Содержание к диссертации
Введение
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
1.1 Хитин 8
1.2 Хитозан 11
1.2.1 Низкомолекулярный хитозан 13
1.3 Получение низкомолекулярного хитозана 14
1.3.1 Химический способ 14
1.3.2 Физический способ 15
1.3.3 Ферментативный способ 16
1.3.3.1 Хитиназы 19
1.3.3.2 Хитозаназы 22
1.3.3.3 Неспецифическое действие ферментов 24
1.4 Антибактериальная активность хитозана 25
1.4.1 Механизм антибактериального действия хитозана 33
1.5 Применение хитозана 40
Заключение 42
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 43
2.1 Материалы и методы 43
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 56
3.1 Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана 56
3.1.1 Отбор штамма - продуцента хитинолитических ферментов 56
3.1.2 Подбор индуктора синтеза ферментов с высокой хитинолитической активностью 57
3.1.3 Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана 63
3.2 исследование антибактериальных свойств низкомолекулярного водорастворимого хитозана 64
3.2 Л Подбор концентрации хитозана 64
3.2.2 Исследование зависимости процента гибели бактериальных клеток от Mv хитозана 65
3.2.3 Исследование зависимости процента гибели бактериальных клеток от времени взаимодействия их схитозаном 71
3.2.4 Определение прочности связывания хитозана с бактериальными клетками 72
3.2.5 Изучение влияния рН на взаимодействие хитозана с бактериальными клетками 75
3.2.6 Изучение влияния СД на антибактериальную активность хитозана 76
3.2.7 Определение МИК хитозана 78
3.2.8 Исследование антибактериальных свойств хитозана, полученного химическим гидролизом 81
3.2.9. Исследование антибактериальных свойств хитозана с отрицательным зарядом 85
3.2.10 Изучение антибактериального воздействия хитозана на клетки В. subtilis с помощью атомно-силовой микроскопии 87
3.2.11 Исследование содержания АТФ в клетках В. subtilis, обработанных хитозаном 98
3.2.12 Изучение антибактериального воздействия хитозана на клетки KL pneumoniae и S. aureus с помощью трансмиссионной электронной микроскопии 99
Заключение 108
ВЫВОДЫ 112
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 114
Введение к работе
Хитин и хитозан, а также производные этих полисахаридов считаются перспективными биоматериалами будущего. По некоторым оценкам, предполагаемый объем производства изделий из этих биополимеров в 2005 году составит на сумму около 2 млрд. долларов, из которых 75% будет использовано в крупнейших отраслях промышленности, таких как -пищевая, медицинская, косметическая, сельское хозяйство, а также в биотехнологии. Уникальная структура хитозана обуславливает проявление целого ряда полезных свойств этого полисахарида, основными из которых являются - гипоаллергенность, биодеградируемость, биосовместимость, способность к пленко- и волокнообразованию, а также широкие антимикробные свойства.
Актуальность темы. Исследование антибактериальных свойств биополимеров является актуальной задачей на сегодняшний день. По данным многих исследователей хитозан обладает достаточно выраженными антибактериальными свойствами, однако, в основном, исследования проводились с высокомолекулярными препаратами хитозана, растворимыми в слабокислых растворах, в то время как антибактериальные свойства низкомолекулярного хитозана практически не изучались. Исследование антибактериальных свойств ферментативно полученных водорастворимых препаратов с низкой молекулярной массой и сравнение их с действием высокомолекулярных на примере целой группы микроорганизмов, в том числе и патогенных, позволит провести сравнительный анализ и сделать некоторые обобщения практического характера, в том числе и о перспективности направления, связанного с ферментативным получением низкомолекулярного хитозана и его использованием в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, косметической и пищевой промышленности.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось получение низкомолекулярных водорастворимых препаратов хитозана путем ферментативного гидролиза и изучение их антибактериальных свойств. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
получить культуральную жидкость Streptomyces kurssanovii с высокой хитиназной активностью
получить препараты низкомолекулярного водорастворимого хитозана и исследовать их физико-химические свойства
изучить антибактериальные свойства препаратов хитозана на примере грамположительных, грам отрицательных бактерий и грибах рода Candida
4. изучить механизм действия хитозана на бактериальные клетки
Научная новизна работы.
1. Показано, что основными факторами, влияющими на
антибактериальные свойства хитозана, являются его степень
дезацетилирования и молекулярная масса. Водорастворимый хитозан с
низкой молекулярной массой обладает наибольшей активностью. С
увеличением молекулярной массы антибактериальный эффект хитозана
снижается.
Показано, что с увеличением степени дезацетилирования возрастает и антибактериальное действие препаратов хитозана.
