Содержание к диссертации
Введение
Часть 1: Обзор литературы 7
1.Стевия. Биологические особенности. Химический состав и методы выделения веществ стевиозидного комплекса 7
1.2. Целлюлозосодержащие материалы как сырье для микробиологического синтеза белка 16
1.3. Способы культивирования микроорганизмов на растительном сырье 23
1.4. Использование дрожжей для получения БАД, обогащенных микроэлементами 28
1.4.1. Получение селенообогащенной биомассы дрожжей 28
1.4.2. Биологическая роль йода. «Включение» йода в дрожжевую и
растительную биомассу 38
Часть 2. Экспериментальная часть 45
Глава 1: Объекты и методы исследований 45
Глава 2: Характеристика стевии, культивируемой в республике Северная
Осетия - Алания, как сырья для получения препарата стевиозида 52
Глава 3. Характеристика целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида как сырья для культивирования дрожжей 59
3.1. Исследование способов предподготовки целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида для культивирования дрожжей 61
3.2. Ферментативный гидролиз отходов производства стевиозида 66
Глава 4. Гетерофазное культивирование дрожжей на отходах производства стевиозида. Получение белково-углеводного продукта 72
Глава 5. Обогащение микроэлементами белково-углеводной добавки 77
5.1. Изучение влияния селена на рост дрожжей Yarrowia lipolytica. Обогащение селеном белково-углеводной добавки 77
5.2. Исследование возможности йодирования белково-углеводной кормовой добавки на основе целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида 89
Глава 6: Биологическая оценка белково-углеводной кормовой добавки, обогащенной микроэлементами, на основе отходов производства стевиозида 97
Заключение 102
Выводы 105
Список литературы 107
- Целлюлозосодержащие материалы как сырье для микробиологического синтеза белка
- Объекты и методы исследований
- Исследование способов предподготовки целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида для культивирования дрожжей
Введение к работе
В соответствии с современными воззрениями рациональное использование целлюлозосодержащего сырья, применение замкнутых систем материального производства, ослабляя антропогенное воздействие на окружающую среду, повышая эффективность использования солнечной энергии, является одним из необходимых факторов устойчивого развития общества.
Важнейшей проблемой развития современного общества является обеспечение продовольственными белковыми ресурсами, а также необходимыми нут-рицевтиками для рационального питания человека (В.А. Тутельян, 2002).
Значительный опыт, накопленный в России, показывает эффективность применения методов микробиологического синтеза в решении этой проблемы при использовании целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства, лесной и пищевой промышленности (Л.К. Эрнст, 1988).
К настоящему времени разработан ряд биотехнологических способов переработки целлюлозосодержащих отходов, основанных на предварительном их гидролизе с последующим глубинным, поверхностным, твердофазным или ге-терофазным культивированием микроорганизмов (В.И. Шарков и др., 1973; В.А. Быков, Ф.А. Прищепов, 1985; Е.Г. Борисенко и др., 2003; В.И. Панфилов, 2004).
Гетерофазное глубинное культивирование является одним из наиболее технологичных способов, так как позволяет исключить стадию отделения твердой фракции непрогидролизованного растительного сырья и получать продукт, который содержит не только дрожжевую биомассу, но и непрогидролизован-ные целлюлозосодержащие продукты, которые при их содержании в кормах в определенной концентрации улучшают биологическую ценность кормов.
Известна способность дрожжей накапливать в биомассе высокие концентрации микронутриентов, что является основой их использования для получения лечебных и профилактических биологически активных добавок, обогащенных селеном, йодом и др. микроэлементами (Т.С. Жильцова и др., 1998).
Одной из развивающихся отраслей фармацевтической промышленности является получение лечебно-профилактических препаратов из растительного сырья.
Большой интерес представляет растение стевия (Stevia rebaudiana Bertoni) -источник суммы дитерпеновых гликозидов (стевиозид), обладающих в 250-300 раз большей подслащивающей способностью, чем сахароза и применяющихся в диетическом питании в качестве заменителя сахара. Уровень накопления дитерпеновых гликозидов зависит от почвенно-климатических условий произрастания стевии (О.О. Дзюба, 1998). В настоящее время культивирование стевии осваивается в ряде регионов России, в том числе и в республике Северная Осетия - Алания (РСО-А). В России и ряде зарубежных стран разработаны технологии выделения стевиозида, как для пищевой промышленности, так и для медицинских и фармацевтических целей, однако проблема утилизации отходов производства стевиозида остается нерешенной (Н.Ф. Комисаренко, 1994, СВ. Федоров, 2004).
