Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Волокнообразующие текстильные материалы на основе целлюлозы и поликапроамида содержащие биологически активные вещества, используемые для лечения ран различной этиологии (обзор литературы)
1.1. Активация и свойства некоторых волокнообразующих тек стильных носителей на основе целлюлозы и поликапроамида для иммобилизации биологически активных веществ
1.1.1. Получение и свойства диальдегидцеллюлозы
1.1.2. Получение и свойства поликапроамидного носителя активированного глутаровым диальдегидом
1.1.3. Получение поликапроамидного носителя с собственными альдегидными группами
1.2. Получение и свойства ферментов, иммобилизованных на производных целлюлозы и поликапроамида
1.3. Использование нативных и иммобилизованных ферментов для лечения ран различной этиологии
Глава II. Методы и материалы
II. 1. Материалы
II. 2. Методы модификации текстильных носителей. Определение степени модификации носителя
11.3. Определение протеолитической активности по казеину
11.4. Определение ферментативной активности по азоколу
11.5. Определение ферментативной активности по паранит-роанилиду ТчГ-бензоилЛЭ, L-аргинина (BzArgNA)
11.6. Определение ферментативной активности по коллагену
Глава III. Разработка методов оценки функциональных свойств созданных материалов
ПІЛ. Особенности при работе с иммобилизованными на моди фицированных текстильных носителях биологически активными веществами
Ш.2. Методы определения количества иммобилизованного ве щества
ІІІ.2.1. Определение количества иммобилизованного белка методом Лоури-Гартри
Ш.2.2. Определение количества иммобилизованного белка гистохимическим методом Гурвича
Ш.2.3. Определение количества иммобилизованного белка по спектрам отражения
Ш.2.4. Определение количества иммобилизованного белка с
помощью метода Брэдфорда
Ш.З. Методы определения ферментативной активности иммобилизованных препаратов
Ш.3.1. Определение протеолитической активности иммобилизованных препаратов по казеину
Ш.3.2. Определение ферментативной активности иммобилизован-ных препаратов по азоколлу
ПІ.З.З. Определение амидазной активности иммобилизованных препаратов по BzArgNA
Глава IV. Технологии иммобилизации трипсина на модифицированных текстильных - носителях и исследование свойств полученных иммобилизованных препаратов стр.
IV.1.1. Иммобилизация трипсина на текстильные носители. Изменение протеолитической активности иммобилизованных препаратов трипсина в процессе хранения 170
IV.1.2. Действие гамма облучения на препараты иммобилизованного трипсина 177
IV.2. рН-зависимость протеолитической активности иммобилизованных препаратов трипсина 182
IV.3. Инактивация иммобилизованного трипсина в модельных растворах, 196
IV.4. Влияние некоторых физиологически-активных веществ на протеолитическую активность немодифицированного трипсина и трипсина, иммобилизованного на текстильных носителях
IV.5. Токсикологические и фармакологические исследования 221
IV.6. Технологическая схема производства препаратов иммобилизованного трипсина 236
Глава V. Разработка технологии? получения препаратов иммобилизованных протеолитических комплексов из отходов переработки пищевого сырья на. модифицированных текстильных носителях и исследование свойств полученных иммобилизованных композитов 237
V.I. Иммобилизация на диальдегидцеллюлозе коллитина и исследование свойств полученных иммобилизованных препаратов 251
V.2. Иммобилизация на различных текстильных носителях протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба (ПК) и исследование свойств полученных иммобилизованных препаратов стр. 255
V.2.1. Иммобилизация ПК на.различные текстильные носители.4
Изменение протеолитической активности иммобилизованных препаратовв процессе хранения 266
V.2.2. рН-зависимость протеолитической активности немодифицированного ПК иПК, иммобилизованного на модифицированных текстильных носителях 272
V.2.3. Инактивация ПК и иммобилизованного на текстильных носителях ПК в модельных растворах 280
V.24.4. Влияние некоторых физиологически-активных веществ на протеолитическую активность немодифицированного ПК и ПК, иммобилизованного на текстильных носителях
V.2.5. Влияние белковых ингибиторов, на ферментативную активность немодифицированного ПК и ПК, иммобилизованного на текстильных носителях
V.2.6. Медико-биологические исследования препаратов иммобилизованного ПК
Глава VI. Разработка технологии получения препаратов иммобилизованного поливалентного ингибитора протеиназ (ПИП) на модифицированных текстильных носителях и исследование свойств полученных препаратов иммобилизованного ингибитора
