Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства 10
1.2. Области применения 12
1.3. Основные источники хитина и хитозана 14
1.3.1. Ракообразные (Crustacea) 14
1.3.2. Грибы (Fungi) 17
1.3.3. Насекомые (Insecta) 19
1.3.4. Нетрадиционные источники 23
1.4. Получение хитина и хитозана из насекомых 24
1.5. Антимикробные пептиды насекомых 29
1.5.1. Перспективы применения антимикобных пептидов насекомых 32
1.5.2. «Липазная концепция» лечения туберкулеза 34
1.6. Антибактериальная активность хитозана 37
1.7. Липолитические ферменты 43
1.7.1. Области применения липолитических ферментов 48
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 56
2.1. Материалы и методы 56
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 68
3.1. Получение хитина и низкомолекулярного хитозана из кутикулы восковой моли Galleria mellonella L 68
3.1.1. Депротеинирование 68
3.1.2. Обесцвечивание 73
3.1.3. Деацетилирование 79
3.1.4. Ферментативный гидролиз 85
3.2. Изучение противотуберкулезных свойств хитозана 89
3.2.1. Подбор концентрации хитозана 90
3.2.2. Изучение зависимости гибели клеток М. smegmatis от Mr] хитозана 91
3.2.3. Изучение зависимости гибели клеток М. smegmatis от времени взаимодействия с хитозаном 92
3.2.4. Определение прочности связывания хитозана с
клетками М. smegmatis 93
3.2.5. Определение МИК хитозана 94
3.2.6. Изучение антибактериальных свойств производных хитозана 95
3.2.7. Противотуберкулезная активность хитозана 95
3.3. Изучение свойств экстракта выделенного из восковой моли Galleria mellonella 98
3.3.1. Изучение зависимости гибели клеток М. smegmatis от времени взаимодействия с экстрактом 98
3.3.2. Фракционирование экстракта выделенного из восковой моли 99
3.4. Изучение взаимодействия хитозана с липолитическими ферментами 103
3.4.1. Ингибирование активности липолитических ферментов хитозаном в гомогенных водных растворах 104
3.4.2. Ингибирование активности липолитических ферментов хитозаном в гетерогенных растворах, на границе раздела фаз 111
ВЫВОДЫ 116
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 117
ПРИЛОЖЕНИЕ 141
- Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства
- Материалы и методы
- Получение хитина и низкомолекулярного хитозана из кутикулы восковой моли Galleria mellonella L
Введение к работе
Одним из важнейших достижений мирового биотехнологического прогресса в области изыскания новых перспективных веществ за последние годы стало получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитина, хитозана и их производных. Уникальная структура хитозана обуславливают проявление целого ряда привлекательных свойств этого поликатиона, основными из которых являются - гипоаллергенность, биодеградируемость, биосовместимость, а также широкие антимикробные свойства.
Актуальность темы. На сегодняшний день основными источниками для получения хитина и хитозана являются панцири ракообразных (крабы, креветки, криль). Технология переработки включает постадийное удаление сопутствующих веществ с использованием химических и ферментативных способов обработки. Расширение областей применения данных биополимеров обуславливает поиск новых перспективных источников хитина. Как известно, в покровах насекомых до 50% занимает полимер хитин, наряду с белками придающий прочность экзоскелету. Таким образом, кутикулу насекомых можно рассматривать как источник различных биологически активных веществ, в том числе и хитина, с возможностью выделения в отдельном виде или в виде комплексов. Благодаря традиционно развитому пчеловодству в нашей стране в качестве источника биологически активных веществ можно предложить кутикулу личинок восковой моли - Galleria mellonella L, в большом количестве паразитирующих в пчелиных ульях.
Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в последние годы значительно возросло изучение этих природных полимеров. На сегодняшний день известно более 200 областей применения хитина и хитозана, в том числе и в медицине. Нарушение липидного метаболизма в организме человека может привести к развитию таких заболеваний как атеросклероз, диабет, ожирение и др. Это определило интерес к изучению молекулярного механизма действия липолитических ферментов и поиску соединений, влияющих на липидный обмен. Хитозан благодаря уникальной структуре и положительному заряду является полифункциональным соединением, обладающим целым рядом уникальных свойств: высокой совместимостью с животными тканями, биодеградируемостью, отсутствием токсичности и др. что открывает перспективы его использования в качестве ингибитора липолитических ферментов.
