Содержание к диссертации
Введение
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. Плазмиды и фаги 9
1.1. Основные свойства природных плазмид 9
1.2. Свойства бактериофагов 12
2. Векторы для клонирования в бактериях 14
2.1. Общие свойства векторов 15
2.2. Фаговые векторы 17
2.3. Векторы pUC 19
3. Свойства фазмиды N15 21
3.1. Свойства фазмиды N15 и структура ее генома 21
3.1.1. Лизогенная конверсия фазмиды N15 21
3.1.2. Физическая структура плазмидной и фаговой ДНК 22
3.1.3. Структура теломер и их образование 23
3.1.4. Генетическая организация плазмидного генома N15 27
3.1.5. Сравнение последовательностей протеломеразы и интеграз 31
3.2. Репликация линейной плазмиды N15 32
3.2.1. Модели репликации линейных ДНК 32
3.2.2. Механизмы образования теломер 34
3.2.3. Репликация фазмиды N15 36
И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
1. Штаммы бактерий и бактериофагов 41
2. Плазмиды 41
3. Среды 41
4. Общие методы работы с бактериями и бактериофагами 45
5. Транспозонный мутагенез фазмиды N15сЗ 45
6. Транспозонный мутагенез фазмиды N15ts52 46
7. Транспозонный мутагенез мини-плазмиды ршВОб 46
8. Получение вариантов фазмиды N15 с маркером устойчивости к хлорамфениколу 47
9. Стабильность плазмидного состояния мутантов фазмиды N15 47
10. Определение частоты лизогенизации клеток 48
11. Выделение плазмидной ДНК 49
12. Трансформация клеток Е. coli 50
13. Рестрикционный анализ плазмид 51
14. Компьютерный анализ последовательностей 52
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 55
1. Изучение свойств фазмиды N15 как лямбдоидного фага 55
1.1. Сравнительное изучение антигенной активности фазмиды N15 и
лямбдоидных фагов X и ф80 55
1.2. Получение рекомбинантов фазмиды N15 и лямбдоидного фагаф80 57
2. Изучение условно-летальных мутантов фазмиды N15,
дефектных по репликации 59
2.1. Частота образования Su" лизогенов ат-мутантами фага N15 59
2.2. Стабильность плазмидного состояния ts-мутантов фазмиды N15 при непермиссивной температуре 59
2.3. Урожай фаговых частиц условно-летальных мутантов фазмиды N15 на гесА" штаммах при пермиссивных условиях 61
2.4. Картирование условно-летальных мутаций по репликации 61
2.5. Компьютерный анализ продукта rep А гена фазмиды N15 63
3. Получение, характеристика и картирование инсерционных мутаций фазмиды N15 68
3.1. Транспозонный мутагенез фазмиды N15c3 69
3.2. Физическое картирование транспозонных мутаций 71
3.3. Транспозонный мутагенез температурочувствительного мутанта N15ts52 76
3.4. Получение вариантов фазмиды N15 с маркером устойчивости к хлорамфениколу 76
3.5. Транспозонный мутагенез линейной мини-плазмиды N15 78
3.6. Конструирование линейного плазмидного вектора 82
4. Изучение возможности увеличения размера генома N15 при
сохранении инфекционности фага 83
4.1. Получение варианта фазмиды N15, несущего два маркера устойчивости к антибиотикам 84
4.2. Оценка плотности упаковки генетического материала в фаговом капсиде 85
4.3. Получение и свойства рекомбинантной плазмиды N15Cml-pHind4 87
5. Получение свойства и картирование рекомбинантных линейных плазмид N15 с чужеродным репликоном 88
ОБСУЖДЕНИЕ 96
ВЫВОДЫ 104
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 120
Введение к работе
Актуальность проблемы. Развитие современной молекулярной биологии и генетики, успешное секвенирование геномов различных организмов, внедрение методов генной инженерии в разные отрасли биотехнологии и медицины во многом определены созданием многоцелевых векторов для переноса чужеродной генетической информации. На основе ДНК бактериальных плазмид, фагов, вирусов и хромосом микроорганизмов создано большое число кольцевых векторов, в том числе и челночных, различного назначения. Тем не менее, для решения практически каждой новой конкретной фундаментальной или прикладной задачи создаются новые или модифицированные векторы. Однако оказалось, что существующие векторы принципиально не подходят для клонирования некоторых участков геномной ДНК высших эукариотов, для обеспечения безопасного генотерапевтического лечения и получения рекомбинантных фармакопрепаратов высокой чистоты. В связи с этим, актуальным является изучение линейных