VI. 1. Взаимодействие трипсина с раствором ПИП 308
VI. 2. Иммобилизация ПИП на текстильных носителях. Исследование свойств полученных композиций
VI. 2.1. Иммобилизация ПИП на целлюлозе и диальдегидцеллюлозе
VI. 2. 2. Иммобилизация ПИП на поликапроамидном текстильном материале 312
VI. 3. Определение ингибиторных свойств иммобилизованного ПИП 314
VI. 4. Кинетика взаимодействия раствора трипсина с текстильными носителями, содержащими ПИП
VI. 5. Действие у-излучения в стерилизующей дозе на иммобилизованный и кристаллический ПИП стр.
Глава Технико-экономическое обоснование использования препаратов иммобилизованых ферментов
Заключение и выводы. 334
Список литературы.
- Получение и свойства диальдегидцеллюлозы
- Определение протеолитической активности по казеину
- Определение количества иммобилизованного белка гистохимическим методом Гурвича
- Влияние некоторых физиологически-активных веществ на протеолитическую активность немодифицированного трипсина и трипсина, иммобилизованного на текстильных носителях
Введение к работе
Актуальность проблемы. Полимерные системы с иммобилизованными белками и другими разнообразными биологически активными веществами (БАВ) находят все более широкое применение в биотехнологии и различных областях медицины. Уникальные свойства ферментов, такие как высокая специфическая активность, непревзойденная субстратная специфичность и другие, предопределили перспективность их практического применения. Несмотря на высокую эффективность использования различных ферментов в медицине и промышленности, следует учитывать их лабильность, антигенные и пироген-ные свойства. Нативные ферментные препараты дороги и многие из них дефицитны, они быстро выводятся из организма, либо утилизируются им, что ограничивает их широкое применение. Преодолеть эти недостатки удается иммобилизацией ферментов на различных природных и синтетических носителях. Важной предпосылкой к интенсивному внедрению энзимологии в медицину и фармацевтику явилось решение теоретических и практических вопросов модификации ферментов с приданием им новых свойств, причем именно таких, которые имеют практическое значение для терапии человека. При этом возникает необходимость изучения методов иммобилизации, свойств носителя и его влияния на свойства иммобилизованного биологически активного вещества, а также исследования полученных иммобилизованных препаратов в модельных эксплуатационных условиях.
Известно, что с древнейших времен и до настоящего времени для изготовления медицинских перевязочных средств во всем мире используются материалы из природной целлюлозы. Изделия из целлюлозы обладают прекрасными санитарно-гигиеническими свойствами, но при этом целлюлоза не взаимодействует химически с биологическими субстанциями, она пассивно участвует в процессе очищения раны: всасывает раневое отделяемое, защищает рану от аэрогенной контаминации и сохраняет термальный режим в раневой среде. Модифицированные текстильные материалы, даже не содержащие лекарственные
вещества, взаимодействуют с раневым отделяемым, т.е. принимают участие в активном очищении раны. Наличие же лекарственного препарата в материале способствует заживлению раны. Ферменты, иммобилизованные на перевязочных материалах, активно участвуют в процессе заживления ран, не вызывая побочных эффектов. Необходимо учитывать, что перевязочные материалы - одноразовые средства с небольшим сроком эксплуатации (до 72 часов), поэтому их биологическая активность должна максимально реализоваться при наложении на рану. Введение в очаг поражения лекарственных средств, иммобилизованных на текстильных носителях, не вызывает побочных эффектов и позволяет одновременно решить несколько задач: повысить действенность препарата, снизить его расход, устранить нежелательное воздействие препарата на здоровые органы и ткани.
Работа выполнялась по планам и научно-техническим программам: Мин-легпром СССР (1986-1989 гг.), ГКНТ и Министерства науки и технической политики РФ (1990-1993 гг.), Минпром РФ (1993 г), Миннауки РФ (1997-1998 гг.), Минпромнауки РФ (1999-2002 гг.), Минпромэнерго РФ (2004-2006), АО "Московский комитет по науке и технике" при правительстве г. Москвы (1993-1994 г., 2000-2002 г.), в рамках ФЦНТП на 1996-2001 и 2002-2006 гг. «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники», в рамках государственной научно-технической программы России «Новейшие методы биоинженерии», в рамках исследовательских программ НИИ текстильных материалов (1986-2008 гг.).
Цель и задачи исследования. Цель работы - создание высокоэффективных раневых покрытий нового поколения, создание и разработка промышленной технологии их получения. Кроме того, нами были проведены многоплановые исследования полученных иммобилизованных БАВ на модифицированных текстильных носителях.
В связи с этим решались следующие задачи:
-
Разработка промышленных технологий получения иммобилизованных лекарственных препаратов.
