Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор
1.1. Общая характеристика таурина и области его применения 6
1.2. Биохимические аспекты синтеза и механизма действия таурина 9
1.3. Лабораторные и промышленные способы получения таурина 16
1.4. Характеристика кератинсодержащего сырья и способы его переработки 21
Глава 2 Материалы и методы исследования 32
2.1. Объект исследования ...32
2.2 Методы анализа 33
2.3. Методы исследования 37
2.3.1 Методика щелочного растворения кератинсодержащего сырья 37
2.2.1 Методика проведения процесса ферментативного гидролиза белковых веществ из кератинсодержащего сырья 38
2.2.3. Методика проведения процесса трансформации цистина и цистеина под действием ферментных систем клеток печени 39
2.2.4. Методика выделения таурина методом ионного обмена 39
Глава 3. Основные экспериментальные данные и обсуждение результатов 41
3.1. Растворение кератинсодержащего сырья в растворе гидроксида натрия 41
3.2. Гидролиз белковых веществ протосубтилином 51
3.3. Гидролиз белковых веществ кератинов ферментными системами клеток поджелудочной железы 66
3.4. Трансформация свободных L-цистина и L-цистеина и в составе белкового гидролизата в таурин ферментными системами клеток печени КРС 78
3.5. Выделение и очистка таурина ионным обменом 93
3.6. Кристаллизация таурина из водных и водно-спиртовых растворов.... 104
Выводы 114
Список сокращений 116
Литература.. 117
Приложение 1. Результаты расчетов кинетики щелочного растворения кератинов 125
Приложение 2. Результаты расчетов кинетики ферментативного гидролиза белков кератинов техническим ферментом протосубтилином 128
Приложение 3. Результаты расчетов кинетики ферментативного гидролиза белков кератинов ферментными системами поджелудочной железы 132
Приложение 4. Результаты расчетов кинетики ферментативной трансформации L-цистина и L-цистеина в таурин ферментными системами клеток печени 136
Приложение 5. Материальный баланс получения таурина из кератинсодержащего сырья 144
Приложение 6. Расчет себестоимости таурина, получаемого из кератинсодержащего сырья мощностью по таурину 1т в год 156
- Общая характеристика таурина и области его применения
- Объект исследования
- Растворение кератинсодержащего сырья в растворе гидроксида натрия
Введение к работе
Актуальность работы. Таурин (2-аминоэтансульфоновая кислота) как продукт метаболизма серосодержащих аминокислот ( L-цистина и L-цистеина) играет важную роль в обеспечении различных функций человека, связанных со зрением, агрегацией тромбоцитов, активностью инсулина и др. Поэтому находит применение в медицине, а также имеет значение для кормовой и пищевой промышленности. Таурин - достаточно простое соединение, которое может быть синтезировано химически, а также путем трансформации вышеуказанных L-аминокислот под действием комплекса ферментов клеток печени. В последнем случае сырьевой базой может быть богатое L-цистином кератинсодержа-щее сырье, являющееся в настоящее время плохо утилизируемым отходом мясоперерабатывающих заводов. Те же предприятия располагают и источниками ферментных препаратов в виде клеток поджелудочной железы (для гидролиза белковых веществ) и печени убойных животных (для трансформации L-цистина и L-цистеина в таурин).
Целью работы явилась разработка основ малоотходной технологии получения очищенного препарата таурина из кератине од ержащего сырья.
В задачи работы входило: разработка основных стадий технологического процесса получения таурина из кератинсодержащего сырья с использованием химических реагентов и технических ферментов и определение оптимальных условий их проведения на основе разработанных математических моделей.
Научная новизна: показана возможность получения очищенного препарата таурина по малоотходной технологии, включающей в себя растворение кератинсодержащего сырья в щелочном растворе с пониженным содержанием гидроксида натрия, гидролиз белоксодержащего раствора до L-цистина и L-цистеина комплексом ферментов клеток поджелудочной железы, трансформацию вышеуказанных аминокислот в составе белкового гидролизата в таурин комплексом ферментов печени животных, ионообменное выделение таурина и кристаллизацию препарата из водных и водно-спиртовых растворов.
