Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Нуклеиновые кислоты и их производные. Метаболизм рибонуклео-тидов. Характеристика, способы получения и применение панкреатического гидролизата дрожжевой РНК 9
1.2. Панкреатическая рибонуклеазы, характеристика, применение и способы выделения 25
Глава 2. Материалы и методы исследования .37
2.1. Объекты исследования 37
2.2. Реагенты 37
2.3. Методы анализа 37
2.4. Методы исследования 43
2.4.1. Методика проведения гидролиза дрожжевой РНК панкреатической рибонуклеазой 43
2.4.2. Отделение моно- и олигорибонуклеотидов от высокомолекулярной фракции дрожжевой РНК ультрафильтрацией 44
2.4.3. Методика проведения стерилизации раствора панкреатического гидролизата РНК 45
2.4.4. Методика проведения опытов по экстракции рибонуклеазы из поджелудочной железы КРС 45
Глава 3. Основные экспериментальные данные и обсуждение результатов...47
3.1. Разработка основ технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК 47
3.1.1. Ферментативный гидролиз дрожжевой РНК. Количественные закономерности процесса 47
3.1.2. Разделение ВМ и НМ фракций продуктов гидролиза ультрафильтрацией. Количественные закономерности процесса 73
3.1.3. Осаждение смеси моно- и олигорибонуклеотидов из водно- спиртовых растворов. Количественные закономерности процесса 84
3.2. Разработка основ технологии получения панкреатической рибонуклеазы 90
3.2.1. Исследование количественных закономерностей экстракции рибонуклеазы из поджелудочной железы КРС 90
3.2.2. Количественные закономерности стадии ультрафильтрации 102
3.2.3. Количественные закономерности стадии осаждения рибонуклеазы 108
3.2.4. Очистка препарата технической рибонуклеазы 114
Выводы 119
Список литературы 120
Приложение 1. Результаты расчета кинетики процесса гидролиза дрожжевой РНК панкреатической рибонуклеазой 130
Приложение 2. Результаты расчета кинетики экстракции рибонуклеазы из бычьей поджелудочной железы 133
Приложение 3. Материальный баланс производства панкреатического гидролизата РНК из хлебопекарных дрожжей 133
Приложение 4. Расчет себестоимости панкреатического гидролизата РНК из хлебопекарных дрожжей мощностью 100 кг в год 142
Приложение 5. Акты испытаний панкреатического гидролизата дрожжевой РНК ....166
- Нуклеиновые кислоты и их производные. Метаболизм рибонуклео-тидов. Характеристика, способы получения и применение панкреатического гидролизата дрожжевой РНК
- Объекты исследования
- Разработка основ технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время разработка недорогих эффективных лекарственных средств отечественного производства является одной из актуальных задач сохранения здоровья, продолжительности и качества жизни людей, решаемых современной российской фармацевтической промышленностью. Препараты нуклеиновой природы находят широкое применение в качестве лекарственных средств. Отечественный фармакопейный препарат - панкреатический гидролизат РНК, известный под названием Энкад, представляет собой смесь олигонуклеотидов и пиримидиновых нуклеозид-3'-фосфатов. Препарат регулирует обмен нуклеотидов в тканях, обладает имму-номодулирующими свойствами, способствует улучшению функций клеточных мембран, проведению импульса по двигательным нервам, уменьшению миодистрофических процессов и оптимизации биоэнергетики мышц. Препарат применяется для лечения наследственных тапеторетинальных абиотрофий - заболеваний, приводящих к слабовидению и слепоте. До настоящего времени не существует эффективных методов лечения этой группы болезней в мире. Препарат также разрешен к применению при болезни Шегрена, при дегенеративных заболеваниях нервно-мышечной системы: наследственных формах миопатий (ранние стадии), врожденном и приобретенном миопатическом синдроме, различных формах невральных абиотрофий, последствиях нейро-инфекций, спинальных амиотрофиях. Показана клиническая эффективность применения препарата Энкад при ряде других социально значимых заболеваниях (язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, псориаз, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз).