-
Получение иммобилизованных биологически активных препаратов на текстильных носителях, которые сохраняют лечебные свойства и стерильность после высушивания на протяжении необходимого времени хранения (не менее 3-х лет) в стандартных условиях.
-
Разработка удобных и достоверных методов оценки содержания биологически активных веществ на нерастворимых текстильных носителях и методов определения биологической активности ферментных препаратов, иммобилизованных на этих носителях.
-
Исследование физико-химических свойств полученных препаратов.
-
Выявление связи между потерей протеолитической активности у моно- и полиферментных протеолитических препаратов и сроком их хранения. Установление максимально допустимого срока, в течение которого сохраняются достаточные лечебные свойства иммобилизованных препаратов.
-
Экспериментальное обоснование возможности эффективного биомедицинского использования иммобилизованных на текстильных носителях лекарственных препаратов.
-
Проведение токсикологических и санитарно-гигиенических испытаний разработанных материалов.
Научная новизна работы. Разработаны лабораторные и промышленные технологии получения текстильных материалов с иммобилизованными биологически активными веществами (протеиназами, ингибиторами и лекарственными препаратами) различного спектра действия.
Впервые получено новое поколение перевязочных средств - текстильных материалов комплексного действия, в состав которых входят хитозан и протео-литический комплекс из гепатопанкреаса краба (Патент RU № 2 323 748 С2).
Разработаны методы оценки содержания различных биологически активных веществ на нерастворимых модифицированных текстильных носителях и
методы оценки биологической активности иммобилизованных препаратов.
Впервые установлена взаимосвязь между потерей протеолитической активности у иммобилизованных на нерастворимых модифицированных текстильных носителях моно- и полиферментных протеолитических препаратов и сроком их хранения в стандартных условиях.
Установлены радиопротекторные свойства диальдегидцеллюлозы (ДАЦ) высокой степени окисления (более 1,5 мгЭкв/г) и полиамидного текстильного материала в случае гамма-стерилизации.
Впервые проведено токсикологическое изучение текстильных материалов медицинского назначения (ДАЦ-коллитин, ДАЦ-ингибитор, "Мультиферм"). Доказано, что изученные материалы не обладают токсическим, гемолитическим, аллергенным действием, а также цитотоксическим эффектом и мутагенной активностью.
Практическая значимость работы. Разработанные технологии получения текстильных материалов медицинского назначения с иммобилизованными БАВ позволяют получить новое поколение перевязочных средств и покрытий для лечения гнойно-некротических ран.
Разработана технология производства полиферментных препаратов (на основе протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба и модифицированных текстильных носителей). Для полученных препаратов проведены клинические испытания и разработан необходимый комплект нормативно-технической документации. Получены разрешающие документы на серийный выпуск медицинских изделий и их использование на территории РФ.
Организовано серийное производство и промышленный выпуск иммобилизованных форм различных биологически активных веществ на модифицированных текстильных носителях. Осуществляются поставки разработанных изделий в лечебно-профилактические учреждения Миндравсоцразвития РФ и клиники Минобороны РФ.
Практическая значимость работы подтверждается тем, что по ее результатам получено более 10 авторских свидетельств СССР и патентов РФ; результаты работы были отмечены дипломами и медалями ВВЦ и других российских и международных выставок.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены: на 3-еи Всес. науч.-техн. конф. "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органотера-певтических препаратов" (Москва, 1987); Всес. совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов" (Владивосток, 1988); 5-ои Моск. конф. по органической химии и технологии (Москва, 1989); Гом Всес. Радиобиол. съезде (Москва, 1989); Гои Всес. конф. "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и шовных материалов" (Москва, 1989); 20-th FEBS Meet. (Budapest, 1990); 2~й Нац. конф. "Биома-териали" (Варна, 1990); Всес. конф."Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990); VII Всес. симп. "Инженерная этимология" (Москва, 1991); Всес. научной конф. "Проблемы модифицирования природных и синтетических волокнообразующих полимеров (Москва, 1991); I Рос. нац. конгр. "Человек и лекарство", (Москва, 1992); 1, 2, 3-еи Межд.конф. "Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств и полимерных имплантантов" (Москва, 1992, 1995, 1998); 3, 4, 5, 6-th Int. Cong, on Wounds, Burns and Dressings, (Tel-Aviv, 1994, 1996,1998, 2000); IV, V, VI симп. "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1997, 2002, 2007); Int. conf. ВЮ-CATALYSIS-98, 2000, 2002, 2005, Fundamentals & applications (Puschino on the Oka 1998, Moscow 2000, 2002, St. Petersburg 2005); Всерос. науч.-техн. конф. "Современные технологии и оборудование текстильной промышленности" (Москва 1998, 2002, 2006); Моск. конф. «Иммобилизация лекарственных средств на текстильные носители - современный подход к снижению лекарственной нагрузки (Москва, 2001); II Межд. науч.-техн. конф."Текстильная химия
- 2004"; Гм, 2~м, 3"м, 4"м Межд. конгрессах «Биотехнология состояние и пер
спективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005,2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 111 печатных работы, из них 12 авторских свидетельств СССР и патентов РФ и 25 статей.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных наблюдений, заключения, выводов, списка литературы и приложений.