Целью настоящей работы явилась разработка основ технологии комплексной переработки стевии, культивируемой в республике Северная Осетия-Алания, с получением целевого продукта - стевиозида и белково-углеводной кормовой добавки, обогащенной йодом и селеном.
Научная новизна результатов исследований. Впервые изучено содержание дитерпеновых гликозидов в стевии, культивируемой в предгорной зоне Северного Кавказа, и показана возможность ее использования в качестве сырья для получения стевиозида пищевого и медицинского назначения со степенью чистоты целевого продукта 84%. Разработаны режимы предподготовки и ферментативного гидролиза отходов производства стевиозида при использовании ферментного препарата Целловиридин Г20х, обеспечивающие 90% степень гидролиза. Впервые показана возможность получения белково-углеводного продукта, обогащенного органическими селеном и йодом, при гетерофазном культивировании дрожжей Y. lipolytica на гидролизатах целлюлозосодержащего сырья. На новом биологическом объекте - дрожжах Y. lipolytica - подтвержде-
6 ны ранее выявленные закономерности обогащения дрожжей селеном. Впервые исследовано влияние селена и серы на общую дыхательную активность клеток дрожжей Y. lipolytica и распределение потока электронов между двумя путями окисления - цитохромным (классическим) и альтернативным, цианидрези-стентным. Показано, что при недостатке серы в среде селен замещает серу и способствует «нормализации» функционирования митохондрий. Впервые показана возможность обогащения йодом в органической форме в присутствии окислителя, как растительного компонента, так и обогащенных селеном дрожжей при гетерофазном культивировании Y. lipolytica на ферментативных гидро-лизатах целлюлозосодержащего сырья.
Практическая значимость. Впервые определен уровень содержания сте-виозида (11,7%) в листьях стевии, культивируемой в Предгорной зоне Северного Кавказа, что с учетом урожайности стевии определяет перспективу создания сырьевой базы в республике Северная Осетия - Алания для получения стевио-зида. Разработаны основы технологии комплексной переработки стевии с получением препарата стевиозида и белково-углеводной добавки при использовании отходов производства стевиозида. Разработаны режимы гетерофазного глубинного культивирования дрожжей, обеспечивающие получение белково-углеводного продукта с содержанием «сырого» протеина 29%, селена 187 мг/кг и йода до 600 мг/кг. Показано, что обогащение селеном и йодом белково-углеводной добавки повышает биологическую ценность продукта, обеспечивая увеличение прироста живой массы кроликов на 15%.
Целлюлозосодержащие материалы как сырье для микробиологического синтеза белка
Критериями использования тех или иных материалов являются их стоимость, размеры запасов, возможности концентрирования их в районе расположения гидролизного производства, технологические свойства (А.П. Синицын, 1995). Так, для производства этилового спирта сырье должно содержать максимальное количество гексозанов (например, древесина хвойных пород), а для производства кормовых дрожжей - большое количество общих полисахаридов и т. д. (В.И. Шарков и др., 1973).
Учитывая сложность строения целлюлозосодержащих субстратов, присутствие биополимеров различного строения и их трудную доступность для использования микроорганизмами (К. Е. Eriksson, 1982; В. И. Билай и др., 1982; В. И. Огарков и др., 1985), важное значение для разработки эффективных биотехнологических процессов имеет разработка стадии подготовки субстрата для культивирования микроорганизмов.
При использовании более труднодоступного растительного сырья, в состав которого входит не только целлюлоза, но и лигнин, чтобы облегчить доступ микробных гидролитических ферментов к полисахаридам растительной ткани, применяется предварительная химическая обработка субстратов слабой щелочью и кислотой для разрушения лигнинового компонента и гидролиза полисахаридов.
Широкие научные исследования в области изучения разных способов подготовки целлюлозосодержащего сырья и их практического использования показывают, что эффективность тех или иных способов предобработки сырья для культивирования микроорганизмов зависит от ряда факторов: от химического состава и объемов используемого сырья, от назначения и требований к качеству получаемого продукта, от энергетических ресурсов и инженерно-технического оснащения производства и др.