По данным многих исследователей хитозан обладает антимикробным эффектом в отношении многих патогенных микроорганизмов. Однако данных о чувствительности к хитозану возбудителей туберкулеза на сегодняшний день нет. Изучение противотуберкулезных свойств ферментативно полученных препаратов с низкой молекулярной массой и сравнение их с действием высокомолекулярных хитозанов на клетках микобактерий позволит провести сравнительный анализ и сделать некоторые обобщения практического характера связанного с использованием хитозана в медицине и ветеринарии для борьбы с туберкулезом.
Целью настоящей работы разработка биотехнологической схемы переработки личинок восковой моли с получением таких биологически активных веществ, как экстракт, хитин-меланиновой комплекс и хитозан. Изучение противотуберкулезных свойств хитозана и его взаимодействия с липолитическими ферментами.
Для достижения поставленной цели были определены следующие основные задачи:
1. Разработать технологию переработки восковой моли с учетом особенностей сырья и определить оптимальные параметры на каждой стадии обработки;
2. Согласно выбранным оптимальным параметрам осуществить комплексную переработку кутикулы личинок восковой моли с получением интересующих биологически активных веществ;
3. Исследовать противотуберкулезные свойства хитозана с различной молекулярной массой;
4. Изучить взаимодействие хитозана с липолитическими ферментами;
Научная новизна работы. Обосновано использование личинок восковой моли для получения различных биологически активных веществ. Впервые разработана комплексная технологическая схема переработки кутикулы личинок восковой моли с получением хитин-меланинового комплекса и хитозана. Определены основные оптимальные параметры переработки кутикулы восковой моли на каждой стадии обработки. Учитывая особенность сырья, обоснована необходимость включения стадии обесцвечивания в технологию переработки с целью более полного удаления пигмента.
Показано, что хитозан обладает антибактериальной активностью в отношении микроорганизмов рода Mycobacterium. Хитозан с низкой молекулярной массой обладает наибольшей антибактериальной активностью. С увеличением молекулярной массы антибактериальный эффект хитозана снижается. Установлена прямая зависимость гибели клеток микобактерий от времени взаимодействия с хитозаном.
Впервые показано, что хитозан является конкурентным ингибитором липолитических ферментов. Найдены кинетические константы ингибирования липаз. Ингибирование липолитической активности происходит за счет гидрофобных взаимодействий между хитозаном и липазами, вклад электростатических взаимодействий в комплексообразование ингибитора с липолитическими ферментами незначителен.
Практическая значимость работы. Разработана комплексная схема переработки кутикулы личинок восковой моли с получением таких биологически активных веществ как экстракт, хитин и низкомолекулярный хитозан-меланиновый комплекс. Предложены оптимальные параметры для осуществления каждой стадии переработки кутикулы.
Показано, что хитозан обладает, как минимум, бактериостатическим действием по отношению к возбудителям туберкулеза М. bovis и М. avium и может быть рекомендован для профилактики туберкулеза в промышленных птицеводческих и животноводческих хозяйствах.
Показано, что низкомолекулярный хитозан является конкурентным ингибитором липаз, в том числе, и панкреатической липазы. Данный результат может иметь практическое значение при создании препаратов для лечения и профилактики нарушений липидного метаболизма приводящего к развитию таких заболеваний как атеросклероз, диабет, ожирение в организме человека
Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 8-й Международной научной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Казань, 2006), Международной научно-практической конференции "Разработка противотуберкулезных терапевтических агентов нового поколения. Проблемы, подходы, перспективы" (Химки, 2006), Международной школе -конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2006), 4-м съезде биотехнологов России (Пущино, 2006), 6-й Международной научной конференции «Фитотерапия, биологически активные вещества естественного происхождения в современной медицине» (Черноголовка, 2006), Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2006), 3-м Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Дубна, 2007), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007» (Москва, 2007), VIII International Conference of the European Chitin Society (Antalya, Turkey, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 статьи.