Получение и свойства диальдегидцеллюлозы
При использовании волокнистых носителей, которым присуща большая удельная поверхность, удается осуществить иммобилизацию ферментов без существенной инактивации последних [[8-12].
Для закрепления ферментов на волокнистые носители используют как физические методы (введение в полые волокна или прядильные растворы перед формованием), так и химическую модификацию [7].
Метод введения ферментов в полые волокна путем, «втягивания» их растворов за счет капиллярной проницаемости с последующей герметизацией запаиванием их концов,реализован для волокон из гидратцеллюлоза, по-ливинилхлорида, полисульфона и полиариламида. Такие волокнам активны только в отношении низкомолекулярных субстратов [7].
Применение другого метода — формование волокон из растворов или расплавов, содержащих ферменты, ограничено низкой термстабильностью нативныхформ ферментов и соответственно трудностью подбора полимеров, растворителей и условий формования, не вызывающих денатурацию ферментов [7,9,10].
ИзвеСТНО, ЧТО С ДреВНеЙШИХ Времен И ДО НаСТОЯЩеГО Времени.ДЛЯІИЗГО товления медицинских перевязочных средств во всем мире используются материалы из.природной целлюлозы. Изделия из целлюлозы обладают прекрасными санитарно-гигиеническими свойствами, не взаимодействуя химически при этом с биологическими жидкостями и тканями. Таким образом, медицинские перевязочные материалы из природной целлюлозы пассивно участвуют в процессе очищения раны, сорбируя продукты- распада тканей, защищает рану от аэрогенной контаминации и сохраняет термальный режим в раневой среде [3,7,10].
Целлюлоза (Ц) и поликапроамид (ПКА) могут быть использованы как носители для иммобилизованных БАВ, без предварительной модификации, для иммобилизации методом адсорбции. Адсорбция - "мягкий!1" метод иммобилизации, который, как правило, слабо влияет на активность иммобилизованного БАВ» [9]. Главный недостаток этого метода состоит в том, что БАВ может связываться с носителем недостаточно прочно. Во взаимодействии БАВ с носителем, кроме солевых (ионных) связей, могут участвовать и другие слабые взаимодействия, например водородные или вандерваальсовы связи. Десорбцию БАВ может вызвать даже незначительное изменение экспериментальных условий: рН, ионной силы, температуры и природы растворителя, а также сам субстрат [8-10]. Как известно, сорбционные способности тел определяются не только, а в ряде случаев не столько химической природой, сколько их физической структурой [9-12,14].
Иммобилизация БАВ путем образования новых химических связей является в настоящее время доминирующим способом получения перевязочных медицинских препаратов пролонгированного действия [3,7].
Важнейшим условием получения высокоактивных препаратов иммобилизованных БАВ, является участие в образовании ковалентных связей с носителем тех функциональных групп БАВ, которые не являются ответственными за ЄГОІ биологические свойства (в случае иммобилизованных ферментов - каталитические свойства), иными словами, не входят в состав активного центра БАВ и не располагаются в непосредственной близости от него [10]. Преимущество данного метода заключается в том, что БАВ, как правило, не переходят в раствор даже при очень длительном использовании (однако в случае гидролитической деструкции матрицы в раствор будут переходить БАВ модифицированные фрагментами носителя) [7-10]. Преимущество полиамидов для иммобилизации, заключается в том что им можно придать удобную - для применения форму. А функциональные группы в такие полимеры можно вводить гидролизом находящихся на поверхности амидных групп с образованием аминных и карбоксильных групп [11]. Дальнейшая модификация поликапроамида (ПКА) возможна по образовавшимся либо амино -, либо карбоксильным группам [7,10].