Разработанные способы подготовки сырья включают:
- физические способы, нарушающие жесткую структуру растительной ткани; - химические методы (гидролиз полисахаридов).
Физические методы предобработки растительных материалов подразделяются на механические и немеханические.
Механическая предобработка заключается в измельчении растительных субстратов в сухом и влажном состоянии на различных видах дробилок, шаровых, коллоидных или вибромельницах, дезинтеграторах, диспергировании на вальцах и. т. д. Использование механических методов приводит к разрушению кристаллической структуры целлюлозы, увеличению поверхности, доступной целлюлолитическим ферментам и, как следствие, к значительному возрастанию реакционной способности целлюлозосодержащего сырья (А. А.Клесов, 1983; В.П. Соловарова, ЮЛ. Козлов, 2001; С.Н. Бутова, 2004).
Наиболее простой и распространенный метод механического измельчения сырья на дробильных агрегатах. Так, использование муки из виноградной лозы, виноградных выжимок, корзинок и стеблей, подсолнечника, отходов эфиромас-личных культур (герани и базилика) для кормления животных не оказывает отрицательного влияния на их организм и позволяет экономить дорогостоящие зерновые концентраты (Я.А.Закордонец др., 1983; Д. Квирикашвили, 1983).
К немеханическим методам относятся у-облучение, облучение потоком электронов, обработка паром, микроволновым излучением(2400-2500 МГц), воздействие высокого давления, ультразвука и охлаждения, нагревание на воздухе или в атмосфере С02 (100 С), в воде или в керосине (Л. Артур, 1974; M.Chang et al, 1981; М. Kumakura et al., 1982).
В последнее время большое развитие получила взрывная дефибрация целлюлозосодержащего сырья по декомпрессионному принципу (паровой взрыв) (H.R. Bungay, 1983; R.F.H. Dekker, 1983; М. Mes-Hartreii et al, 1983).
Компанией Айотек (Канада) разработан непрерывный вариант этого процесса, который предполагает кратковременную обработку древесины перегретым паром под давлением (230-300С, 3,5-7,5 МПа) в присутствии или отсутствии SO2, далее давление сбрасывается, что вызывает паровой взрыв (H.R. Bungay, 1981). Компанией «Стейк» разработан процесс предобработки целлюлозосодер-жащего сырья в непрерывном режиме, который получил название «автогидролиз». Автогидролиз происходит при температуре 180-220С и давлении 0,2 МПа. При таких условиях ацетильные группы, частично содержащиеся в геми-целлюлозах, дезацетилируются с образованием уксусной кислоты, которая катализирует гидролиз гемицеллюлоз (R. Datta, 1981; V.P. Pun, 1983).
Химические методы предобработки основаны на способности ряда химических соединений растворять лигнин или целлюлозу, либо приводить к набуханию или разрушению ее структуры.
Комплексные соединения Cd, Ni, Zn с этилендиамином (кадоксен, ниоксен, цинкоксен и т.д.), со щелочью и биуретом (Си, Ni) комплекс железо - тартрат Na, концентрированные минеральные кислоты (фосфорная, серная, соляная) могут растворять целлюлозу (H.R.Bungay, 1981; Chang М. et al, 1981).
Набухание, растворение и аморфизация целлюлозы происходит также в растворах неорганических солей. Наибольшее набухание целлюлозы вызывают следующие анионы: Г, CNS", Hgl4 и ZnCl 4 (А.П. Синицын, А.В. Гусаков и др., 1995).
Из исследований Д.О. Варвикера (1974) следует, что обработка хлоридом цинка наиболее эффективна при концентрации растворов 60-75% при температуре 65-75С. Такое воздействие сопровождается мерсеризацией (набуханием и перестройкой структуры) и аморфизацией целлюлозы. К мерсеризации приводит также обработка целлюлозы концентрированными водными растворами щелочей (10-22%) (J.G.Shewale, J. Sadana, 1979).
