Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9
1.1. Общая характеристика поджелудочной железы высших животных и человека 9
1.2. Строение, свойства и механизм действия ферментов поджелудочной железы 11
1.2.1. Механизм действия, структура и свойства панкреатической а-амилазы (а-1,4-глюкан-
4-глюканогидролаза, К.Ф. 3.2.1.1) 11
1.2.2. Механизм действия, структура и свойства панкреатической липазы (триацилглицерол-ацилгидролаза, К.Ф. 3.1.1.3) 12
1.2.3. Механизм действия, структура и свойства протеаз 14
1.2.3.1. Трипсин (К.Ф. 3.4.21.4) 15
1.2.3.2. Химотрипсин (К.Ф. 3.4.21.1) 18
1.2.3.3. Карбоксипептидаза Б (пептидил-Ь-лизин (L-аргинин) гидролаза, К.Ф. 3.4.17.2) 21
1.2.4. Механизм действия, структура и свойства рибонуклеазы (К.Ф. 3.1.27.5) 24
1.3. Извлечение ферментов из поджелудочной железы 28
1.3.1. Получение препаратов а-амилазы из поджелудочной железы 29
1.3.2. Получение препаратов липазы из поджелудочной железы 29
1.3.3. Получение протеолитических ферментов из поджелудочной железы 31
1.3.3.1. Получение трипсина 32
1.3.3.2. Получение химотрипсина 33
1.3.3.3. Получение карбоксипептидазы Б 35
1.3.3.4. Получение панкреатина 37
1.3.4. Получение рибонуклеазы 39
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42
2.1. Объект исследования 42
2.2. Реагенты 42
2.3. Методы анализа 44
2.3.1. Количественное определение азотосодержащих веществ в белковых растворах 44
2.3.2. Определение активности ферментов 45
2.4. Методы исследования 47
2.4.1. Методика экстракции ферментов из биомассы поджелудочной железы 47
2.4.2. Методика проведения процесса ультрафильтрации на ячейках с промышленными ультрафильтрами 48
2.4.2.1.Устройство и принцип действия лабораторной установки концентрирования.48 2.4.2.2. Методика проведения процесса ультрафильтрации на половолоконном модуле промышленного типа 49
2.4.2.3.Методика проведения процесса концентрирования 50
2.4.3. Методика проведения процесса молекулярно-ситовой хроматографии 50
2.4.4. Методика проведения осаждения субстанций ферментов из водных и водно-спиртовых растворов 51
2.4.5. Методика проведения гель-электрофореза в полиакриловом геле 52
2.4.6. Методика проведения культивирования микроорганизмов 52
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 55
3.1. Исследование процесса экстракции гидролитических ферментов из ПЖ КРС. 55
3.2. Исследование концентрирования ферментсодержащих экстрактов ультрафильтрацией на плоских мембранных элементах и осаждения субстанций ферментов из ретантов 79
3.3. Концентрирование ферментных растворов ультрафильтрацией на мембранных фильтрах половолоконного типа 93
3.4. Осаждение ферментов из водных растворов в изоэлектрической точке 98
3.5. Осаждение ферментов из водно-спиртовых растворов 104
3.6. Получение растворов ферментов, свободных от минеральных примесей и пигментов 111
3.7. Биоконверсия отходов, образующихся при комплексной переработке поджелудочной железы крупного рогатого скота в продукт кормового назначения. 114
ВЫВОДЫ 121
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 122
ПРИЛОЖЕНИЯ 141
Приложение 1 141
Материальный баланс комплексной переработки поджелудочной железы крупного рогатого скота для определения количества образующихся стоков и экономических расчётов 141
Приложение 2 156
- Общая характеристика поджелудочной железы высших животных и человека
- Реагенты
- Исследование процесса экстракции гидролитических ферментов из ПЖ КРС.
Введение к работе
В настоящее время пищевая промышленность является одним из лидирующих
направлений народного хозяйства Российской Федерации. Наиболее высокие темпы развития наблюдаются в мясоперерабатывающей промышленности. Существенное увеличение масштабов производства в данной отрасли ставит вопрос о переработке образующихся отходов, одним из которых является поджелудочная железа крупного рогатого скота. Выход биомассы поджелудочной железы при убое 1000 голов крупного рогатого скота составляет 250 кг, что для среднего мясокомбинат приводит к образованию 35-45 тонн данного отхода в год.