Практическая значимость: разработаны основные стадии технологического процесса получения препарата таурина (с содержанием основного вещества не ниже 96%) из кератинсодержащего сырья. На основе разработанных математических моделей предложены алгоритмы управления стадиями химического растворения кератинов, их энзиматического гидролиза и трансформации свободных L-цистина и L-цистеина в таурин под действием ферментов.
Публикации: по материалам работы опубликованы 3 статьи, подана 1 авторская заявка на патент РФ "Способ получения таурина", 3 тезисов докладов на Международной конференции молодых ученых (г.Тверь, 25-28.09.01 г.), XVI Международной конференции молодых ученых (РХТУ имени Д.И.Менделеева, Москва, 27-29.11.02 г.), 2-ом Московском конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (10-14.11.03 г.).
Структура и объем работы: диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка литературы (97 наименова-
БИМПОТЬКА |
о»
ний) и 6 приложений. Работа изложена на 166 стр. машинописного текста и содержит 13 таблиц, 58 рисунков.
Общая характеристика таурина и области его применения
Таурин, 2-аминоэтансульфоновая кислота (H2N-CH2-CH2-SO3H), химически стабильное природное соединение, содержащееся в основном в возбудимых тканях организма животных и человека.
Таурин широко распространен в животном мире и необходим для нормальной жизнедеятельности. Некоторые животные способны синтезировать таурин в достаточном количестве, например, крысы и морские моллюски, другие же получают его в основном с пищей. К последним относятся кошки, кролики, некоторые обезьяны и человек. Таурин был впервые обнаружен в 1827 году в мясе быка, отсюда и происходит его название. Эта аминокислота может быть синтезирована на основе двух серосодержащих аминокислот; метионина и цистеина. В отличие от классических аминокислот, которые служат для формирования белков, таурин остается в клетке в свободной форме. Соединяясь с хо-левыми (желчными) кислотами, в виде таурохолевых кислот, таурин выделяется из печени в тонкий кишечник, где он участвует во всасывании и обмене жиров в организме. Он содержится в тканях мышц (сердца), центральной нервной системы, сетчатки глаза, где его концентрация достигает 10 ммолей/г. Именно эти органы страдают при недостатке таурина в рационе питания или при нарушении обмена веществ в результате какой-либо патологии.
Наиболее высокое содержание таурина наблюдается в сердце, мышцах и сетчатке глаза вследствие способностей этих тканей к эндогенному синтезу таурина или его накоплению в результате активности специфической транспортной системы.
Таурин долгое время считался метаболически инертным соединением, являющимся конечным продуктом обмена серосодержащих аминокислот (метионина, цистеина, цистина). Однако в последнее десятилетие доказано прямое участие таурина в некоторых важных физиологических процессах, что позволяет отнести его к важнейшим биологически активным веществам.
Это соединение обладает широким спектром физиологических и биохимических воздействий. Так, таурин выступает в качестве регулятора кровяного давления и улучшает светочувствительность сетчатки, являясь безвредным средством улучшения зрения людей в условиях низкой освещенности. Таурин необходим для поддержания целостности сетчатки глаза. Его концентрация в сетчатке глаза превышает концентрацию в крови в 100-400 раз. В 1975 году было установлено, что недостаток таурина в течение длительного времени вызывает прогрессивную дегенерацию (перерождение) сетчатки, приводящую к полной слепоте меньше, чем за два года. Характерной особенностью таурина является способность стимулировать репаративные процессы при дистрофических нарушениях сетчатки глаза, травматических поражениях ткани глаза. Для медицинского применения таурин выпускается в виде 4%-ного водного раствора под названием "Тауфон".[1]
Таурин стимулирует выделение инсулина и регулирует содержание глюкозы в крови, поэтому его используют для лечения сахарного диабета. При сахарном диабете таурин уменьшает уровень триглицеридов в крови, значительно снижает глюкозурию, т.е. снижает содержание сахара в крови. Его применение позволяет снизить дозу инсулина или уменьшить количество сахароснижаю-щих препаратов, многие из которых, как известно, обладают побочными действиями на печень и почки. Таурин подобным действием не обладает. Он не только снижает нагрузку на эти органы за счет уменьшения дозы гипогликеми-ческих средств, но и способствует нормализации их функций [2].