В промышленных условиях наиболее отработан химический гидролиз концентрированной серной кислотой, которая сложна и осуществляется в агрессивных средах, что требует специального кислотостойкого оборудования и высоких давлений (В.И.Шарков и др., 1973). Данная технология может быть эффективной только на промышленных предприятиях довольно большой мощности. Для производств небольшой мощности может быть использован химический гидролиз разбавленными кислотами или щелочами.
При использовании 0,5% серной кислоты (11-15 объемов по отношению к объему сырья) выход редуцирующих веществ достигает 43-50% от массы абсолютно сухой древесины, или 60-61% от исходного количества полисахаридов (И.В. Стахеев, 1984).
Описаны методы предобработки 0,2% H2S04 при 180 С в течение 30 мин. и 0,1% Нг804при 180 С в течение 45 мин. Гидролиз целлюлозы в этих условиях незначителен, но при этом происходит существенный гидролиз гемицеллю-лоз (D.Knappert, H.Grethlein et al, 1978).
Делигнификация целлюлозосодержащего сырья осуществляется разбавленными растворами щелочи (1-2%), как правило, NaOH или аммиаком (водным или газообразным) при кипячении или автоклавировании в течение 30-60 мин. Для делигнификации используют также карбонат натрия, гидроксид кальция, щелочной органозольв, раствор фенола, а также обработку перегретым водным паром. К делигнификации приводит известный и широко применяемый в целлюлозно-бумажной промышленности процесс сульфатной или сульфитной варки (Э.Шестрем, Р.Малинен и др., 1982; D.G. MacDonald. et al., 1983; С. Rolz et al., 1987).
Описана (M. Kamakura, I. Kaetsu, 1982; M.A. Farid, M.H. Shaker et al., 1983) делигнификация целлюлозосодержащего сырья аммиаком с перекисью водорода, надукусной кислотой, смесью 99,9%-го уксусного ангидрида и 30%-й перекиси водорода (1:1) при 80 С. Лигнин экстрагируется водными растворами этанола или бутанола (M.M.Ghakpuray et al., 1983; P.V.P. Selvam et al., 1983).
Преимущества ферментативного гидролиза заключаются в возможности осуществления тонких превращений веществ, недоступных для реализации химическими методами, использований мягких условий биотрансформации (комнатная температура, водные растворы), в малоотходности технологии.
По прогнозам ученых США и Японии, целлюлозосодержащие ферменты займут в ближайшем будущем доминирующее положение среди ферментов, применяемых для повышения качества вторичного растительного сырья, а также как добавка в корма, комбикорма, премиксы.
Микробиологическая промышленность СССР выпускала такие ферментные препараты, как пектаваморин ШОх, пектофоетидин ПОх и ГЗх, целлолиг-норин ШОх, целловиридин ГЗх, которые широко использовались для осахари-вания целлюлозосодержащего сырья (М.И.Лавриченко и др., 1987).
В сравнении с химическими методами преимущество ферментативной деградации заключается в специфичности действия ферментов, что позволяет осуществить весьма тонкие перестройки молекул органических соединений с использованием простых технологических схем.
Адсорбция целлюлаз является стадией, предшествующей ферментативному гидролизу, причем скорость процесса адсорбции существенно превышает скорость гидролитической стадии (P. L.Bertrame, P.Carniti et al., 1982). В количественном отношении адсорбция зависит от относительной концентрации ферментов и субстрата, структурных параметров целлюлозы и степени ее набухания в воде, рН, температуры, скорости перемешивания реакционной смеси (A. A. Klyosov, М. L. Rabinowitch, 1980; A.Moloney, М.Р. Coughlan, 1983).
Адсорбция целлюлолитических ферментов увеличивается с понижением температуры, не меняется в интервале рН 3,5-5,0, но значительно уменьшается с увеличением рН до 6-7 (D.E. Otter, P. A. Munro et al., 1984). Понижение ионной силы уменьшает прочность связывания ферментов с целлюлозой (А. А. Klyosov, М. L. Rabinowitch, 1980).