Установлена прямая зависимость гибели бактериальных клеток от времени взаимодействия их с хитозаном.
4. Методами трансмиссионной электронной и атомно-силовой
микроскопии были исследованы морфологические изменения бактериальных
клеток, в том числе патогенных микроорганизмов, после их обработки
хитозаном.
5. Предложены механизмы антибактериального действия
низкомолекулярного водораствормого хитозана на грамположительные и
грамотрицательные микроорганизмы.
Показано, что взаимодействие хитозана с бактериальными клетками приводит к деструкции поверхностных структур бактерий, дезорганизации цитоплазматического матрикса и нуклеоида.
Показано, что после обработки клеток хитозаном в них происходит резкое снижение содержания внутриклеточного АТФ.
Практическая значимость. Установлено, что полученные
ферментативным гидролизом препараты низкомолекулярного
водорастворимого хитозана обладают выраженными антибактериальными свойствами, вызывая практически полную гибель всех исследуемых микроорганизмов.
Показано, что низкомолекулярный хитозан вызывает гибель клеток Agrobacterium tumefaciens. Данный результат может иметь практическое значение для борьбы с бактериальным раком винограда, плодовых, кустарников и других двудольных растений, которые поражаются А, tumefaciens, что наносит большой вред сельскому хозяйству.
Важный результат получен при действии хитозана на клинические
штаммы микроорганизмов Candida albicans, Klebsiella pneumoniae и
Staphylococcus aureus. Так, культура С. albicans оказалась чувствительной ко
всем изученным препаратам крабового и пчелиного хитозана.
Следовательно, низкомолекулярный хитозан можно рекомендовать для
борьбы с кандидозной инфекцией, которая на сегодняшний день является
распространенным заболеванием. Кроме того, препараты
низкомолекулярного хитозана вызывали гибель культур Ю. pneumoniae и S, aureus.
Таким образом, можно рекомендовать использование низкомолекулярных водорастворимых препаратов хитозана в качестве антибактериального средства в медицинской, пищевой, косметической промышленности, ветеринарии и сельском хозяйстве.
Апробация результатов. Основные результаты работы были представлены на 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология -
6
состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), VII-ой Международной
конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и
хитозана» (Санкт-Петербург — Репино, 2003), 5-ой Международной
конференции «Фитотерапия, биологически активные вещества естественного
происхождения» (Черноголовка, 2004), 6-th Asia-Pacific Chitin and Chitosan
Symposium (Singapore, 2004), 9-ой Международной Пущинской школе-
конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005),
ХШ-ой Международной научной конференции «Ферменты
микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи (3 статьи в печати).
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 202 ссылки, из которых 52 на русском языке. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста и содержит 20 рисунков и 8 таблиц.
Хитин
Хитин (пол и-N-ацетил-p-D-глюкозамин) является высокоупорядоченным, кристаллическим р-гликапом, одним из наиболее распространенных полисахаридов в природе:
Хитин входит в состав КС грибов, бактерий, является основным структурным компонентом дрожжей, одноклеточных водорослей и простейших (1-4). Помимо этого он присутствует у ряда реснитчатых, в оболочке яиц гельминтов, в гладиусе кальмара (5), в Entamoeba invadem -кишечном паразите змей (1), у кольчатых червей, моллюсков, кишечнополостных (5) и др. Известно так же, что грибы помимо хитина содержат и его дезацетилированное производное - хитозан (3-4),
Хитин относится к важнейшим возобновляемым веществам в биосфере. Ежегодно в биосфере образуется около 1010-10п тонн хитина (6).
Несмотря на разнообразие природных источников содержащих хитин, для его получения, в основном, используют крабов и ракообразных, так как объем отходов производства пищевой продукции из крабов является наиболее массовым источником хитина (5).
В организмах насекомых и ракообразных, клетках грибов и диатомовых водорослей хитин в комплексе с минеральными веществами, белками и меланинами образует внешний скелет и внутренние опорные структуры (2).
Хитин является структурным аналогом целлюлозы. Основным отличием между ними служат характерные для хитина аминоацильные
группы. Наличие в молекуле ацетамидных групп при С-2 атоме в гексозных звеньях полимерной цепи придает этому аминополисахариду ряд особых структурных, физических и химических свойств (7).
Хитин нерастворим в воде, разбавленных кислотах, щелочах, спиртах и других органических растворителях. Он растворим в концентрированных растворах соляной, серной, муравьиной кислот, а также в некоторых солевых растворах при нагревании, но при растворении он заметно деполимеризуется.
Хитин, полученный из различных источников, отличается по своим физико-химическим свойствам: степени кристалличности, ММ, что влияет на сорбционные и флоккулянтные свойства.