Несмотря на то, что поджелудочная железа используется для выделения инсулина, опита, панкреатина, рибонуклеазы. карбоксипептидазы Б и других практически значимых препаратов, полная переработка сырья при этом не достигается. Так, известно, что при производстве трипсина остаётся до 85 % от исходной массы поджелудочной железы, а при производстве рибонуклеазы не менее 80 % [1]. Таким образом, существующие технологии не позволяют переработать поджелудочную железу в полном объёме.
Следует отметить, что поджелудочная железа является ценным сырьём для биотехнологической промышленности, поскольку содержит гидролитические ферменты, среди которых наибольшее практическое значение имеют карбоксипептидаза Б и рибонуклеаза, используемые в пищевой промышленности и медицине. Потребность в карбоксипептидазе Б для России составляет около 40 кг/год, а в рибонуклеазе - 100-И 50 кг/год и т. д., причем, промышленное производство ряда гидролитических ферментов, содержащихся в поджелудочной железе, не налажено. Выделение данных ферментов является многостадийным процессом из-за необходимости введения дополнительных стадий их очистки от примесных гидролаз. К таким гидролазам относятся амилолитические, липолитические и протеолитические ферменты, области применения которых в настоящее время значительно расширяются за счет использования в пищевой, микробиологической промышленности, при производстве синтетических моющих средств, поэтому потребность в этих ферментных препаратах постоянно растёт.
Таким образом, разработка технологии полной комплексной переработки поджелудочной железы с получением максимального количества субстанций гидролаз является актуальным. Данные ферментные препараты после соответствующей очист-
ки могут найти применение в различных отраслях промышленности, включая пищевую и медицинскую. Однако, процесс такой переработки поджелудочной железы, безусловно, приведёт к образованию больших объёмов жидких стоков, что значительно осложнит работу сооружений биологической очистки предприятий мясоперерабатывающего комплекса. Поэтому важным аспектом разрабатываемой технологии должна стать минимизация образующихся твёрдых и жидких отходов.
Целью настоящей работы явилась разработка научных основ технологии гибкой малоотходной переработки поджелудочной железы с получением с\бсганций гидролитических ферментов.
В задачи работы входило:
Изучение количественных закономерностей стадии извлечения ферментов из поджелудочной железы, установление последовательности её обработки различными экстр агентами, что обеспечило бы минимальные потери активности каждого из них.
Изучение количественных закономерностей стадий концентрирования и осаждения выделяемых гидролаз.
Разработка кинетических схем извлечения ферментов из биомассы поджелудочной железы, и на их основе предложить алгоритмы управления отдельными технологическими стадиями с целью модификации технологической схемы для получения одного или группы ферментов с максимальным выходом.
Разработка пути утилизации отходов, образующихся в технологической схеме комплексной переработки ПЖ.
Проведение расчета технико-экономических показателей разрабатываемой технологии.
Научная новизна. Впервые показана возможность применения рапсе разработанных кинетических моделей извлечения белковых веществ из биомассы микроорганизмов к процессам извлечения гидролитических ферментов из биомассы ПЖ. Разработана единая схема последовательно-параллельных превращении для кинетического описания процесса извлечения белковых веществ, показана возможность сё модификации для описания процессов извлечения отдельных фракций белковых веществ.
Предложены алгоритмы управления процессом экстракции гидролитических ферментов, позволяющие подобрать оптимальные условия извлечения индивидуаль-
ного фермента с минимальными потерями остальных.
Проведено количественное изучение стадий ультрафильтрации и осаждения ферментов из водных и водно-спиртовых растворов. Показана принципиальная возможность переработки образующихся в данной технологии отходов в продукт кормового назначения.
Практическая значимость. Разработана гибкая технологическая схема выделения субстанций ферментов карбоксипептидазы Б (Кп Б) и рибонуклсазы (РНК-азы) с получением в качестве попутной продукции субстанций липазы, амилазы, протео-литического комплекса, что позволяет упростить известные технологии очистки Кп Б и РІ IK-азы. Такой подход позволил повысить выход Кп Б в 2 раз, а РНК-азы в 3 раз. При этом качество получаемых субстанций соответствовало препаратам пищевого назначения.