Целлюлазные комплексы, осуществляющие расщепление целлюлозы в зависимости от физиолого-биохимических особенностей и таксонометрической принадлежности продуцента, значительно различаются по компонентному составу. Образование глюкозы в ходе ферментативного гидролиза целлюлозы в значительной степени зависит от того, какой из ферментов целлюлазного комплекса лимитирует этот процесс. Повышая или снижая активность отдельных компонентов целлюлазного комплекса, можно изменять стадию, лимитирующую скорость образования глюкозы из целлюлозы. Поэтому одним из основных факторов успешного проведения ферментативного разрушения целлюлозо-содержащих субстратов является подбор сбалансированного по компонентному составу ферментного комплекса. Эта задача может быть решена как путем комбинирования отдельных ферментов, так и в результате скрининга или конструирования определенных микроорганизмов, способных синтезировать нужный ферментативный комплекс (А.П. Синицын и др., 1995).
Объекты и методы исследований
В работе использовано воздушно-сухое сырье (влажность 8%) - лист сте-вии сорта «Рамонская сластена», культивируемой в республике Северная Осетия-Алания, а также отходы производства стевиозида.
Основные отходы производства стевиозида состоят из шрота, остающегося после водно-спиртовой экстракции дитерпеновых гликозидов из листьев сте-вии, и стеблей растения. Принимая во внимание соотношение массы стеблей стевии и шрота, для дальнейшего исследования использовался смешанный субстрат в соотношении шрот : стебли -1:2.
В работе использовали штаммы дрожжей Candida maltosa Б-1, Candida tropicalis Б-2, Endomycopsis fibuligera C-2, из коллекции культур микроорганизмов кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, а также дрожжи Yar-rowia lipolytica, любезно предоставленные Звягильской Р. А.
Определение химического состава стевии проводили по методикам:
- первоначальную влагу методом высушивания по ГОСТ 1396.3-92(27548.97);
- содержание «сырого» протеина по Къельдалю, ГОСТІ396.4[2874-89];
- содержание «сырой» клетчатки по Геннебергу и Штоуману, ГОСТ 1396.2-91; содержание «сырой» золы методом сухого озоления, ГОСТ 26226-95; содержание «сырого» жира методом Сокслета, ГОСТ 13496.15; содержание безазотистые экстрактивные вещества расчетным методом. Урожайность стевии определяли по общепринятой методике (Б. А. Доспехов, 1985). Определение стевиозида:
- Качественное определение стевиозида осуществляли методом ТСХ на пластинах «Silufol UV 254» (Чехия) в системе хлороформ : этанол (2 : 1), проявитель - пары йода.
- Определение стевиозида методом 13С ЯМР. Спектры ЯМР образцов стевиозида, полученного в лабораторных условиях записаны в дейтерированном пиридине (C5D5N) с концентрацией раствора 0,1 г/мл на спектрометре «Gemini-200» (Varian, США). Для регистрации спектра использовали следующие параметры накопления:
- частота на ядре 13С - 50,33 МГц;
- длительность импульса - 4,1 мкс (45С);
- время накопления -0,82 с;
- ширина спектрального диапазона - 10000 Гц (200 м.д.);
- количество накоплений 10000;
- температура - 303К.
- Количественное определение стевиозида осуществляли методом ВЭЖХ на хроматографической системе Gilson (США), состоящей из насоса Gilson (модель 303), манометрического модуля (модель 803 С), инжектора Rheodine 7161 с объемом петли 20 мкл и спектрофотометрического детектора с переменной длиной детектирования (Gilson UV Detector модель 116). Управление, сбор и обработка хроматографической информации осуществляли с помощью программно-аппаратного комплекса «Gilson 714 HPLC Controller». Хромато графические анализы проводили на колонке Luna 5u СІ8 (4,6x250 мм, 10 мкм) (Phenomenex, США) с защитной колонкой Security Guard Cartridge СІ8 (4x3,0 мм) (Phenomenex, США). В качестве подвижной фазы использовали та: 87-82,5% В за 12 мин, 82,5-79% В за 8 мин, 5% В - 5 мин., 5% -87%В за 1 мин, 87% В - 3 мин. Длина волны детектирования 210 нм. Объемная скорость 1 мл/мин. На стадии пробоподготовки при определении стевиозида в листьях и стеблях стевии стевиозид извлекали из высушенных и измельченных (0,5-1 мм) образцов растительного сырья (1 г) трехкратной водной экстракцией при температуре воды 100С. Объем воды на каждой стадии экстракции составлял 20 мл, а время экстракции - 30 мин. Экстракты объединяли, охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через бумажный фильтр и доводили их суммарный объем до 100 мл деионизированной водой.