Структура и объем диссертации. Диссертация содержит введение, обзор литературы, методическую часть, раздел с обсуждением экспериментальных результатов, выводы, список литературы и приложение. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 17 рисунков, библиографию из 250 наименований, из них 203 на иностранном языке.
Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства
Хитин (поли N-ацетил- D-глюкозамин) - азотосодержащий линейный полисахарид, по химическому строению и структурным характеристикам сходен с целлюлозой, занимает второе место после нее по распространенности в природе (рис.1). Ежегодно в биосфере образуется и утилизируется около 10 гигатонн (10,J кг) хитина. Рис.1 Структура хитина
Хитин встречается в наружном покрове членистоногих (ракообразные, насекомые), скелете морского зоопланктона, клеточной стенке грибов дрожжей, трубках погонофор [1]. Хитин присутствует в стенках цисты инфузории, клетках зеленых водорослей, иглах диатомовых, стеблях золотистых и волокнах гаптофитовых водорослей [2]. Хитин отсутствует у прокариотных организмов и у растений, хотя в состав клеточной стенки бактерий входит муреин, содержащий N-ацетил-D-глюкозамин. В живых организмах хитин образует микрофибриллярный порядок, что обеспечивает линейную конформацию молекул, закрепленную водородными связями. Эти фибриллы диаметром от 2,5 до 2,8 нм обычно входят в белковую матрицу [3].
Хитин присутствует в трех полимерных модификациях с различной ориентацией хитиновых микрофибрилл: а, 3, у. В природе получила распространение форма а-хитина, в которой цепи полимера антипараллельны и плотно упакованы. Она присутствует в панцире ракообразных и моллюсков, кутикуле насекомых, клеточной стенке грибов [1]. В р-форме цепочки располагаются параллельно относительно друг друга и направлены в одну сторону. В (3-форме цепочки обладают более высокой растворимостью и набуханием за счет более слабых молекулярных водородных связей [4]. Эта форма встречается у каракатицы, в гладиусе кальмара, трубках погонофор, у-форма имеет смешанную систему параллельных и антипараллельных цепочек и присутствует в коконах насекомых [5]. Р- и у-формы хитина под действием концентрированных кислот (муравьиной, азотной и соляной) могут переходить в а- форму, являющейся наиболее стабильной.
Хитин нерастворим в воде, разбавленных кислотах, щелочах, спиртах и других органических растворителях. Он растворим в концентрированных растворах соляной, серной и муравьиной кислот, а также в некоторых солях при нагревании. Хитин способен образовывать комплексы с органическими веществами (холестерин, белки, пептиды), обладает высокой сорбционной способностью к тяжелым металлам, радионуклидам. Хитин не разлагается под действием ферментов млекопитающих, но разлагается некоторыми ферментами насекомых, грибов и бактерий, отвечающих за распад хитина в природе [6,7]. Среди разнообразных производных этого полимера наиболее доступным является хитозан, получаемый в процессе деацетилирования хитина.
Хитозан (поли - D-глюкозамин) в отличие от хитина не встречается в живых организмах, за исключением сн2ин пщ некоторых видов грибов (рис. 2). Рис. 2 Структура хитозана
Важной характеристикой полимера является степень ацетилирования: отношение остатков N-ацетил- D-глюкозамина к общему количеству мономерных звеньев в полимере. Общепринято считать, что хитозан - это полимер со степенью ацетилирования ниже 50%. В присутствии кислот свободные аминогруппы хитозана акцептируют протоны, приобретая положительный заряд, и хитозан образует водорастворимые соли аналогично другим аминам. При этом в первую очередь от степени протонирования его свободных аминогрупп зависит растворимость
Материалы и методы
Хитозан. Для получения низкомолекулярных форм хитозана использовали крабовый высокомолекулярный хитозан с Mr) около 700 кДа и степенью деацетилирования 85%, а также N-сукцинил хитозан с Mr) 387 кДа, производимые ЗАО «Биопрогресс» (г. Щелково, Россия, www.bioprogress.ru). Синтезированные образцы низкомолекулярных N-сукцинил хитозана, сульфат хитозана, карбоксиметил хитозана получены в лаборатории «Инженерии ферментов», Центра «Биоинженерия» РАН, г. Москва.