Для ковалентного связывания БАВ с такими носителями как целлюлоза или ПКА требуется; чтобы носитель был предварительно активирован, благодаря чему стало бы возможным его химическое связывание с молекулами БАВ. Для химического связывания белков с носителями используется большой арсенал различных методов, многие из которых приведены в работах [3,4,7-10]. Выбор в качестве носителей Ц и ПКА связан с их доступностью (производятся в промышленном масштабе), широким использованием в медицине, и невысокой стоимостью. Из данных приведенных в литературе [14], целлюлозные волокна пока доминируют на текстильном рынке (52%), весомое место занимают и синтетические полиамидные волокна (9%). Из анализа методов активации Ц нами был выбран метод селективного окисления перйодат ионами, ввиду его простоты и доступности реагентов, реакция протекает в мягких условиях (в водной среде, комнатная температура, близкое к нейтральному значение рН), не используются и необразуются токсические продукты [3,4,7-10,12-42]. Образующаяся диальдегидцеллюлоза (ДАЦ) является прекрасным носителем БАВ [7,9,10] и данный метод активации Ц используется до сих пор [43].
Определение протеолитической активности по казеину
Наибольшее применение в медицине и косметологии находят ферменты, относящиеся к группе гидролаз, а именно протеиназы [1,3-7,10,36,46,49,52,64,65,67,72,83-89,91-100]. Ферменты этой группы обладают необычайным разнообразием строения, механизмом действия и функций [10,36,46,53,100-109].
Специфичность протеолитических ферментов определяется величиной молекулы субстрата, и на этом основании подразделяли эти ферменты на протеиназы и пептидазы [103]. Однако, как только исследователям стало доступно большое число синтетических пептидов, обнаружилось, что такое разделение ошибочно, ибо протеиназы в действительности способны гидро-лизовать также и очень небольшие пептиды, если только эти пептиды имеют соответствующую структуру. Установив этот факт, Бергман5 радикально изменил представления [103], царившие в этой области энзимологии. Было установлено, что определяющим фактором служит не величина молекулы субстрата, а природа аминокислотных боковых групп, находящихся по соседству с гидролизуемой связью.
При исследовании,наиболее важных протеолитических ферментов-(таких как трипсин, химотрипсин, папаин, эластаза и др.) были использованы сотни синтетических субстратов и родственных соединений [36,100,102,104,106,108,109]: Однако в полученной информации имеются значительные пробелы, в частности специфичность рассматриваемых ферментов охарактеризована далеко не полностью. По мере того как становились доступными крупные пептиды с известной последовательностью аминокислот, проводились исследования специфичности пептидаз непосредственно на крупных субстратных молекулах [101-107].
В большинстве случаев результаты, полученные на крупных пептидах, совпадают с теми, которые были получены раньше на более простых субстратах; иногда, однако, в крупных пептидах обнаруживаются дополнительные чувствительные связи. Так, пепсин гидролизует в инсулине связь между лейцином и валином, которая не попала в число чувствительных по данным гидролиза ди- и трипептидов [103].
Наряду с природой аминокислот, образующих гидролизуемую связь, важной характеристикой специфичности пептидаз является положение, гидролизуемой связи; по этому признаку различают две главные группы пепти 68 даз. Экзопептидазы - это ферменты подгрупп 3.4.11.- 15, для действия которых требуется либо свободная концевая-аминогруппа (аминопептидазы), либо свободная концевая аминогруппа (карбоксипептидазы). Остальные пепти-дазы гидролизуют определенные связи, внутри цепи; действие некоторых из них тормозится; если около гидролизуемой связи- находится свободная концевая группа [6,10,36,100-109]. Так, трипсин катализирует гидролиз пептидных связей X-Y белков; содержащих в положении X основные аминокислоты, такие как лизин и аргинин, химотрипсин - ароматические аминокислоты такие как триптофан и тирозин, а панкреатическая эластаза аланин и валин [102,110]. Принципиальным, отличием коллагеназ от других протеолитиче-ских ферментов является их способность катализировать гидролиз специфической трехцепочечной спиральной белковой молекулы, которую и представляет собой коллаген, при физиологических условиях. Коллаген, как известно, представляет собой наиболее распространенный белок организмов высших животных, составляющий основу соединительной,ткани. Коллагена-за может катализировать гидролиз одной а-цепи молекулы коллагена, не затрагивая остальных, или же разрыв может произойти по всем трем цепям. При этом, возможно, что оставшаяся часть молекулы сохранит свою трех-спиральную структуру, либо гидролизоваться будут и оставшиеся фрагменты [100,103,109].