Ранее сухая субстанция Энкада выпускалась на предприятии НПО «Био-лар» (г.Олайне, Латвия) при использовании в качестве сырья РНК дрожжей p.Torula, производства которых прекращены. Лекарственная форма препарата, выпускаемая в настоящее время на Харьковском предприятии по производству бактерийных препаратов (Украина), поставляется в Россию в ограни-
5 ченных количествах, не удовлетворяющих потребности РФ. В связи с этим организация производства субстанции Энкад и его инъекционной формы на территории РФ является актуальной. Наиболее перспективным сырьем получения РНК в настоящее время для России являются хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые не требуют организации специального производства, так как выпускаются промышленностью в больших объемах и также образуются в значительных количествах в качестве отходов спиртового производства.
Для получения панкреатического гидролизата РНК используется рибонуклеаза, выделяемая из бычьей поджелудочной железы - отхода мясоперерабатывающей промышленности. Известно, что себестоимость большинства биологически активных веществ, получаемых с использованием ферментов, в значительной степени зависит от стоимости последних. Существующие технологии получения рибонуклеазы многостадийны, длительны и характеризуются низким выходом фермента. В настоящее время накоплен огромный опыт переработки и выделения различных комплексов ферментов из поджелудочной железы. В связи с этим актуальным является совершенствование технологии получения ферментного препарата рибонуклеазы для создания эффективного и малоотходного производства. Рибонуклеаза помимо этого широко используется в медицине в качестве противовирусного средства и применяется в области молекулярной биологии.
Таким образом, современные потребности РФ в лекарственных препаратах отечественного производства настоятельно требуют разработок технологий на основе дешевого и доступного сырья в условиях комплексного производства.
Цель исследований. Разработать научные основы технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой РНК, а также ферментного препарата рибонуклеазы из бычьей поджелудочной железы, соответствующих требованиям фармакопеи.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи: 1) Разработать технологический режим получения панкреатического гидро-лизата дрожжевой РНК как субстанции препарата Энкад, обеспечивающий повышение выхода целевого продукта:
- изучить возможность использования нового источника сырья натрие
вой соли низкомолекулярной РНК из хлебопекарных дрожжей для по
лучения панкреатического гидролизата требуемого качества.
- разработать условия повышения стабильности состава панкреатиче
ского гидролизата.
2) Разработать режим основных технологических стадий извлечения рибо-нуклеазы из бычьей поджелудочной железы: экстракции, концентрирования, осаждения и очистки фермента с целью повышения выхода целевого продукта.
Научная новизна. Впервые разработана технология получения препарата панкреатического гидролизата РНК из хлебопекарных дрожжей Saccharo-myces cerevisiae, отвечающего требованиям, предъявляемым к субстанциям лекарственных форм.
Впервые показана возможность применения миндальной кислоты на стадии ультрафильтрации в качестве ингибитора рибонуклеаз микроорганизмов, что позволило стабилизировать состав готового продукта с сохранением качества и увеличить его выход.
Проведено количественное изучение процессов гидролиза полирибонук-леотидов дрожжей, отделения от высокомолекулярных компонентов продуктов гидролиза и осаждения их из водно-спиртового раствора, что позволило разработать алгоритм управления технологическим процессом.
Проведено количественное изучение процессов извлечения рибонуклеазы из бычьей поджелудочной железы водными растворами серной кислоты, ультраконцентрирования экстракта, осаждения фермента в изоэлектрической точке из водных растворов и спиртового осаждения, что позволило разработать алгоритм управления технологическим процессом.
Практическая значимость. Разработана технология получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты из хлебопекарных дрожжей с увеличением выхода продукта на 10-12% по сравнению с известными технологиями. Показано, что применение ингибитора рибонуклеаз - миндальной кислоты на стадии ультраконцетрирования позволило повысить стабильность состава готового продукта при сохранении его нетоксичности и апирогенно-сти.
Разработаны основные стадии технологического процесса получения ферментного препарата рибонуклеазы (из бычьей поджелудочной железы) и условия их проведения, обеспечивающие увеличение выхода продукта до 0,5% мае. от сухой железы, что в 4,2 раза выше по сравнению с существующими технологиями.