Таурин также необходим для правильного развития и функционирования нервной системы и мышц. Особенно высока потребность в таурине в младенческий период, когда идет быстрое развитие организма, поэтому считается, что необходимо добавлять таурин в детское питание, что и делается во многих странах.
Объект исследования
В работе использовали кератинсодержащее сырье (рога и копыта сельскохозяйственных животных), содержащее 85% белковых веществ и 11% цис-тина. Кератинсодержащее сырье на предварительном этапе исследования подвергали механическому измельчению до размера частиц 1-3 мм. Подготовленные таким образом кератины являются объектом исследования данной работы, с позиции самостоятельного источника сырья. Реагенты:
1) минеральные щелочи:
гидроксид натрия квалификации чда ГОСТ 4328 -77
2) минеральные кислоты соляная кислота техн. ГОСТ 857-78
3) аммиачная вода квалификации техн. ГОСТ-9-77
4) иониты: анионит высокоосновный АВ-17-2
5) аминокислоты:
а) L-ішстин, 99% основного вещества, фирма Merk
б) L-цистеин, 98% основного вещества, фирма Merk
в) таурин, 4%-ный раствор, фирма Ферейн.
6) ферментные препараты:
а) комплекс протеолитических ферментов протосубтилин ГЗх ГОСТ
23636-79 с активностью 70 ед/г производства Бердского завода.
б) внутриклеточные ферменты поджелудочной железы свиньи производ
ства Московского мясокомбината с активностью, определенной методом
Ансона 2000 ед/г.
в) внутриклеточные ферменты печени крупного рогатого.скота или свиньи производства Московского мясокомбината с активностью 2000 ед/г.
Количественное определение азотсодержащих веществ в белковых гидролизатах и растворах
Общее содержание азотсодержащих веществ определяли микрометодом Кьельдаля [79]. Расчет проводили по формуле: N = (Vk 14 0,1 100)/(10 и)) 100% (2.2.1), где N - содержание общего азота в исследуемом материале, %; Vk - объем серной кислоты пошедший на титрование пробы, мл; 14 - масса 1 мг-экв азота, мг-экв/мг;
0,1 - нормальность раствора серной кислоты, используемого для титрования, мг-экв/мл;
100 - объем анализируемого раствора, мл; 10 - объем пробы, взятой для анализа, мл; н - навеска анализируемого материала, мг.
Содержание белковых веществ определяли модифицированным методом Лоури с предварительным осаждением белков и крупных пептидов 50%-ной трихлоруксусной кислотой [79], используя альбумин из человеческой сыворотки квалификации чда для построения калибровочной кривой. Расчет содержания белковых веществ, осаждаемых 50%-ной ТХУ проводили по формуле:
Р = С- N/V (2.2.2), где:
Р - содержание белковых веществ, мг/л;
С - концентрация белковых веществ, найденная по калибровочному графику, мг/л;
N - разведение анализируемого раствора; V - объем пробы, взятой для анализа.
Содержание белковых веществ, неосаждаемых 50%-ной ТХУ, определяли по формуле:
PP = C-2-V (2.2.3),
где РР - содержание белковых веществ в анализируемом материале, мг/л; С - концентрация белковых веществ, найденная по калибровочному графику, мг/л;
Р - разведение анализируемого раствора; 2 - разведение за счет добавления ТХУ.
Содержание аминного азота определяли методом тонкослойной хроматографии хроматографии на основе реакции с нингидриновьш реактивом [79], применяя стандартные растворы аминокислот для построения калибровочного графика. В качестве растворителей для хроматографии аминокислот использовали последовательно две системы:
1. w-бутиловый спирт - уксусная кислота - вода (4:1: 5); компоненты смеси тщательно встряхивали 5-Ю мин в делительной воронке, и после расслаивания использовали верхний слой;
2. w-бутиловый спирт - уксусная кислота вода (8:3: 1).