Установлено, что себестоимость получаемых препаратов в 2-^2,5 раз ниже себестоимости отечественных и зарубежных аналогов.
Показано, что предложенный способ утилизации стоков данной технологии позволяет снизить их ХПК не менее чем в 3 раза, кроме того, количество твёрдого отхода биомассы ПЖ уменьшается на 70 %.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на III и V Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, март 2005 г.; Москва, апрель 2007 г.), Международных конференциях «Успехи в химии и химической технологии» (РХТУ им. Д. И. Менделеева, Москва, ноябрь 2005 г.; Москва, ноябрь 2006 г.; Москва, ноябрь 2007 г.)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, в том числе одна статья из списка журналов, рекомендованных ВАК; 2 тезисов докладов в материалах научных конференций; подана заявка на патент.
Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методик проведения экспериментов и анализов, 7-ми глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждение, выводов, списка литературы, 2-х приложений. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста. Работа содержит 61 рисунок, 41 таблицу. Библиография включает 201 наименование, из них 131 иностранный источник.
Общая характеристика поджелудочной железы высших животных и человека
Ферменты играют ключевую роль в процессах метаболизма всех живых организмов, обеспечивая широкий спектр биохимических реакции в клетках. В организме человека и высших животных гидролитические ферменты незаменимы в процессе пищеварения. Они расщепляют поступающие с пищей белки, липиды, углеводы, по-линуклеотиды и дают «строительный материал» для построения биополимеров данного организма. Источником ферментов является поджелудочная железа.
Поджелудочная железа (ПЖ) - один из важнейших органов пищеварительной системы, экзокринная функция которого (ферменты и бикарбонаты) в значительной степени определяет эффективность пищеварения. Не менее важной является её эндокринная функция. Располагается ПЖ в забрюшинном пространстве и у взрослого человека представляет собой образование длиной 14-К8 см и массой от 85 г у женщин и до 100 г у мужчин [2].
Ответственными за экзокринную функцию поджелудочной железы являются ацииусы, которые образуют и выделяют ферменты, секретируют неорганические ионы. бикарбонаты и поджелудочный сок. Секреция начинается через 3- 5 мин после начала приема пищи и продолжается довольно долго (8-И0 ч). Сок ПЖ имеет щелочную реакцию (рН 7,1- -9,2), богат бикарбонатами и ферментами, в первую очередь липазой, трипсином, амилазой, а также химотрипсином, эластазой, фосфорилазой и др. Наиболее труднозаменимым из этих ферментов является панкреатическая липаза. Секрет включает как органические, так и неорганические вещества, почти изотоничен плазме, он содержит ионы: Na+ (148 мэкв./л); ATf (4 мэкв./л); Cav (6 мэкв./л); СГ (80 мэкв./л); НС03 (80 мэкв./л); НР042 (1 мэкв./л). При увеличении секреции возрастает концентрация [НС03 ], но сумма [НС03 ] + [СГ] остаётся постоянной [3]. Состав поджелудочного сока меняется в зависимости от вида пищи: при белковой — увеличивается выделение протеаз, при углеводной — карбоангидраз, при жировой — липазы.
Панкреатические ферменты отличаются высокой специфичностью. Так, а-амилаза катализирует расщепление полисахаридов (крахмал, гликоген), трипсин и химотрипсин расщепляют до аминокислот пищевой белок, нуклеазы — нуклеиновые кислоты, эластаза отщепляет от эластина пептид и переводит его в растворимую форму для дальнейшего переваривания протеазами, липаза вызывает гидролиз несвязанных нейтральных жиров [4].