Нуклеиновые кислоты и их производные. Метаболизм рибонуклео-тидов. Характеристика, способы получения и применение панкреатического гидролизата дрожжевой РНК
Нуклеиновые кислоты и их производные являются непосредственными и незаменимыми участниками в реакциях репликации, транскрипции и трансляции, в гликолизе, цикле Кребса и окислительного фосфорилирования, в окислении жирных кислот, при биосинтезе липидов. Различные нуклеотиды и их производные, выполняя в клетке самые разнообразные функции во всех звеньях обмена, играют интегративную роль в сети метаболических путей [1].
Молекулы рибонуклеиновой кислоты представляют собой длинные полимерные цепи, построенные из рибонуклеотидов, состоящих из остатка ри-бозы, этерифицированного по одной из оксигрупп остатком фосфорной кислоты и связанного N-гликозидной связью с азотсодержащим гетероциклом.
Рибонуклеотиды синтезируются у всех организмов по общим путям. Большинство клеток синтезирует пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды по пути de novo. Он представляет собой главный путь образования предшественников нуклеиновых кислот, а для оснований (пуринов и пиримидинов) -единственный путь их биогенеза. Таким образом, основания не синтезируются в свободном виде, а пуриновый и пиримидиновый циклы собираются постепенно из 5-фосфо-рибозил-1-пирофосфата (ФРПФ) и сразу идет образование готовых нуклеотидов.
Скорость синтеза пуриновых и пиримидиновых рибонуклеотидов является объектом тонкой регуляции. Сформировались механизмы, обеспечивающие такой уровень продукции этих соединений во времени, который удовлетворяет постоянно меняющиеся физиологические потребности организма. Наряду с синтезом de novo включается запасной путь, известный в литературе как "salvage" (селвидж) - синтез, или "реакция сбережения", благодаря которому происходит реутилизация пуриновых оснований, высвобождаемых из нуклеиновых кислот при деградации in vivo, которые не подвергаются дальнейшему расщеплению, а сберегаются. У человека сбережение аденина имеет, по-видимому, меньшее значение по сравнению с гуанином и гипоксантином, поскольку основные пути распада этих нуклеотидов приводят к образованию свободного гипоксантина (из АМФ) и гуанина (из ГМФ) (Рис. 1.1.1) [2].
Рассмотрим, что ещё может служить источником свободных пуриновых оснований, используемых для ресинтеза пуринов.
Нуклеиновые кислоты поступают в организм с пищей главным образом в составе нуклеопротеинов и высвобождаются в результате действия протео-литических ферментов. Панкреатический сок содержит рибонуклеазы и де-зоксирибонуклеазы, гидролизующие нуклеиновые кислоты до нуклеотидов. Полинуклеотидазы или фосфоэстеразы кишечника, дополняя действие панкреатических нуклеаз, также гидролизуют нуклеиновые кислоты до моно-нуклеотидов. Далее, под воздействием нуклеотидаз и фосфатаз происходит гидролиз нуклеотидов до нуклеозидов, которые либо всасываются, либо под воздействием фосфатаз слизистой кишечника деградируют до пуриновых оснований. Основания могут подвергаться окислению: гуанин, например, окисляется до ксантина и затем до мочевой кислоты; аденозин превращается в инозин, затем в гипоксантин и далее в мочевую кислоту. Мочевая кислота всасывается в кишечнике и затем выделяется с мочой. В организме человека большая часть пуринов, высвободившихся из нуклеиновых кислот, которые поступают с пищей, превращаются в мочевую кислоту.
Таким образом, хотя пищевые продукты содержат пурины в виде нуклеиновых кислот, но большая их часть разрушается эпителиальными клетками кишечника и не поступает в кровь. Напротив, пурины, введенные в кровоток, утилизируются клетками [3].
Место синтеза большинства пуринов - печень. Доказано, что она высвобождает их в кровь для использования другими клетками, например ретику-лоцитами, которые не обеспечены полной системой синтеза de novo. Возможно также, что клетки используют пуриновые основания, образовавшиеся при распаде нуклеиновых кислот. При липосомальном разрушении компонентов клеток, содержащих нуклеиновые кислоты, по-видимому, освобождаются преимущественно свободные основания. И хотя значение синтеза пу-риновых оснований из фрагментов не вызывает сомнений, нет полной информации о перемещении свободных оснований в организме [4].