Следует отметить, что некоторые другие протеазы, такие, как трипсин, пепсин, химотрипсин, также могут катализировать гидролиз а-цепей коллагена. Однако, это относится только к концевой части молекулы коллагена, не имеющей, спиральной структуры и представляющей собой глобулярный участок, ответственный за сборку коллагеновых фибрилл. Многие протеазы, кроме того, способны гидролизовать желатин — денатурированный коллаген, также не организованный- в спиральную структуру. Такие виды протеолити-ческой активности не принято относить к коллагенолитическои активности [100].
Принадлежность протеиназы к коллагеназам можно также определить по гидролизу характерных синтетических субстратов (в основном используются защищенные гексапептиды), имитирующих наиболее часто встречающиеся последовательности в молекуле коллагена. Однако, сам по себе этот критерий не может служить достаточным условием для отнесения фермента к коллагеназам, ввиду их различной специфичности по отношению к этим субстратам.
Таким образом, единственным достаточным условием для отнесения фермента к коллагеназам может служить способность катализировать гидролиз не денатурированного коллагена в спиральной части его молекулы.
Физиологическая роль подобных протеиназ в организме может быть различной. Первая функция коллагеназ связана с процессами метаболизма соединительной ткани. Коллагеназа поддерживает соотношение между растворимой и фибриллярной формами коллагенов ткани, участвует в интенсивном лизисе соединительной ткани (например, при овуляции), играет важную роль в восстановлении повреждений [100]. Вторая функция коллагеназ может быть связана с пищеварением. Необходимость в такого рода пищеварительных ферментах обычно бывает связана со специализацией на животной пище (особенно падали). В этом случае ферменты вырабатываются в одной из пищеварительных желез (чаще всего поджелудочной железе) [100,109].
Третья функция, которую выполняют коллагеназы, это участие в процессе преодоления соединительнотканного барьера организма животного паразитами, патогенными микроорганизмами и онкоклетками. Фермент в этом случае выделяется в межклеточное пространство, как правило, вместе с набором ферментов, способных воздействовать на различные компоненты соединительной ткани и мембранные структуры. Чаще - всего это бывают эластаза, пептидазы, гиалуронидазы и фосфолипазы [103,109].
Ферментативная активность по отношению к коллагену была.выявлена, у многих микроорганизмов например: Clostridium histolyticum [112], Achro-mobacter iophagus [113] и др. Коллагенолитические ферменты были выделены также из самых разных тканей и тканевых жидкостей различных позвоночных животных [100,103,109]. Впоследствии все эти ферменты были объединены под названием «коллагеназа позвоночных» (КФ3.4.23.7). В организмах некоторых животных вырабатываются коллагеназы пищеварительного назначения. Эти ферменты секретируются поджелудочной железой или гепа-топанкреасом различных групп животных [100]. Исходным сырьем, для получения коллагеназ, может быть либо среда, в которой культивировалась
Определение количества иммобилизованного белка гистохимическим методом Гурвича
Три навески препарата (две опытные и одну контрольную массой 0,01 4- 0,15 г в зависимости от активности) помещали в стеклянные пробирки с притертой пробкой, приливали 2,5 мл 1/15М фосфатного буфера рН 7,8, и помещали в аппарате для встряхивания в термостат при температуре 37,0 ± 0,7 С. Через 10 минут в опытные пробирки быстро заливали по 2,5 мл 2% раствора казеина. В контрольные пробирки сначала заливали по 5 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), а, затем по 2,5 мл раствора казеина. Содержимое пробирки перемешивали и помещали на 60 минут, (точное время отмечали по секундомеру ±5 секунд) на аппарат для встряхивания в термостат. Реакцию останавливали добавлением в опытные пробирки по 5 мл 10% раствора ТХУ. Через 10-И 5 минут (после формирования осадка) фильтровали полученную суспензию через бумажный средне-фильтрующий фильтр (синяя полоса). Затем измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при 280 нм. Настройку спектрофотометра производили по раствору, составленному из равных частей фосфатного буфера и 10 % раствора ТХУ. Значение протеолитической активности (Апр) выражали в ПЕ/г и рассчитывали по формуле: (Доп-Дк) х Р Апр= ; (ПЕ/г) (Ш-4) g х Кт х t где: Доп- оптическая плотность опытной пробы; Дк - оптическая плотность контрольной пробы; Р - разбавление, в данном случае оно равно 10; Кт - тирозиновый коэффициент = 1.20 мл/мкМ [144]; t - время инкубации в минутах; g - навеска образца (с учетом влажности), г. В табл. 3.9 приведены данные о влиянии количества использованного носителя в качестве контроля. Таблица 3.9. Влияние условий инкубации и массы текстильных носителей на значение оптической плотности Д28о- Тип носителя Неокисленная целлюлоза ДАЦ 0, ст. окисления . мгЭкв/г ДАЦ ст. окисления 1,7 мгЭкв/г навеска образца, г 2% р-р казеина 0,1509 0,1511 0,1041 0,1542 0,1535 0,1065 0,1521 0,1509 0,1072 Условия — — ТХУ ТХУ — ТХУ ТХУ — ТХУ ТХУ Д280 0,143 0,147 0,158 0,132 0,155 0,170 0,155 0,236 0,230 0,166 ТХУ - образцы проводили по методике как контрольные образцы (инкубация с 10% раствором ТХУ). - образцы проводили по методике как опытные образцы. 131 Продолжение Таб. 3.9. Тип носителя ПКА-ГА 0,ЮмгЭкв/г ПКА-А ст. модификации 0,151 мгЭкв/г ПКА-А ст. модификации 0,083 мгЭкв/г навеска образца, г 0,1738 0,1739 0,2039 0,2264 0,2114 0,3407 0,2270 0,2211 0,1338 0,3600 Условия — ТХУ — — ТХУ ТХУ — ТХУ ТХУ ТХУ Д280 0,140 0,139 0,145 0,163 0,148 0,150 0,177 0,182 0,149 0,214 ТХУ - образцы проводили по і методике как контрольные образцы (инкубация с 10% раствором ТХУ). — - образцы проводили по методике как опытные образцы.