Реагенты
Другой способ [174] очистки производственного высола РНК-азы осуществляют следующим образом: производственный высол РНК-азы растворяют в ацетатном буферном растворе (рН 4,5 -6,5) и фильтруют. Фильтрат подают на ионообменную колонну с сорбентом со скоростью 50 -150 мл/см -ч. Снижение рН до 3,0-К3,5 приводит к уменьшению равновесной ёмкости сорбции, а увеличение до 7- 8 - к помутнению раствора, вызванного агрегацией белковых молекул. После окончания сорбции колонну промывают дистиллированной водой в количестве, равном свободному объему колонны. Затем осуществляют десорбцию РНК-азы со смолы путем подачи сверху вниз элюента со скоростью 25 -50 мл/см2-ч. В качестве элюента используют подкисленный водно-спиртовой раствор с рН 2-КЗ и концентрацией спирта в элюенте 30-ИЮ % по объему. Увеличение скорости подачи элюента и увеличение значения рН элюента больше 3,0 приводит к "размыванию" целевого пика, увеличению его объема, что не позволяет достичь степени концентрирования целевого продукта, достаточной для осаждения. Увеличение концентрации спирта в элюенте больше 60 % приводит к десорбции с ионита примесей и, как следствие, к ухудшению качества фермента. Во фракции элюата, содержащие более 10 мг/мл белка, добавляют 1н. NaOH до рН 7- -8 и охлажденный спирт до полного осаждения целевого продукта. Данный способ позволяет сократить время технологического цикла очистки РНК-азы из производственного высола, увеличить её выход и улучшить качество препарата.
Таким образом, в литературе имеется много сведений по технологиям выделения ферментов из ПЖ. Однако, многие из предложенных технологий являются многостадийными и дорогостоящими. Кроме того, они предусматривают, как правило, получение одного или группы близких ферментов с потерей активности остальных. Поскольку ПЖ содержит широкий спектр ферментов, различных по стабильности и способам выделения, то представляется актуальным разработать технологическую схему комплексной переработки ПЖ с последовательным выделением максимально возможного количества ферментов, прежде всего, рибонуклеазы, карбоксипептидазы Б, амилазы, липазы. Разработка такой малоотходной технологии и лежит в основе данной работы.
Исследование процесса экстракции гидролитических ферментов из ПЖ КРС
В главе «Литературный обзор» отмечалось, что ПЖ КРС содержит различные гидролитические ферменты, способные расщеплять все основные биополимеры клетки (белки, липиды, нуклеиновые кислоты и углеводы) (табл. 3.1.1). Важнейшими из них являются: а-амилаза, липаза, трипсин, химотрипсин, Кп Б, РНК-аза. Из литературы известно, что данные гидролазы заметно отличаются по стабильности. Наиболее стабильной является РНК-аза, далее следуют химотрипсин, трипсин и Кп Б, наименее стабильна - а-амилаза. Из перечисленных ферментов наибольшую практическую ценность и, соответственно, стоимость имеют Кп Б и РНК-аза. Поэтому при разработке технологии комплексной переработки ПЖ целесообразно, в первую очередь, обеспечить максимальный выход именно этих ферментов. Причём Кп Б должна быть выделена раньше РНК-азы вследствие меньшей стабильности. Согласно литературным данным, для извлечения Кп Б используются растворы хлоридов натрия и кальция. Поэтому, на первом этапе исследований изучили процесс экстракции Кп Б растворами этих солей при обработке 10 %-ой суспензии клеток ПЖ при 30 Рис. 3.1.1. Влияние концентрации хлорида натрия на степень экстракции Кп Б из нативных клеток ПЖ С и концентрации соли I % масс. Выход Кп Б на уровне 24 % наблюдается при времени экстракции 3 ч Результаты эксперимента показали, что тип соли не оказывает принципиального влияния на выход Кп Б, поэтому, руководствуясь соображениями получения субстанций пищевого назначения, в качестве экстрагента был выбран хлорид натрия. Были проведены исследования экстракции фермента из ПЖ водными растворами хлорида натрия более высоких концентраций (от 4 до 8 %) (рис. 3.1.1).
Из рис. 3.1.1 следует, что максимальный выход Кп Б (равный 58 %) наблюдается при концентрации NaCl 5 % масс. В табл. 3.1.1 представлен состав получаемого при этом экстракта, а также отработанной биомассы ПЖ. Как видно (табл. 3.1.1), экстракт содержит значительное количество других гидролаз. и, прежде всего, а-амилазу, поэтому целесообразно извлекать из водно-солевого экстракта в качестве побочного продукта а-амилазу.