При исследовании ферментных систем, связанных с синтезом нуклеоти-дов, показано, что селвидж-синтез осуществляется там, где не может происходить синтез de novo, в клетках крови, костного мозга, нервных волокон, где отсутствуют ферменты, отвечающие за синтез нуклеотидов. Селвидж-синтез в одних случаях выступает в качестве повторного использования естественных метаболитов, в других, в случае генетически обусловленного нарушения в метаболизме организма, - в качестве запасного биосинтеза мономеров нуклеиновых кислот.
Объекты исследования
В работе использовали РНК и нуклеинат натрия хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae иp.Candida (p.Torula) (тип VI) ФС 42-1781-82 и производства фирм ICN и Sigma с содержанием основного вещества не менее 70% и представляющих собой гетерогенный нуклеотид.
Объектом изучения явилась замороженная до температуры -20С бычья поджелудочная железа производства ОАО Раменский мясокомбинат, содержащая 20% воздушно-сухих (СВ) и 25%-белковых веществ в пересчете на СВ.
Гидроксид натрия квалификации «чда» ГОСТ 4328 -86; Аммиачная вода квалификации «чда» ГОСТ-3760-84.
Минеральные кислоты:
Соляная кислота квалификации «чда» ГОСТ 3118-87; Серная кислота квалификации «чда» ГОСТ 4204-86; Хлорная кислота квалификации «хч» ТУ 6-09-2878-84; Трихлоруксусная кислота квалификации «хч» ТУ.
Ферментные препараты:
Рибонуклеаза бычьей ПЖ 8-14 тыс. ед/мг (по Калницкому), ФС 42-2673-89. 2.3. Методы анализа.
Колориметрический метод определения белка в растворах и готовом продукте модифицированным методом Лоури.
Метод основан на образовании окрашенных продуктов синего цвета, образующихся в результате двух самостоятельных реакций: биуретовой реакции белка с ионами меди в щелочной среде и реакции восстановления фосформолибденовой и фосфорвольфрамовой солей реактива Фолинз тиро-зиновыми, триптофановыми и фенилаланиновыми радикалами, присутствующими в белке [88]. Калибровочные растворы готовили на основе очищенного препарата бычьего сывороточного альбумина квалификации чда. Разделение белков и крупных пептидов от растворимых низкомолекулярных белковых компонентов осуществляли осаждением 50%-ой ТХУ.
Содержание белковых веществ в растворе определяли по формуле:
P = X-N/V (2.3.1), где
Р - содержание белковых веществ в растворе, мг/мл;
X - концентрация белковых веществ, найденная по калибровочному графику,
мг/мл;
N - разведение анализируемого раствора;
V - объем пробы, взятый для анализа, мл.
Содержание белка в готовом продукте определяли по формуле:
Р = Х _-100% (2.3.2), где
Н Р - содержание белка в готовом продукте, %;
X - концентрация белковых веществ, найденная по калибровочному графику,
мг/мл;
а - объем раствора препарата, в котором растворена навеска, мл;
Н - навеска препарата, мг.
За результат испытаний принимали значение, полученное на основе трех параллельных измерений, статистически обработанных по критерию Стьюдента для уровня значимости 0,05.
Достоверность полученных экспериментальных данных оценивали по результатам трех параллельных опытов, используя критерий Стъюдента для уровня значимости 0,05. Величина доверительного интервала в определении активности ферментов составила не более ±5%.
Определение удельной активности рибонуклеазы в растворах и готовом продукте методом Кунитца.
Метод основан на сдвиге в ультрафиолетовом спектре дрожжевой РНК в сторону более коротких длин волн [89]. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое вызывает гидролиз РНК при константе скорости к= 1 при 25С и рН 5,0.
Определение удельной активности рибонуклеазы в растворах и готовом продукте по методу Калницкого.