Для лучшего разделения сложной смеси аминокислот, имеющих близкие величины Rf, пропускание каждого растворителя по хроматограмме повторяли несколько раз (обычно дважды). В этом случае фронт каждого последующего растворителя должен продвигаться по бумаге несколько дальше предыдущего. Для количественного анализа применяли метод двумерной хроматографии последовательно в двух системах растворителя. Хроматограммы проявляли с помощью нингидринового реактива. Проявленные пятна вырезали, помещали в насыщенный раствор сульфата меди в этиловом спирте. После элюирования пятна, измеряли оптическую плотность при длине волны 500 нм и определяли концентрацию таурина по калибровочному графику. Расчет концентрации тау-рина проводили по формуле
Растворение кератинсодержащего сырья в растворе гидроксида натрия
Кератины относятся к нерастворимым в воде белкам. В отличие от других протеинов, они характеризуются относительно высоким содержанием серосодержащей аминокислоты L-цистина - (11-12% мол.) и основной аминокислоты L-аргинина (7,2% мол.) [33]. В качестве возобновляемого источника их получения можно рекомендовать перо птицы, волос, рога и копыта мясных пород убойных животных. Такое сырье содержит кератинов до 85% мае. На практике в технологических схемах мясокомбинатов и птицефабрик кератины, если и утилизируются, то с невысокой эффективностью. Традиционная технология их переработки предусматривает разваривание белковых веществ в воде при повышенной температуре. Иной подход основывается на глубоком химическом гидролизе кератинов концентрированной минеральной кислотой (соляной или серной). Ранее такой способ был единственно возможным для получения очищенного L-цистеина и других аминокислот. Однако производству кислотных гидролизатов присущи такие недостатки, как высокий коррозионный износ оборудования, образование больших объемов сточных вод, образующихся при нейтрализации минеральной кислоты и многоступенчатой ионообменной очистке смеси аминокислот. При этом часть аминокислот подвергается значительной химической деструкции. В значительной мере указанные недостатки удается преодолеть, если вместо минеральной кислоты для растворения кератинсо-держащего сырья использовать неконцентрированные водные растворы гидроксида натрия.
В данном разделе работы приводятся экспериментальные данные по щелочному растворению кератинсодержащего сырья и анализ количественных закономерностей этого процесса, позволивший в итоге построить его математическую модель и установить оптимальные условия для растворения кератинов при обработке кератинсодержащего сырья щелочным раствором.
Щелочное растворение белковых веществ исследуемого кератинсодер-жащего сырья изучали по кривым накопления белковых веществ в соответствующих растворах. В качестве параметров изучаемого процесса, оказывающих наибольшее влияние на скорость, были выбраны температура, концентрация минеральной щелочи, концентрация кератинов, которые изменяли соответственно в интервалах 60 - 90С, 0,1 - 1,0М, 10-100 г/л.
На рис.3.1.1 приведены типичные кривые накопления ВМФ и НМФ белковых веществ, образующихся при растворении кератинов и относительного изменения концентрации щелочи в растворе. Из рис.3.1.1 следует, что в условиях данного эксперимента полное растворение кератинов происходит в течение 1-го часа. Наличие в растворе ВМФ и НМФ, наблюдаемый расход щелочи свидетельствуют о химической деструкции кератинов, и, прежде всего, о разрыве пептидных связей с образованием свободных амино- и карбоксильных групп. Последние нейтрализуются гидроксидом натрия, что приводит к заметному расходованию щелочного агента. Это подтверждают результаты соответствующего расчета, проведенного по образующимся в ходе растворения аминогруппам НМФ, причем на нейтрализацию соответствующих им карбоксильных групп, должно уйти не менее 55% гидроксида натрия. Кроме того, нельзя исключить и других путей химической деструкции кератинов, также приводящих к нейтрализации щелочного агента. Например, частичное десульфирование цистина по дисульфидным связям, сопровождающееся образованием сероводорода, а также возможность химической деструкции аргинина в щелочной среде, что приводит к образованию двух молекул аммиака [33]. Поэтому для оценки качества образующихся белковых гидролизатов в отдельных экспериментах мы анализировали их содержание сероводорода и аммиака.
Как показали предварительные опыты, химическое растворение кератинов не происходит в концентрированном водном растворе аммиака (25%), а в ограниченное время наблюдается только в растворах гидроксида натрия, о чем свидетельствуют данные табл. 3 Л. 1.