Для ВЭЖХ использовали ацетонитрил осч (ХимМед, Россия) и ацетонит-рил УФ-210 (Lechbiopharm, Россия).
В качестве внешнего стандарта для качественного и количественного определения стевиозида применяли сухой очищенный экстракт стевии, предоставленный ЗАО «НПКФ Аквилон».
Подготовка исходного растительного сырья для глубинного гетеро-фазного культивирования дрожжей включала такие операции, как измельчение до фрагментов 0,5-1мм стеблей стевии, смешивание со шротом, получение водной суспензии и ее термореагентная обработка при различны рН (2-9) и давлении (0,5-2 атм.).
Ферментативный гидролиз отходов производства стевиозида осуществляли в реакторе периодического действия при перемешивании 200 об/мин при: t -50С, рН среды - 5,5, при времени экспозиции - 2 часа.
В качестве ферментных препаратов применяли Целловиридин Г20х и Фи-толиазу, предоставленные НТЦ «Лекарства и биотехнология».
Дрожжи выращивали на среде «П» следующего состава, (г/л): [NH4]2S04 -3,5; NH4H2P04 - 0,8; КС1 - 0,73; MgS04-7H20 - 0,25; FeS04-7H20 - 0,0125; MnS04-5H20 - 0,0125; NaCl - 0,0063; 0,1% дрожжевого автолизата (первоначальное содержание серы в среде 885,2 мг/л).
Различное содержание серы в среде культивирования достигали путем замены соответствующих солей серной кислоты на соли соляной кислоты. Среду с содержанием серы 6,8 мг/л получали путем замены [NH4]2S04 на NH4C1 в количестве 2,84 г/л и MgS04-7H20 на MgCl2-6H20 с концентрацией 0,192 г/л.
В качестве источника углерода использовали ферментолизаты отходов производства стевиозида, а при определении селенорезистентности и дыхательной активности дрожжей - глюкозу и сукцинат в концентрации 1 %.
Для обогащения дрожжей селеном в среду культивирования вносили диоксид селена в различных концентрациях (3-30 мг 8е02/л).
Культивирование осуществляли:
- в колбах Эрленмейера объемом 250 и 750 мл при 100 мл питательной среды. Колбы инкубировали на качалке при температуре 28-30С и перемешивании 120-150 об/мин.
- в периодическом режиме в лабораторном ферментере объемом 5 л, снабженном барботером (подача воздуха до 35 л/ч), турбинной мешалкой, обеспечивающей интенсивность перемешивания - 500-800 об/мин. Значение рН на уровне 4,5-5 поддерживали с помощью 2 н водного раствора КОН. Доза посевного материала составляла N0=7 х 10бкл/мл.
Культивирование дрожжей с рециркуляцией культуральной жидкости проводили следующим образом. На первой стадии осуществляли обычный процесс глубинной гетерофазной ферментации в периодическом режиме в ферментере (рабочий объем 1,5 л) при постоянном содержании твердой фазы во всех экспериментах. Полученную дрожжевую суспензию отстаивали или центрифугировали, а весь образующийся фильтрат использовали при подготовке питательной среды второй стадии. Корректировку объема ферментационной среды проводили добавлением технической воды. Такой порядок действий повторялся и на всех стадиях рециркуляции культуральной жидкости.
Биомассу дрожжей отделяли от жидкой фазы центрифугированием при 4500 об./мин. в течение 30 минут или отстаиванием, подвергали термолизу (75С, 30 мин) для инактивации клеток и отмывали пятикратно водопроводной водой от неорганического селена и йода при центрифугировании или отстаива 49 нии при тех же условиях. Продукт сушили при комнатной температуре до остаточной влажности 7-8 %.
Дыхательную активность дрожжей регистрировали с помощью прибора Oximetr Lab-Master pQ-8000, в ячейке Островского - Шольца с использованием компьютерной программы для обработки показаний прибора «sholtz2.exe».
Рост культуры определяли турбидиметрическим методом на фотоэлектро-калориметре КФК-2 в кюветах толщиной 10 мм при 490 нм.
Титр дрожжевых клеток - методом прямого подсчета в счетной камере Го-ряева.