природных форм ДНК для создания на их основе векторов нового типа. Особый интерес представляет исследование свойств генома уникальной природной фазмиды N15, сочетающей свойства плазмиды и фага (Равин, 1967). Геном профага N15 представлен плазмидной линейной молекулой ДНК с ковалентно замкнутыми теломероподобными концами (Рыбчин и Сварчевский, 1984). Эти свойства фазмиды N15 позволяют рассматривать ее как объект для создания на его основе фагового и линейного плазмидного вектора. Решение этой актуальной проблемы предусматривает исследование генома фазмиды N15, экспрессии генов, контролирующих развитие фага, структурных особенностей фаговых частиц, определение допустимого объема вносимой генетической информации, возможности совмещать полезные свойства фазмиды N15 и других фаговых и плазмидных векторов путем создания их гибридов. Настоящая работа посвящена изучению фага N15 в качестве потенциального вектора.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении роли различных участков генома фазмиды N15, существенных для литического развития фага N15 и поддержания состояния профага в виде линейной плазмиды.
Для достижения поставленной цели были намечены следующие задачи: - определить области функциональной гомологии фазмиды N15 и лямбдоидных бактериофагов; - идентифицировать условно-летальные мутации по репликации фага N15 и картировать их положение в геноме методом спасения маркера на штаммах Е. coli, несущих плазмиды с клонированными фрагментами гер-области; - получить инсерционные мутанты фазмиды N15 и с помощью рестрикционного анализа определить их положение на плазмидной ДНК; - оценить емкость природной головки фага N15 и определить возможный размер чужеродной ДНК в составе генома N15, не нарушающий формирование фаговых частиц; - на основе фазмиды N15 создать модель линейного плазмидного вектора, несущего чужеродный репликон.
Научная новизна.
Продемонстрирована функциональная гомология фазмиды N15 и лямбдоидного фага ф80 в области поздних генов и серологическое родство этих фагов.
Генетическими методами показано, что мутации, локализованные в области гена rep А фазмиды N15, одновременно приводят к нарушению репликации, специфической для литического цикла
7 развития фага, и к нарушению поддержания состояния плазмидного профага (репликации плазмиды).
Методом рестрикционного анализа инсерционных мутантов фазмиды N15 идентифицированы области генома, существенные и несущественные для вегетативного развития фага, а также картирован ген лизогенной конверсии.
Показано, что значительное увеличение длины генома фага N15 не оказывает влияния на его способность к вегетативному развитию.
Чужеродный мультикопийный репликон СоІЕІ в составе ДНК фазмиды N15 с инактивированным геном г ер К обеспечивает репликацию линейной плазмиды.
Научно-практическое значение. Результаты, полученные в работе: - картирование в геноме фазмиды N15 протяженных участков, несущественных для вегетативного развития фага и/или для поддержания плазмидного состояния профага, - демонстрация возможности значительно увеличивать длину ДНК, упаковываемую в головку фага, и
3 -замена собственного низкокопийного репликона линейной плазмиды N15 на чужеродный мультикопийный репликон, позволяют рассматривать фазмиду N15 в качестве основы для создания: а) фагового вектора большой емкости, пригодного для клонирования хромосомной ДНК с протяженными участками аномальной структуры (палиндромами), б) вектора, не содержащего потенциально опасных для здоровья человека последовательностей, и, следовательно, перспективного для использования в генотерапии, в) челночного линейного вектора.
8 Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Фаг N15 относится к группе лямбдоидных бактериофагов.
2. itepA-область генома фазмиды N15 контролирует репликацию ДНК как в лизогенном состоянии (в линейной форме), так и при литическом развитии (в кольцевой форме).
3. Области генома фага N15 с координатами на линейной плазмидной карте 11,0-15,2 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) и 41,2-41,4 т.п.н. (ген лизогенной конверсии) являются несущественными ни для плазмидных, ни для фаговых свойств фазмиды.