Известно, что хитин существует в трех полиморфных формах, отличающихся расположением молекулярных цепей внутри кристаллической решетки. В природе получила распространение форма а-хитина (2). р-хитин синтезируют лишь некоторые низшие животные и водоросли. Последний также является высокоупорядоченным полисахаридом, как и сс-хитин. сс-хитин представляет собой плотно упакованный полимер, в котором цепочки располагаются антипараллельно, он характеризуется самым стабильным состоянием. В ]3-хитине цепочки располагаются параллельно относительно друг друга и направлены в одну сторону. В коконах жуков Ptinus tectus и Phynchaenus fagi найдена также третья форма хитина - у-хитин, в котором на две параллельно направленные цепи приходится одна, направленная в обратную сторону (8):- и у-хитины, под действием кислот, могут превращаться в а-хитин
Структурный компонент хитина GlcNAc у бактерий, наряду с N-ацетилмурамовой кислотой, является компонентом КС. В животном мире GlcNAc входит в состав мукополисахаридов (гликозаминогликаны) соединительной ткани (гиалуроновоЙ кислоты, хондроитинсульфатов, гепарина), групповых веществ крови и других гликопротеинов. Остаток GlcNAc обычно находится на восстанавливающем конце углеводных цепей животных гликопротеинов, образуя связь углевод-белок.
В панцирях ракообразных макромолекулы хитина находятся в виде хаотично переплетенных и плотно упакованных микро фибрилл. В КС многих грибов также содержится хитин. Содержание его достаточно высокое - до 60% от веса КС (9). В КС грибов микрофибриллы расположены более рыхло в виде пространственной решетки, а промежутки между ними заполнены глюканами, обладающими высокой проницаемостью для водных растворов (10). Известно, что именно среди высших грибов встречаются виды с уникально высоким содержанием хитина. Как и у членистоногих, в грибах хитин находят в а-форме.
Помимо хитина КС грибов содержит ХГК, состоящий из ковалентно связанных полисахаридов хитина и (1- 3,1— 6)-Р-0-глюкана, которые относятся к скелетным полисахаридам и определяют форму и устойчивость КС и морфологические свойства клетки. Соотношение между хитином и глюканом изменяется не только в зависимости от источника, но и от условий культивирования гриба одного вида. Вероятно, ХГК является разветвленным полисахаридом переменного состава, в котором основной цепью является хитин, а боковыми цепями глюкан (в случае, если содержание хитина больше) и наоборот, основная цепь - глюкан, боковые - хитин, если в составе превалирует глюкан. Последнее строго доказано для ХГК из Saccharomyces cerevisae (11).
Материалы и методы
Исследования антибактериальной активности низкомолекулярного хитозана проводили на следующих микроорганизмах: Bacillus subtilis ВКПМ В-7540, Pseudomonas aureofaciens ВКПМ В-7542, Enterobacter agglomerans ВКПМ В-7541, Candida kruisei ВКПМ Y-2594; Bifidobacterium bifidum 791 -коммерческий штамм (предоставлен ЗАО «Экополис», г. Ковров), полученный по новой технологии, предусматривающей аэробное выращивание (149); Escherichia coli ATCC 5945, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Klebsiella pneumoniae ATCC 5057, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Proteus mirabilis ATCC 47, Lactobacillus plantarum ATCC 8014, Bifidobacterium bifidum ATCC 14893, Candida albicans ATCC 885-653, Agrobacterium tumefaciens 1Д1 ATCC 15955, Agrobacterium tumefaciens 1Д1 498, Agrobacterium tumefaciens C-58.
Для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) были использованы штаммы микроорганизмов из коллекции ATCC: Е. coli, S. aureus, Kl, pneumoniae, Ps, aeruginosa, Pr. mirabilis, L. plantarum, B. bifidum, С albicans. Питательные среды и условия культивирования; Овсяная среда: геркулес — 2%; агар - 2%. Овсяная среда с коллоидным хитином: геркулес - 2%; агар - 2%; коллоидный хитин- 10 мг/мл. Среда Чигалейчика с коллоидным хитином: К2НРО4 3 Н20 — 4 г/л; MgS04 7 Н20 - 0,9 г/л; дрожжевой экстракт - 1 г/л; коллоидный хитин - 10 г/л; рН - 8,2 Глюкозо-картофельный агар: глюкоза — 20 г/л; агар - 15 г/л; картофельный отвар - 300 мл/л.
Среда для культивирования S. kurssanovik дрожжевой экстракт — 0,1%; пептон - 0,2%; К2НР04 3 Н20 - 0,3%; MgS04 7 Н20 - 0,1%; хитин -2%; рН- 6,8-7,0 (53).