Ферменты. Промышленный ферментный комплекс Целловиридин Г20х на основе штамма Trichoderma viride (Завод биологических препаратов, г.Бердск, Россия), папаин из латекса дынного дерева Carica papaya L («Sigma Chemical», США). Внеклеточный хитинолитический комплекс, продуцируемый S.kurssanovii нарабатывали самостоятельно [206].
Свиная панкреатическая липаза, тип VI-S, липаза из С. rugosa, тип VII, липаза из проростков пшеницы, тип I («Sigma Chemical», США.)
Бактериальные штаммы: В качестве продуцентов хитинолитических ферментов использовали культуру Streptomyces kurssanovii VKM Ac-1504 D (из коллекции лаборатории «Инженерии ферментов», Центра «Биоинженерия» РАН, г. Москва).
Среда для культивирования S. kurssanovii: дрожжевой экстракт - 0,1%; пептон - 0,2%; К2НР04 3 Н20 - 0,3%; MgS04 7 Н20 - 0,1%; хитин - 2%; рН - 6,8-7,0 [206]. Культивирование проводили в качалочных колбах емкостью 750 мл на качалке при 28-30С, скорость вращения 200-300 об/мин, продолжительность 96-108 часов.
Изучение антибактериальной активности экстракта из восковой моли проводили на атипичном штамме Mycobacterium smegmatis 134-S (из коллекции лаборатории «Биотехнологии стероидов», Центра «Биоинженерия» РАН, г. Москва). Клетки культивировали на мясо пептонном бульоне.
Изучение антибактериальной активности хитозана проводили на Mycobacterium avium (штамм IEKBM УААН) и Mycobacterium bovis (штамм Vallee) совместно с ВНИТИБП РАСХН (г. Щелково). Микроорганизмы культивировали на питательной яичной среде (ННЦ «ИЭКВМ», г. Харьков).
Получение низкомолекулярного крабового хитозана.
Низкомолекулярный хитозан получали путем ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана, используя хитинолитический комплекс S. kurssanovii. Препарат комплекса содержал 410 мг/мл белка и 0,38 ед. хитиназной активности на 1 мл фильтрата культуральной жидкости.
Для получения низкомолекулярного хитозана 1 г исходного высокомолекулярного хитозана выдерживали в течение 6 ч при комнатной температуре в растворе, содержащем 40 мл 1 М уксусной кислоты, 10 мл 1%-ного раствора №N3 и 106 мл воды. Добавлением 1 М NaOH значение рН раствора доводили до 5,2, нагревали до 45С и добавляли ферментный комплекс. Гидролиз проводили в течение 1 ч. Реакцию останавливали кипячением раствора в течение 10 мин. Полученный гидролизат хитозана диализовали против воды, используя диализный мешок Spectra/Por 3,5 кДа («Spectral Medical Industries», США). Выход лиофильновысушенного низкомолекулярного хитозана составлял 80 %.
Получение крабового низкомолекулярного N-сукцинил хитозана. Низкомолекулярный N-сукцинил хитозан был получен по методике [202] с некоторыми модификациями. 4 г исходного высокомолекулярного N-сукцинил хитозана растворяли в 300 мл 0,5 Н NaOH и изменяли рН раствора до значения 6,6, добавлением 30%-ной уксусной кислоты. Раствор выдерживали 30 мин при 45С после чего добавляли ферментный комплекс S. kurssanovii. Гидролиз проводили в течение 1,5 ч. Реакцию останавливали кипячением раствора в течение 10 мин. Полученный гидролизат хитозана фильтровали и диализовали против дистиллированной воды, используя диализный мешок Spectra/Por 3,5 кДа. Выход лиофильно высушенного низкомолекулярного N-сукцинил хитозана составлял 80 %.