Область, существенную для литического развития, составляют протяженные районы структурных генов и участок с координатами 10,09-10,86 т.п.н., включающий ген Q, регулирующий литическое развитие фага.
Участки генома, существенные для стабильного поддержания плазмидного состояния, расположены в координатах 0-10,1 т.п.н. плазмидной карты N15 и в области, правее координаты 43,44 т.п.н., и составляют около 30% длины ДНК фазмиды.
Фаг N15 сохраняет способность к вегетативному развитию при увеличении длины его генома, по крайней мере, на 16% по сравнению с природной фаговой ДНК.
Чужеродный мультикопийный репликон кольцевых плазмидных векторов в составе ДНК дефектной фазмиды N15 осуществляет репликацию линейной ДНК с ковалентно замкнутыми теломероподобными концами.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на симпозиумах по молекулярной генетики бактерий и бактериофагов, "Cold Spring Harbor", Нью-Йорк, 1993 и 1995 гг., а также на II Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, февраль 2000 г.). Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (№ 97-04-48770), МО РФ (97-01-70.0.99 и INTASN96-1492.
Плазмиды и фаги
Плазмиды определяют как стабильно наследуемые внехромосомные генетические элементы. Они являются обычным компонентом бактериальных клеток, но встречаются также и у низших эукариотов. В большинстве случаев плазмиды представляют собой ковалентно-замкнутые кольцевые молекулы ДНК длиной от 2 до 600 тпн. Благодаря кольцевой структуре они не подвергаются действию экзонуклеаз. Существуют также линейные плазмиды, устойчивость которых к действию экзонуклеаз обеспечивается тем, что концы нитей их ДНК защищены белками или соединяются ковалентно (Hinnebusch J. and Tilly К., 1993).
Плазмиды обладают рядом общих свойств. Так, они способны автономно реплицироваться, переносить гены, стабильно сохраняться в клетках, способствовать элиминации других плазмид, придавать клетке новые фенотипические черты, способствующие ее выживанию. Основным свойством является способность плазмид к автономной репликации. Молекулы ДНК приобретают ее в том случае, если в них имеется сайт начала репликации — ori (origin - начало) и, как правило, набор генов, необходимых для ее осуществления. Такие молекулы получили название репликонов. Плазмидные ДНК могут иметь по несколько огг -сайтов. Репликоны функционируют лишь тогда, когда в клетках есть все необходимые для этого ферменты. В большинстве случаев кольцевые плазмиды граммотрицательных бактерий реплицируются однонаправленно в тета-форме (Харди, 1990).
Минимальный размер плазмид со строгим контролем репликации 20 -30 т.п.н., а максимальный — на порядок больше. Плазмиды с ослабленным контролем репликации обычно невелики по размеру — не более 15-30 т.п.н. Строгость контроля репликации плазмид заключается в наличии у них механизма ограничения числа копий до 1 - 3 молекул на клетку. При этом репликация кольцевых плазмид осуществляется, как правило, клеточными репликативными комплексами. В клетках Е. coli хромосомный огі-сайт (oriC) содержит четыре 9-членных dnaA-бокса (консенсус ТТАТ(С/А) СА(С/А)), с которыми связывается белок DnaA. Он "плавит" структуру ДНК в огі-сайте и при содействии белка DnaC способствует посадке на этот сайт геликазы DnaB. Образовавшийся комплекс распознается праймазой DnaG и ДНК-полимеразой III (Romberg and Baker, 1992), что инициирует движение репликационных вилок в обоих направлениях. Плазмиды Е. coli со строгим контролем репликации используют все вышеперечисленные белки, включая инициаторный белок DnaA, для которого в их orz -сайтах имеются dnaA-боксы. Но основную роль в инициации репликации играют собственные инициаторные белки (і?ер-белки), узнающие в плазмидных оп -сайтах специфические множественные прямые повторы. Плазмиды Е. coli с ослабленным контролем репликации для инициации репликации используют РНК-полимеразу и ДНК-полимеразу I. Элонгацию ведет ДНК-полимераза III. В .каждой бактериальной клетке содержится в среднем 40 - 50 плазмидных копий, такие плазмиды называют мультикопийными. Разница между строгим и ослабленным контролем особенно заметна, когда клетки переходят из экспоненциальной в стационарную фазу роста, а также при остановке синтеза белка (например, в присутствии хлорамфеникола). При этом плазмиды со строгим контролем и бактериальная хромосома перестают реплицироваться, в то время как плазмиды с ослабленным контролем продолжают дупликацию, и их масса в клетке может достигать массы бактериальной ДНК (Харди, 1990).
