Введение к работе
Актуальность темы, Циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТ-аза, 1,4-а-0-глгокан-4-а-(1,4-а-глюкано)-трансфераза, К.Ф. 2.4.1.19) представляет собой уникальный фермент микробного происхождения, катализирующий одновременно такие реакции, как циклизация (превращение крахмала и родственных а-1,4-глюканов в циклодекстрины путем реакции трансгликозилирования), объединение (присоединение коротких а-1,4-глюкопиранозных цепочек к раскрытому кольцу циклодекстрина), дисп-ропорционирование и гидролиз крахмала и образуемых циклодекстри-нов (ЦД) до мальтоолигосахаридов. Образующиеся макроциклические олигосахаридные гомологи различаются по количеству остатков a-D-глю-копиранозы (6, 7 и 8) и, соответственно, обозначаются как а-, 0- и у-1Щ. Благодаря исключительной способности к образованию комплексов включений с органическими и неорганическими соединениями ЦД широко используются в различных областях практической деятельности человека, в частности, в медицине и фармакологии, пищевой промышленности, косметологии и экологии. Этот факт обусловливает повышенный интерес к вопросам их многотоннажного производства. Наибольший интерес представляет [3-ЦД, проявляющий самые высокие и универсальные комплек-сообразующие свойства.
В целом, технология получения ЦД состоит из следующих этапов:
Культивирование микроорганизма, продуцирующего ЦГТ-азу;
Выделение и очистка фермента;
Ферментативная конверсия крахмала до ЦД;
Очистка индивидуальных ЦД (а-, р- и у-) до кристаллического состояния из реакционной среды.
В настоящее время промышленным способом получения ЦД является энзи-матический гидролиз а-1,4-глюканов и родственных полисахаридов ЦГТ-азой. Большинство ЦГТ-аз катализируют образование всех трех ЦД одновременно, однако они различаются по количеству и типу продуцируемых циклических молекул. В соответствии с преобладанием какого-либо одного гомолога ЦГТ-азы подразделяются на (a-), ((5-) и (у-) специфичные.
В связи с тем, что в настоящее время целый ряд ферментных предприятий оказался за рубежом (Эстония, Литва, Украина, Армения), суммировать научные достижения в области производства ЦГТ-аз и технологии ЦД оказалось достаточно сложным. Поэтому продолжение исследований в этой области является актуальной проблемой для России не только в теоретическом плане, но имеет также и большое практическое значение.
Для решения этих задач необходимо продолжать активный поиск новых продуцентов ЦГТ-аз, разрабатывать рациональные схемы выделе-
ния и очистки специфических ЦГТ-аз, определять их физико-химические параметры, а также работать над совершенствованием технологии получения ЦД. Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков совокупность хроматографических методов представляет собой наиболее эффективные и перспективные приемы получения высокоочищенных биологических препаратов, в том числе и ферментов.
Также, в связи с тем, что с каждым годом области применения цикло-декстринов расширяются, актуальным представляется поиск возможностей создания с этими циклическими молекулами новых комплексов включения, в частности с лекарственными препаратами стероидной природы.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разработка рациональной схемы выделения и очистки циклодекстринглкжа-нотрансферазы, изучение ее свойств, получение модифицированных р-циклодекстринов и комплексов включения на их основе.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
скрининг микроорганизмов рода Bacillus с целью отбора штамма, обладающего максимальной активностью р-ЦГТазы;
разработка способов выделения и очистки Р-ЦГТ-азы из Bacillus sp. 1070.
определение физико-химических свойств очищенного фермента;
гидролиз крахмала очищенной ГЗ-ЦГТ-азой с целью получения Р-ЦД;
получение комплексов включения с модифицированным Р-ЦД.
Научная новизна. Разработана оригинальная схема выделения и очист
ки Р-специфичной ЦГТ-азы из Bacillus sp. 1070 с помощью новейших хрома
тографических методов, включающих аффинную и металлохелат аффин
ную хроматографию. Определены основные физико-химические характе
ристики ее ферментативной активности.
Разработана модельная схема получения Р-ЦД с помощью выделенного фермента р-ЦГТ-азы и впервые продемонстрировано, что содержание целевого продукта (Р-ЦД) при гидролизе субстрата очищенной ЦГТ-азой в отсутствии других амилолитических ферментов (а- и р-амилазы, пуллулана-зы, глюкоамилазы) составляет около 90%. Причем общая степень конверсии субстрата оказалась не ниже 95%.
Синтезированы полимерные производные Р-ЦД, полученного по предложенной схеме: сополимер р-ЦД с эпихлорщцрином и коньюгат р-ЦД с низкомолекулярным хитозаном. Показано улучшение растворимости лекарственных препаратов стероидной природы в присутствии этих производных по сравнению с не модифицированным р-ЦД. Возможно применение этих производных для интенсификации процесса биотрансформации стероидов.
Практическая ценность работы. Установлено, что разработанные хро-матографические схемы очистки р^-ЦГТ-азы просты в исполнении и эффективны, поскольку исключают некоторые нетехнологичные стадии, часто используемые при ее получении. Чистота выделенного фермента составляет не менее 95% по данным электрофореза в денатурирующих условиях.
Для выделенной ЦГТ-азы определены основные физико-химические характеристики ее ферментативной активности и подобраны оптимальные условия проведения гидролиза крахмала с целью получения р-ЦД.
Получен акт о наработке в лабораторных условиях очищенного фермента циклодекстринглюканотрансферазы из Bacillus sp 1070, модифицированных fj-циклодекстринов и получении комплексов включения на их основе.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены на:
Международной конференции "Биокатализ-98" (Пущино, 1998);
Школе молодых ученых "Биосенсоры" (Marciana Marina, Italy, 1999);
V Международной конференции "Новые перспективы в исследовании хитина ихитозана" (Москва-Щелково, 1999);
Межотраслевой конференции "Продукты питания - третье тысячелетие" (Москва, 1999);
Международной конференции "Биокатализ-2000" (Москва, 2000).
Публикации. По результатам исследования опубликовано 2 тезиса и