Удельную скорость роста дрожжей в условиях периодического культивирования рассчитывали по формуле: ИІпХ.-ІпХоУО.-Іо), где Х0 и X, - количество биомассы млн. кл./мл. в моменты времени t0 и t,.
Определение восстанавливающих Сахаров проводили с помощью модифицированного метода Шомоди-Нельсона (А.П. Синицын и др., 1995).
Определение содержания селена в биомассе осуществляли микрофлуори-стическим методом (Н.А. Голубкина, 1995).
Для йодирования белково-углеводного продукта в качестве источника йода использовали раствор йодида калия в концентрации 1г/л. Радиоактивный изотоп I в виде раствора в 0,1 н NaOH без носителя с концентрацией мКи/мл, был получен из В/О «Изотоп». Изотоп I разбавляли «холодным» йо-, дидом калия до удельной активности 50 мкКи/мг, объемная активность исходного раствора составляла 1 -2 мКи/мл. Этот раствор применяли для всех экспериментов с йодированием препаратов.
При йодировании целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида навеску 100 мг растительного сырья суспендировали в воде (500 мкл), вносили 500 мкл раствора йодида калия, 5 мкл водного раствора, содержащего изотоп 1251, и 3%-ную Н202 (2 - 10 мкл). Смесь йодировалась в течение часа при t=37C. Далее йодированная растительная биомасса пятикратно промывалась раствором «холодного» йодида калия (300 мкл), осадок отделялся от суперна-танта центрифугированием в течение минуты при 500 об/мин.
Дрожжи для йодирования культивировали в периодическом режиме в аэробных условиях до начала стационарной фазы роста в течение 16-18 часов, при t=32-34C. Аликвоты дрожжевой суспензии (1000 мкл) центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 мин. К осадку добавляли 50 мкл Н20, 50 мкл раствора «холодного» йода, 5 мкл раствора радиоактивного 1251 и 10 мкл 3%-ной Н2О2. Йодирование осуществляли в течение часа при 37С. Йодированная биомасса дрожжей пятикратно промывалась 200 мкл раствора «холодного» йодида калия, осадок отделялся от супернатанта центрифугированием в течение 5 минут при 14000 об/мин.
Автолиз дрожжей осуществляли при 58-60С в течение 5 часов. К аликво-те, содержащей 50 мкл дрожжевого автолизата, прибавляли 50 мкл раствора «холодного» йода, 2 мкл раствора «горячего» йода и 10 мкл 3%-ной Н202. Смесь йодировали в течение часа при 37С, затем пятикратно промывали 200 мкл охлажденной 10%-ной ТХУ, центрифугировали в течение 5 минут при 14000 об/мин, супернатант отделяли от осадка.
Качественное определение продуктов йодирования методом ТСХ на пластинках Fertigplatten Kieselgel 60 (Merck) в камере с системой растворителей 0,1 М раствор йодида калия - этанол (1 : 2). Хроматограммы анализировали на приборе Instant Imager фирмы Packard (США).
Измерение активности образцов 1251 осуществляли на жидкостном сцинци-ляционном счетчике TRI-CARB 21000TR фирмы Packard (США).
Для определения «включения» йода в продукты автолиза концентрацию белка определяли по методу Лоури.
Для определения биологической ценности белково-углеводного продукта на физиологические и продуктивные показатели животных был проведен научно-хозяйственный опыт на базе Горского ГАУ г. Владикавказа.
Для этого методом пар-аналогов (по происхождению, возрасту и живой массе) были составлены две группы крольчат калифорнийской породы в воз 51 расте 60 дней, по 3 головы в каждой. Продолжительность опыта составляла - 60 дней.
Условия содержания и кормления животных были идентичными, разница состояла в том, что в рационе кормления кроликов опытной группы жмых подсолнечный заменяли белково-углеводной кормовой добавкой на основе отходов производства стевиозида (34 % общей питательности рациона в КЕ). Рационы кроликов балансировались согласно детализированным нормам кормления ВИЖ (А.П. Калашников и др., 1978).
Подопытные животные содержались в одинаковых клетках (по одному животному в клетке) с достаточной площадью для размещения, соответствующей зоотехническим нормам. Раздача кормов осуществлялась два раза в сутки - утром и вечером, поение проводилось водопроводной водой - вволю.