Плазмиды способны переносить гены между клетками при конъюгации с помощью механизмов, по своему устройству сходных у разных видов (Девисега/., 1984).
Одним из свойств плазмид является свойство несовместимости, которое обусловлено подавлением репликации одной из них и (или) блокированием распределения дочерних молекул ДНК по клеткам перед их делением. Оба механизма действуют независимо друг от друга (там же).
Стабильность плазмид обеспечивается несколькими механизмами: контролем числа копий, точным распределением молекул ДНК по дочерним клеткам, разрешением коинтегратов, а также постсегрегационной гибелью бесплазмидных клеток (Austin and Nordstrom, 1989).
Общие свойства векторов
Для эффективного выполнения своей функции вектор должен отвечать определенным требованиям: быть репликоном, чтобы стабильно существовать в клетке; иметь селективный маркер, позволяющий отбирать трансформированные вектором клетки; иметь, по крайней мере, один единичный сайт рестрикции для внедрения в него чужеродной ДНК (сайт клонирования).
Наиболее подходящие кандидаты на роль векторов - естественные репликоны небольших размеров: ДНК плазмид и вирусов (в том числе и фагов), но непосредственно в этом качестве их используют редко. Обычно их предварительно модифицируют или комбинируют их части для того, чтобы они отвечали „ конкретным требованиям. Самые распространенные плазмидные векторы клеток Е. coli — плазмида pBR322 и ее специализированные производные (Hardy, 1993). Для этих же клеток сконструированы фаговые векторы на основе ДНК фага X (Williams and Blattner, 1980). По происхождению ДНК векторы делят на плазмидные (существуют в клетке и вне ее только в виде молекул ДНК) и фаговые (существуют в виде молекул ДНК и вирионов), а также гибридные векторы (Donaghue and Sharp, 1978). По структуре ДНК различают кольцевые и линейные векторы. По способу поддержания в клетке выделяют автономные (реплицируются самостоятельно) и интегративные (реплицируются в составе клеточной хромосомы) векторы. По числу молекул в клетке векторы могут быть малокопийными (несколько копий) и мультикопийными (десятки копий). По числу репликаторов, имеющихся в векторном геноме, векторы делят на моно- и бирепликонные (бирепликонные векторы называют также челночными, если они могут реплицироваться в клетках различных видов) (Рыбчин, 1999).
Большинство разработанных векторов носит специализированный характер, т. е. их приспосабливают для решения узкого круга задач. Например, векторы, предназначенные для экспрессии генов, содержат около сайтов клонирования мощные промоторы. Малокопийные векторы позволяют изучать, например, механизмы регуляции клонируемых генов, а мультикопийные способны умножать (амплифицировать) их число в сотни и тысячи раз. Разработаны векторы для секвенирования нуклеотидных последовательностей и для поиска в них регуляторных сигналов -промоторов, терминаторов транскрипции, антитерминаторов и т. д. Векторы прямой селекции позволяют выживать только таким трансформантам, которые содержат рекомбинантную ДНК. Сконструированы векторы, имеющие широкий круг клеток-реципиентов. Векторы, как правило, создают такими, чтобы они могли нарабатываться в препаративных количествах. Это достигается использованием при их конструировании репликаторов мультикопийных плазмид или фагов с высокой продуктивностью (фаг X и нитевидные фаги), позволяющих получать от нескольких десятков до тысячи векторных молекул на клетку (Collins et al, 1978). Выбор вектора -плазмидного или фагового - определяется целью клонирования и условиями генно-инженерного эксперимента.
Размер плазмидных векторов, как правило, невелик - несколько тысяч пар нуклеотидов, их карты рестрикции относительно просты, что увеличивает вероятность наличия в них единичных сайтов узнавания рестриктаз и значительно облегчает картирование клонируемых фрагментов. Кроме того, такие молекулы ДНК более устойчивы к повреждениям при манипулировании ими in vitro. Как правило, они мультикопийны, поэтому существует большая вероятность обнаружения рекомбинантной ДНК с помощью радиоактивных зондов в процедуре скрининга методом гибридизации (Hardy, 1993). По этим причинам плазмидные векторы используют для клонирования небольших фрагментов ДНК (размер рекомбинантной ДНК обычно не превышает 10-15 т.п.н.).
