" и 3" протонов. Сигналы в области 3,1-5,5 м. д. принадлежат протонам моносахарида. Из литературных данных известно, что в состав антоцианов, как правило, входит глюкоза. Положение сигнала гликозидного протона 5,39-5,42 м. д. и константа расщепления Jj,2 = 7,7 Н. позволяет нам судить о том, что глюкоза находится в P-D-глюкопиранозной форме [116].
Из литературных данных [132] известно, что ацетильные группы - остатки кумаровой, кофейной и феруловой кислот расположены по 6" -гидрокси-группе M-3-r.
Спектр катехина помимо вышеперечисленных сигналов имеет характерный для СНг - группы Н4 протонов мультиплет 2,5 м. д., сигналы протона 3,8 м. д. и гидроксил 4,73 м. д. Кверцетин был идентифицирован по дублетным сигналам Н-2 , Н-5 , Н-6 и Н-8 5 7,65; 6,87; 6,20 и 6,42 м. д. соответственно и дублету дублетов 7,53 м. д. (Н-6 ).
На спектре кофеина полученного из зеленого чая, было видно три сигнала протонов метильных групп (в 1, 3, 7 положениях) на 3,35, 3,55 и 3,95 м. д. и сигнал протона у атома Н-8 7,5 м. д.
Масс-спектры снимали с ионизацией электроспреем и фиксацией положительных ионов. На масс-спектрах строение кумарового эфира М-З-г было подтверждено молекулярным ионом m/z: 639 и двумя его фрагментами: М-З-г с ra/z: 493, образовавшегося после отщепления 4 -гидроксикоричной кислоты [М - О2С9Н7] и мальвидина 331 m/z, появившегося в результате отщепления 4 -гидроксикоричной кислоты и глюкозы [М - О2С9Н7- ОгСбНю] (рис. 26).
Материалы и методы
Экстракт, упаренный в вакууме до постоянной массы Зге содержанием смеси антоцианов 21 мг/г растворяли в 60 мл системы ЭУВ 55:25:25. На колонку, заполненную силикагелем Merck с размером частиц 0,040-0,063 мм и слоем силикагеля 200x25 мм, наносили раствор антоцианов объемом 25 мл. Вещества с колонки элюировали системой БУВ 4:1:1.
Получали: 5 мг 3-0-Р-В-Глюкозилокси-4 ,5,7-тригидрокси-3 ,5 -диметокси-флавилиум хлорида (I). Rf 0,39 (БУВ 4:1:1); УФ-спектр (С2Н5ОН; 0,1% НС1), А , нм (є): 278 (13600), 534 (29200). Н-ЯМР-спектр (ДМСО-De, 5, м. д.): 8,95 (с, Ш, Н-4), 8,05 (с, 2Н, Н-2 ,6 ); 7,10 (уш.с, 1Н, Н-8); 6,95 (уш.с, Ш, Н-6); 3,79 (с, 6Н, 2СН3-3 ,5 ); 5,39 (7,7 Hz) (д, Ш, HI "); 4,10 (м, 1Н, Н-6а" ); 3,95 (м, 1Н, Н-5" ) 3,80 (м, 1Н, Н-бб" ); 3,35 (т, 1Н, Н-2 "); 3,25 (т, Ш, Н-3 "); 3,10 (т, Ш, Н-4 "); Масс-спектр (ESI, 250С), m/z (W, (%)): 493 [М+] (100),331 [М+-С6Н,о05] (37);
4 мг 3 -О-Р -Б-Глюкозилокси-(6-0-(4-гидроксициннамоил))-4 ,5,7-тригидрокси-3 ,5 -диметоксифлавилиум хлорида (II). Rf 0,71 (БУВ 4:1:1); УФ спектр (С2Н5ОН; 0,1% НСІ), Хппх, нм (є): 279 (17900), 544 (28500). Н-ЯМР спектр (ДМСО-Э6, 5, м. д.): 8,95 (с, Ш, Н-4), 8,05 (с, 2Н, H-2 ,6 j; 7,55 (д, 2Н, Н-2", 6"); 7,49 (д, Ш, Н-р); 7,10 (уш.с, Ш, Н-8); 7,0 (д, 2Н, Н-3", 5"); 6,95 (уш.с, Ш, Н-6); 6,21 (д, Ш, Н-а); 3,79 (с, 6Н, 2СН3-3 ,5 ); 5,42 (7,7 Hz) (д, Ш, Н-1" ); 4,35 (м, 1Н, Н-6а" ); 4,15 (м, Ш, Н-5 ") 4,0 (м, 1Н, Н-бб "); 3,55 (т, Ш, Н-2" ); 3,45 (т, Ш, Н-3 "); 3,35 (т, Ш, Н-4" ); Масс-спектр (ESI, 250С), m/z (I, (%)): 639 [М+] (100), 493 [М+ - С9Н702] (17), 331 [М+ - СбН,0О5- С9Н702] (25);
12 мг 3-0-Р-В-Глюкозилокси-(6-0-(3,4-дигидроксициннамоил))-4 ,5,7-три гидрокси-3 ,5 -диметоксифлавилиум хлорида (III). Rf 0,59 (БУВ 4:1:1); УФ-спектр (С2Н5ОН; 0,1% НСІ), Атах, нм (є): 281 (17200), 547 (27400). Н-ЯМР спектр (ZJMCO-D6, 5, м. д.): 8,90 (с, Ш, Н-4), 8,05 (с, 2Н, Н-2 ,6 ); 7,45 (д, Ш, Н-Р); 7,05 (уш.с, Ш, Н-8;, 7,0 (д, Ш, Н-2"); 6,95 (дд, Ш, Н-6"); 6,90 (уш.с, Ш, Н-6); 6,65 (д, Ш, Н-5"); 6,20 (д, 1Н, Н-а); 3,79 (с, 6Н, 2СН3-3 ,5 ); 5,42 (7,7 Hz) (д, Ш, Н-1" ); 4,35 (м, Ш, Н-6а" ); 4,15 (м, Ш, Н-5 ") 4,0 (м, Ш, Н-бб "); 3,55 (т, 1Н, Н-2" ); 3,45 (т, 1Н, Н-3 "); 3,35 (т, Ш, Н-4" ); Масс-спектр (ESI, 250С), m/z (1ота, (%)): 655 [М+] (100), 493 [М+ - С9Н703] (2), 331 [М+ - С6Н10О5 -С9Н703](4).