Получение хитина и хитозана из восковой моли Galleria mellonella
Депротеинирование. Кутикулу личинок восковой моли суспендировали в воде в соотношении 1:10, добавляли 40%-ный раствор NaOH до концентрации 2%, нагревали суспензию в интервале температур до 20-100 в течение 10-180 мин при постоянном перемешивании. ХМК отделяли на капроновом фильтре, промывали дистиллированной водой до значения рН 7.0 и высушивали при температуре 30 ± 2 в течение 24 ч. Определяли выход ХМК и БМК.
Оптимизацию процесса обесцвечивания ХМК с концентрацией суспензии 40% проводили под действием 0,5-10%-ных растворов перекиси водорода в присутствии 0,1н раствора NaOH, в интервале температур 20-80С и продолжительности процесса 0,5-4 ч. По окончанию процесса твердых остаток обесцвеченного хитин-меланинового комплекса отделяли фильтрованием на капроновом фильтре, промывали до рН 7,0 и высушивали в сушильном шкафу при температуре 30 ± 5С.
Оптимизацию процесса деацетилирования обесцвеченного ХМК с концентрацией суспензии 15% осуществляли с использованием 35-55%-ных растворов NaOH в интервале температур 60-140С в течение 0,5-4 ч при постоянном перемешивании. По окончании процесса деацетилирования реакционную массу охлаждали до 40С и фильтровали на капроновом и стеклянном фильтрах. Полученный высокомолекулярный хитозан промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод и высушивали в сушильном шкафу при 30±5С.
Получение хитина и низкомолекулярного хитозана из кутикулы восковой моли Galleria mellonella L
Из трех компонентов, составляющих кутикулу насекомых: хитин, белок и меланин, два последних хорошо растворимы в щелочных условиях. Таким образом, для выделения чистого хитина из кутикулы личинок восковой моли Galleria mellonella необходимо подобрать оптимальные условия одновременного щелочного гидролиза кутикулярных белков, а также меланиновых пигментов, связанных с белками. Как правило, для депротеинирования панцирей ракообразных используются 1 - 5%-ные растворы NaOH, продолжительность процесса 1-6 ч. Такой способ позволяет снизить содержание белковых веществ в панцире до 5% и менее [214].
С целью определения оптимальных условий депротеинирования, учитывая особенности сырья, нами были проведены эксперименты по щелочному гидролизу кутикулы личинок восковой моли в различных условиях и определены концентрационные, температурные и временные параметры процесса. Известно, что остаточные количества белка могут влиять не только на физико-химические, но и биологические свойства полимера, ухудшать дальнейшую переработку и ограничивать применение его производных.
Определение оптимальной концентрации щелочи
В данном эксперименте депротеинирование 10% суспензии кутикулы личинок восковой моли проводили при температуре 55-60С в течение 2 ч при постоянном перемешивании с изменением концентрации щелочи от 0,25 до 20%. Данные о влиянии концентрации щелочи на выход ХМК и БМК из кутикулы личинок восковой моли представлены на рисунке 3. количества удаляемого БМК от 7 до 21%. Дальнейшее увеличение концентрации NaOH в 5-6 раз не приводило к более полному извлечению меланопротеинового комплекса, напротив, происходило к снижению его выхода на 15%. Последнее, возможно, объясняется частичным щелочным гидролизом самого белка в комплексе. Косвенным доказательством этого факта служило ухудшение осаждения белка при подкислении (рН 2). Что касается выхода ХМК, то для его максимального выделения было бы достаточно разбавленных растворов NaOH (0,25-1%).
Учитывая выше изложенное, для комплексного выделения ХМК и БМК целесообразно использовать 2-3%-ные растворы NaOH в вышеупомянутых условиях. Следует отметить, использование таких концентраций в технологической схеме не требует применения дорогого антикоррозийного оборудования и дополнительных мощностей для нейтрализации щелочных отходов.