Следует обратить внимание, что в таблице 3.9 приведены данные для «свежих» модифицированных текстильных носителях, т.е. матрицы не подвергались никакому внешнему воздействию. При хранении образцов, разница между оптической плотностью раствора казеина и раствора казеина с текстильным носителем увеличивается1. Многие БАВ для иммобилизации, могут содержать различные неорганические (сульфаты, фосфаты) или органические ионы (это особенно касается БАВ для пищевых, а не для медицинских целей), которые могут существенным образом влиять на свойства модифицированного текстильного носителя (особенно на основе целлюлозы) в процессе длительного хранения и это невозможно учесть при получении носителя для контрольных опытов.
На рис.3.1 и 3.2 приведены спектры растворов, полученных после инкубации образцов ДАЦ различной степени окисления в течение 24 часов в растворе фосфатного буфера (ФБ), рН 7,8 при 37 С.
Длина волны, Зі Рис. 3.1. УФ спектр раствора, полученный после выдерживания образца ДАЦ (навеска ДАЦ 0.15 г, в 5 мл в 1/15 ФБ (рН 7.8), степень окисления ДАЦ 0,75 мгЭкв/г) в течение 24 часов, при 37С.
Здесь и далее все спектрофотометрические измерения были проведены на спектрофотометре фирмы Shimadzu (Япония) модель UV-2100. Д - оптическая плотность Длина волны, к Рис. 3.2. УФ спектр раствора, полученный после выдерживания образца ДАЦ (навеска ДАЦ 0.15 г, в 5 мл в 1/15 ФБ (рН 7.8), степень окисления ДАЦ 1,58 мгЭкв/г) в течение 24 часов, при 37С.
Следует еще раз отметить, что более длительная инкубация и более вы сокая температура будут увеличивать интерферирующее влияние модифици рованного текстильного носителя на полученные результаты.
При определении протеолитической активности (ПА) по казеину [145], выбор навески образца (не более 0.12 г) и изменение оптической плотности раствора за счет протеолиза (не более 0,4-Ю,5 оптических единиц) продиктовано теми же причинами, что были указанны выше.
Для полиамидной матрицы, активированной глутаровым альдегидом, при использовании в качестве контроля пробы с обратным добавлением реактивов (сначала к контрольным образцам приливается раствор ТХУ, а затем добавляется раствор казеина) навеска контрольного образца равнялась навеске опытного. Как нами было установлено в специально проведенных опытах [145,167], навеска для контрольных проб должна составлять 65 4- 75% от навески опытного образца препарата иммобилизованного на ДАЦ со степенью окисления до 1мгЭкв/г, и на неокисленной целлюлозе (см. данные таб. 3.9). Это, возможно, связано с различной деструкцией как самой матрицы так и казеина, контрольной и опытной проб (из-за сильной разницы рН растворов) [27]; в связи со значительной разницей рН контрольного и опытного растворов по-разному должна происходить сорбция (взаимодействие) раствора казеина и продуктов реакции с текстильным носителем; после иммобилизации на носителе остается значительное количество свободных альдегидных групп, которые могут "связывать" как продукты реакции, так и сам казеин, который берется в значительном избытке. В качестве контроля также можно использовать носитель, не содержащий фермент, той же массы, что и опытные образцы, и обработанный аналогично опытным образцам. Как было установлено в специально проведенных опытах, даже при иммобилизации в "кислых" условиях и отмывке носителя от сорбированного белка дистиллированной водой и растворами "кислого"" значения рН в результате гидролитической деструкции носителя степень окисления ДАЦ уменьшается приблизительно на Ю-т-20 % (для степени окисления ДАЦ около 1 мгЭкв/г) [143,144,154]: При совместной инкубации с ТХУ таких веществ как растворы фурагина или фурацилина (контрольные опыты) происходит уменьшение оптической плотности раствора- казнеина на 10-ь15 % по сравнению с опытными образцами. Аналогичные данные получены при совместной инкубации раствора казеина, текстильных носителей, и растворов ТХУ, фурагина или фурацилина.