Клонирование больших (50 - 100 т.п.н. и более) фрагментов ДНК -важная проблема, поскольку при этом существенно облегчается создание геномных библиотек, а, во-вторых, создается возможность функционального анализа полных больших хромосомных генов эукариотов, достигающих нескольких сотен т.п.н. Поэтому постоянно ищутся пути создания емких векторов. Возможно, при клонировании больших фрагментов ДНК линейные векторы обладают преимуществом перед кольцевыми векторами, так как эффективность образования рекомбинантной ДНК в этом случае выше (Yankovsky et aL, 1989).
Свойства фазмиды N15 и структура ее генома
Для необратимой адсорбции, N15, так же как и бактериофаги ф80, ТІ и Т5, нуждается в мультифункциональном FhuA (ранее называвшемся ТопА) белке-рецепторе во внешней мембране (Vostrov et ah, 1996). Лизогены N15 не способны адсорбировать бактериофаги N15, ТІ и ф80 (Равин и Голуб, 1967). В этом отношении, они похожи на лизогены ф80 (Козырев и другие, 1982). Эта лизогенная конверсия зависит от гена cor (Малинин и другие, 1993), который является гомологичным гену ф80 с подобной функцией. В отличие от лизогенов ф80, заметная потеря адсорбционной способности у бактериальных клеток, лизогенных по фагу N15, наблюдается уже через 5-10 минут после инфекции и становится полной к 25-й минуте. С помощью анализа в системе миниклеток определен молекулярный вес Cor белка (7-9 кДа). Показано, что он может взаимодействовать непосредственно с FhuA белком или опосредованно через ТопВ белок (Vostrov et ai, 1996).
. Физическая структура плазмидной и фаговой ДНК N15 Физическое картирование фаговой и плазмидной ДНК N15 показало, что оба типа молекул ДНК линейны; их карты циклически пермутированы; и размер обоих типов молекул ДНК - 46 363 т.п.н. (Сварчевский и Рыбчин, 1984а). Эти данные были подтверждены при сравнении последовательностей теломер профага (Малинин и другие, 1992) и результатов полного секвенирования зрелого генома фага N15 (46 375 п.н., GenBank, ас. п. AF064539).
Показано, что оба концевых рестрикционных фрагмента плазмидной ДНК N15, в отличие от внутренних фрагментов, после тепловой денатурации ренатурируют с высокой скоростью. Обработка проназой не влияет на скорость ренатурации. Однако после обработки нуклеазой S1, которая, как известно, разрезает однонитевую ДНК концевые фрагменты не ренатурируют. Наблюдения позволили придти к заключению, что концы линейного плазмидного профага N15 - ковалентно-замкнутые шпильки (Сварчевский и Рыбчин, 1984).
Концы профага, образующие шпильки, были названы теломерами и обозначены telL и telR. Первым примером структуры ДНК этого вида была ДНК шссш/а-вируса (Geshelin and Bems, 1974); N15 - первый пример этого вида структуры для прокариотической ДНК. В дальнейшем линейные плазмиды с ковалентно-замкнутыми концами были обнаружены в таких организмах, как поксивирусы, вирус лихорадки Африканской свиньи, вирусы Хлореллы, некоторые митохондриальные и пластидные ДНК, хромосомные и линейные плазмиды бактерий из рода Borrelia (Barbour and Garon, 1987; Casjens, 1999; Nosec et ai, 1998; Wolff and Alterbuchner, 2000).
Зрелая фаговая ДНК N15, подобно зрелой ДНК фага лямбда, имеет однонитевые липкие концы, обозначаемые cosL и cosR; 10 из 12 нуклеотидов которых идентичены таковым в соя-сайте К (Равин Н. и др., 1998). Место соединения фаговых липких концов (casRL сайт) соответствует положению 21.6 т.п.н. на физической карте плазмидной ДНК (см. рис. 5). Место соединения концов плазмидной ДНК (сайт telKL) расположено в положении 24.8 т.п.н. на карте фаговой ДНК (Rybchin and Svarchevsky, 1999).