Продолжительность предварительного периода составила 7 дней, учетного 5 дней. На предварительный и учетный периоды суточные дачи сыпучих кормов развешивались для каждого кролика заранее в специальные пакеты и непосредственно перед кормлением замешивались с определенным количеством воды.
Исследование способов предподготовки целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида для культивирования дрожжей
Важной особенностью получения белково-углеводных добавок является стадия подготовки растительного сырья для повышения доступности углеводного субстрата используемым культурам микроорганизмов.
Растительные материалы резистентны к действию различных гидролизую-щих агентов, что связано, прежде всего, с нерастворимостью, высокой степенью кристалличности природной целлюлозы, наличием лигнина и гемицеллю-лозы. Поэтому для использования растительной биомассы необходимо решать проблему ее эффективной предобработки, которая заключается в разрушении высокоупорядоченной структуры целлюлозы и удалении лигнина.
Разработка стадии предподготовки растительного сырья для гетерофазного глубинного культивирования дрожжей заключалась в подборе оптимальных условий термореагентной и ферментативной обработки растительного сырья, направленных на достижение максимального выхода РВ.
Изучение стадии термореагентной обработки исходного растительного сырья включало в себя определение основных параметров (температура, рН, время воздействия) и оптимальных условий ее проведения с учетом получения биологически доброкачественных суспензий с максимальным выходов РВ.
Поскольку извлекаемый компонент содержится в растительных клетках, а процесс диффузии растворимого компонента через стенки клеток осуществляется за счет осмоса, размер частиц является важным параметром, влияющим на скорость процесса экстракции и степень извлечения углеводов из твердой фазы. Сверхтонкое измельчение в этом случае неэффективно, так как клетки слишком малы, поэтому обычно экстрагирование ведут из сравнительно крупных частиц при большем времени контакта. Сопротивление диффузии с межфазной поверхностью в объем раствора, в этом случае, мало по сравнению с сопротивлением диффузии из твердой фазы, и концентрация на поверхности частицы может быть принята равной концентрации в объеме жидкой фазы.
В связи с этим, шрот, получаемый после водно-спиртовой экстракции сте-виозида из измельченных до фрагментов 0,5-1 мм листьев стевии, смешивался с измельченными до таких же размеров стеблями в соотношении шрот ; стебли -1 : 2 (принимая во внимание соотношение массы стеблей стевии и шрота).
Стадия термореагентной обработки отходов производства стевиозида включала в себя такие операции, как измельчение, получение суспензии измельченных стеблей и шрота стевии в воде, а также термореагентную обработку.
При анализе реологических характеристик водной суспензии, содержащей измельченные отходы производства стевиозида, были исследованы различные концентрации субстрата в среде в колбах, инкубируемых на качалках, при перемешивании - 250 об/мин
В связи с тем, что осуществление процесса ферментативного гидролиза в значительной степени затруднено из-за сложности и гетерогенности растительного сырья, для увеличения гидролизуемости целлюлозы, содержащейся в отходах производства стевиозида, были изучены различные режимы и условия его проведения.
Для деградации целлюлозы в соответствии с рекомендациями НТЦ «Лекарства и биотехнологии» были отобраны ферментные препараты Целловири-дин Г20х и Фитолиаза.
Важным фактором, влияющим на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы, является качественный и количественный состав целлюлазно-го комплекса, а также каталитические параметры действия его компонентов.
Препарат Целловиридин Г20х - комплексный ферментный препарат, эффективно катализирующий преимущественно гидролиз целлюлозы. Препарат содержит комплекс целлюлолитических ферментов, включающий эндо- и эк-зоглюканазы, Р-глюкозидазу, целлобиазу, а также другие ферменты, катализирующие гидролиз полисахаридов. Целловиридин Г20х выпускается с активностью 1000-2000 ед/г. Фитолиаза - ферментный препарат, который мацерирует растительную ткань и содержит комплекс пектолитических и целлюлолитических ферментов, что обеспечивает эффективность ее использования при переработке растительного сырья.
Использование природных целлюлозосодержащих материалов для ферментативного получения глюкозы в значительной степени зависит от их реакционной способности. Для увеличения эффективности процесса ферментативного получения глюкозы осуществлялась предварительная обработка растительною сырья.