Выделение 3 ,4 -дигидроксифенил-3,4-дигидро-2Н-хромен-3,5,7-триола (V) Водный раствор смеси танинов объемом 400 мл, полученный после отделения антоцианов упаривали в 8 раз при температуре не выше 45С, экстрагировали 2x100 мл этилацетатом и хроматографировали на силикагеле в системе ЭУВ 70:15:15. Собирали фракцию с Rf 0,83 (ЭУВ 84:8:8) и упаривали ее на роторном испарителе. Получали 27 мг 3 ,4 -дигидроксифенил-3,4-дигидрофлавон-3,5,7-триола (V). УФ-спектр (С2Н5ОН), ХтаХ,нм (є): 280 (17500). Н ЯМР спектр (ДМСО-Б6,5, м. д.): 9,15; 8,90 8,80; 8,75 (с, 4Н, ОН-5,7,3 4 ); 6,75 (д, 1Н, Н-2 ), 6,70 (д, Ш, Н-5 ); 6,58 (дд, Ш, Н-6 ); 5,87 (д, Ш, Н-6); 6,69 (д, Ш, Н-8); 4,85 (д, Ш, ОН); 4,47 (Ш, д, Ш, Н2); 3,85 (Ш м, Н-3); 2,67, (Ш дд, Н-46); 2,45, (Ш дд, Н-4а); Масс-спектр (ESI, 4000 В, 250С), m/z (W (%)): 290 [М+] (100).
Выделение 3,5,7,3 ,4 -пентагидроксифлавона (VI) В водно-спиртовой экстракт винограда объемом 30 мл добавляли 4 мл 12 н. соляной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане в течение 2 ч с обратным холодильником. Полученный гидролизат упаривали, пятикратно экстрагировали смесью этилацетата с этиловым спиртом 8:1 и упаривали. Упаренный экстракт массой 0,3 г хроматографировали на колонке с силикагелем в системе ЭУВ 84:8:8. Собирали фракцию с Rf 0,93 (ЭУВ 84:8:8). Получали 4 мг 3,5,7,3 ,4 -пентагидроксифлавона (VI). УФ-спектр (С2Н5ОН), Хтх, нм (є): 279 (16000), 355 (12000). Н-ЯМР спектр (ДМСО-В6,8, м. д.): 7,65 (1Н д, Н-2 ); 7,53 (1Н дд, Н-6!); 7,87 (Ш д, Н-5 ); 6,42 (Ш, д, Н-8); 7,19 (Ш, д, Н-6). Масс-спектр (ESI, 4000 В, 250С), m/z (U, (%)): 301 [М+] (100). 5.3.8. Выделение 4 ,3,5,7-тетрагидрокси-3 ,5 -диметоксифлавилиум хлорида (IV)
В водно-спиртовой экстракт винограда объемом 25 мл добавляли 4 мл 12 н. соляной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане в течении 2 ч с обратным холодильником. Полученный гидролизат упаривали, пятикратно экстрагировали смесью этилацетата с этиловым спиртом 8:1 и упаривали. Упаренный экстракт массой 0,3 г хроматографировали на колонке с силикагелем в системе ЭУВ 84:8:8. Собирали фракции Rf 0,74 (ЭУВ 84:8:8). Получали 15 мг 4 ,3,5,7-тетрагидрокси-3 ,5 -диметоксифлавилиум хлорида (IV). УФ-спектр (С2Н5ОН), , нм (є): 238 (13000), 525 (32000). Н-ЯМР спектр (ДМСО-Бб, 8, м. д.): 8,85 (с, 1Н, Н-4), 8,05 (с, 2Н, Н-2 ,6 ); 6,95 (уш.с, Ш, Н-8); 6,72 (уш.с, Ш, Н-6); 3,79 (с, 6Н, 2СНЗ-3 ,5 ). Масс спектр (ESI, 4000 В, 250С), m/z (Іотн, (%)): 331 [М+] (100).