Метод основан на спектрофотометрическом определении продуктов гидролиза дрожжевой НК РНК под действием ФП аморфной рибонуклеазы медицинского назначения, ФС 42-2673-98. Калибровочный график строили в координатах оптическая плотность - концентрация препарата, мкг/л, разбавленного буферным раствором исходного раствора препарата в интервале от 0,2 до 2 мкг/мл при длине волны 260 нм. Прямолинейный участок зависимости соответствовал оптимальным концентрациям. За единицу активности принимали такое количество продуктов, образовавшихся в результате ферментативного гидролиза, которое приводит к изменению оптической плотности реакционной смеси на 1,0 за 4 мин при температуре 37С [90].
Объекты исследования
В данном разделе работы приводятся экспериментальные данные по ферментативному гидролизу дрожжевых полирибонуклеиотидов бычьей панкреатической рибонуклеазой, который является ключевой стадией получения панкреатического гидролизата, и анализ количественных закономерностей этого процесса, позволивший построить математическую модель и установить оптимальные параметры для проведения процесса получения низкомолекулярной фракции панкреатического гидролизата РНК и допустимые отклонения их значений, не оказывающих влияние на качество получаемого препарата Энкад, соответствующего ТУ № 6-09-10-1622-84 и ВФС №.42-1758-87.
Массив экспериментальных данных, необходимый для проведения количественных исследований процесса гидролиза дрожжевой РНК панкреатической рибонуклеазой КРС, формировался из серии опытов, где изучали влияние следующих параметров на скорость гидролиза: температуры, рН среды, содержания ферментного препарата, начальной концентрации полирибонуклеотидов и времени проведения гидролиза. В предварительных экспериментах исходная натриевая соль РНК была проверена на наличие посторонней РНК-азной активности и была определена устойчивость самого субстрата к воздействию температуры и рН среды. Для этого проводили контрольный гидролиз полирибонуклеотидов при температуре 65С, рН среды 5,5 без добавления РНК-азы. Результаты эксперимента показали, что самопроизвольное разрушение РНК не превышает 5-10 %.
Ферментативный гидролиз рибонуклеиновой кислоты дрожжей изучали с позиций формальной кинетики процесса по кривым накопления низко-молекулярной фракции (НМФ) и расходования исходной высокомолекулярной фракции (ВМФ) [99-101]. В качестве параметров рассматриваемого процесса, оказывающих наибольшее влияние на степень гидролиза, были выбраны температура, рН среды, содержание ферментного препарата и начальная концентрация полирибонуклеотидов, которые меняли соответственно в интервалах: 35 - 80 С; 4,5 - 8,0; 0,025 - 0,200 г/л; 25,0 - 100,0 г/л.
При разработке подходов к созданию математической модели процесса гидролиза РНК руководствовались следующими данными: ферментативный гидролиз бычьей панкреатической рибонуклеазой протекает с образованием различных по длине олигонуклеотидов (до 10-12 оснований) и низкомолекулярных продуктов гидролиза - пуриновых и пиримидиновых нуклеозидмо-нофосфатов, образующих низкомолекулярную фракцию (НМФ) панкреатического гидролизата. Низкомолекулярные продукты более глубокого гидролиза (из-за присутствия посторонней ферментативной активности) формируют низкомолекулярные компоненты (НМК) гидролизата. Процесс гидролиза полирибонуклеотидов изучали по изменению содержания нуклеиновых кислот в ВМФ и НМФ при разделении их 50%-ным раствором трихлоруксус-ной кислоты (ТХУ) и изменению содержания НМК в НМФ методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).
Исследование кинетики процесса гидролиза дрожжевой РНК и накопления низкомолекулярных продуктов начали с проведения гидролиза при одной и той же концентрации фермента и различными начальными концентрациями субстрата. На рис. 3.1.1.1 приведены типичные для этих ферментативных превращений кривые. Там же представлены данные повторных опытов с целью проверки их воспроизводимости с указанием доверительных интервалов в определении значений концентраций субстрата по данным статистического анализа и отвечающие различным начальным концентрациям субстрата в растворе, полученные при температуре 65 С, рН среды 5,5 и начальной концентрации фермента - 0,200 г/л.