Культивирование проводили в качалочных колбах емкостью 750 мл на качалке при 2 8-30 С, скорость вращения 200-300 об/мин, продолжительность 96-108 часов.
Среда для культивирования A. tumefaciens: пептон — 10,0 г/л; К2НР04 - 3,0 г/л; NaH2P04 - 1,0 г/л; NH4CI - 1,0 г/л; сахароза - 10,0 г/л; MgS04 - 0,3 г/л.
Бактерии В. subtilis выращивали на мясо-пептонном бульоне (МПБ) в колбах на качалке (100 об/мин) в течение 24 ч. Затем эту культуру в количестве 5% использовали для засева МПБ и выращивали 4 ч также при качании. Затем нужный объем центрифугировали 20 мин при 5000 об/мин и ресуспендировали в 0,1 М ацетатном буфере, рН 6,5 до титра 109 кл/мл. Бактерии P. aureofaciens, Е. agglomerans и Е. coli выращивали на скошенном МПА, В. bifidum 791 - в аэробных условиях (149) на скошенном агаре на среде Блаурокка, С. kruisei — на скошенном агаре на среде Сабуро. Далее выросшие клетки культур инокулировали в 0,1 М ацетатном буфере, рН 6,5 до титра 109 кл/мл.
Для культивирования микроорганизмов, в опытах по изучению МИК хитозана использовали следующие среды: бактерии S. aureus, К. pneumoniae, P. aeruginosa выращивали на среде Мюллер-Хинтона; P. mirabilis — на Эктон-агаре (для предотвращения ползучего роста); L. plantarum — на среде Рагоза, B. bifidum — в жидкой среде Блаурокка в анаэробных условиях (с 0,5% С02); C. albicans - на среде Сабуро.
Подбор индуктора синтеза ферментов с высокой хитинолитической активностью
Известно, что сложный процесс биосинтеза ферментов находится под контролем многих регуляторных систем, У большинства микроорганизмов, усваивающих хитин, хитиназы были обнаружены как индуцибельные ферменты, которые синтезировались при добавлении в питательную среду хитина (103-104).
Был проведен подбор оптимального индуктора синтеза хитинолитических ферментов, обладающих высокой активностью. Для этого при выращивании S. kurssanovii использовали несколько видов хитинсодержащих субстратов:
1. коллоидный хитин краба
2. хитин краба
3. подмор пчел
4. хитин пчел (с меланином)
5. коллоидный хитин пчел (с меланином)
6. хитин пчел (обесцвеченный)
7. коллоидный хитин пчел (обесцвеченный)
8. ХГК
В результате культивирования S. kurssanovii на 8-ми разных субстратах были получены 8 КЖ. С целью выявления КЖ, обладающих наилучшим гидролитическим эффектом был проведен их сравнительный анализ. В каждой КЖ определялись три вида активностей: хитиназная, хитобиазная и протеазная, а так же количество белка. Все измерения проводили на 3-й сутки культивирования микроорганизма. Результаты представлены на таблице 1:Определение количества белка и трех видов активностей в КЖ S. kurssanovii, полученных при культивировании микроорганизма на разных хитинсодержащих субстратах:Из таблицы I видно, что наибольшей хитиназной активностью обладали КЖ, полученные при культивировании S. kurssanovii на субстратах № 2, 6 и 8. Все исследованные КЖ обладали слабой хитобиазной активностью. При определении протеазной активности, наилучший результат показали КЖ, полученные при выращивании S. kurssanovii на субстратах № 2, 3, 4, 6 и 8.
С целью определения наиболее активной КЖ был проведен гидролиз высокомолекулярного хитозана (Mv 800кДа) с использованием полученных КЖ. Гидролиз проводили используя 1%-ный раствор биополимера в 0,1 М ацетатном буфере при рН 4,5 и температуре 37С. Кипячением останавливали ферментативную реакцию, отбирали пробу и определяли время истечения в вискозиметре Уббелоде (диаметр капилляра 0,5 мм). За 100% приняли время истечения субстрата (нулевая точка). Соотношение белка фермента к хитозану определяли исходя из активности каждой полученной КЖ. Измерения проводили через каждые 15 мин в течение 1 ч. Результат гидролиза представлен на рисунке 1.
Из рисунка 1 видно, что наилучший результат по гидролитической активности показали КЖ, полученные при выращивании S. kurssanovii на хитине краба, хитине пчел с меланином и ХГК, то есть на субстратах № 2, 4 и 8, соответственно. С целью получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана был проведен гидролиз исходного высокомолекулярного хитозана этими тремя КЖ.