В табл. 3.10 приведены данные по взаимодействию растворов тирозина из модельного раствора (1/I5M ФБ, рН=7.5). Для анализа использовались образцы ДАЦ со степенью окисления 0;75±0,09 мгЭкв/г.
Влияние некоторых физиологически-активных веществ на протеолитическую активность немодифицированного трипсина и трипсина, иммобилизованного на текстильных носителях
Лоури и протеолитическую активность (А) по казеину по-Гаммерстену (если это не указано) или другому субстрату (указано-в скобках). За 100% принимали активность влажных образцов, (влажность образцов составляла 60-75%) до высушивания (Ао), полученные данные приведены в таблицах 4.1.
Из анализа таблиц 4.1. и литературных данных, следует, что снижение протеолитической активности при иммобилизации, в мокрых образцах (до высушивания) может происходить вследствие автолиза в слабо кислых, нейтральных или щелочных-значениях рН. Как следует из работы [171];, Тр под-вергается автолизу уже при концентрации, фермента выше 1x10" М (в пересчете на активный фермент). В- технологических условиях концентрация фермента при иммобилизации гораздо, выше, а как следует из литературных и собственных данных [10,72,101,102,139,143,171473, табл.4.4.] по инактивации Тр в модельных растворах при (25С), в.процессе иммобилизации при рН 5 и СТр. 0,1 мг/мл может происходить инактивация фермента. Как отмечалось во многих работах [4,9Д 0,46,58-62,72-74]; модификация, (связывание с альдегидами) є-аминогрупп трипсина не ведет к значительному падению ферментативной активности последнего. Значительные потери протеолитической. активности (ПА) проявляются при высушивании и. в первые месяцы хранения иммобилизованных ферментных препаратов [130,174,175]. Данное явление имеет место, как для целлюлозных, так и ПКА носителей (несмотря на отсутствие пор у последних). Причем нахождение влажного препарата (остаточная влажность 60-75%) в течение 3-х суток при температуре 5+2 С, как было нами установлено, не ведет к изменению ПА, и ПА после высушивания иммобилизованного фермента не зависит от времени нахождения иммобилизованного влажного препарата при пониженной температуре.
Полученные данные приведены на рис. 4.1а-4.1г. Следует обратить внимание, что при измерении протеолитической активности, образцов в процессе хранения, значение протеолитической активности менее 0,1 ПЕ/г определено со значительной погрешностью (более 20%), а для величины протеолитической активности менее 0,05 ПЕ/г погрешность может вырасти и до величины более чем 100%.
Высушивание растворов ферментов при комнатной температуре обычно вызывает полную инактивацию последних [103, ч.1, с.29], поэтому получить активный препарат фермента.удается только при высушивании в условиях глубокого вакуума при низкой температуре. Полученный таким образом препарат (немодифицированного фермента) можно хранить при, комнатной температуре без значительной потери ферментативной активности. Тем не менее, при хранении нативных ферментов.как лекарственных средств в виде субстанций и лекарственных форм следует учесть их недостаточную стабильность. Необходимо содержание их при низких температурах в защищенном от прямого света месте, причем в большинстве случаев срок годности препаратов даже при таком режиме не превышает одного года [3]. Нестабильность ферментов ограничивает возможности создания мягких лекарственных форм в виде аэрозолей (особенно это касается протеолитических ферментов). Недостаточная стабильность растворов ферментов (см. данные табл. 4.4.) создает определенные сложности с их использованием. Таким образом, иммобилизация ферментов должна приводить к увеличению стабильности субстанции и растворов ферментов, что позволит стандартизовать их.
Потеря ПА в процессе высушивания иммобилизованных препаратов -факт, хорошо известный из литературных источников [10,59,69]. Молекула белка в водном растворе окружена гидратной оболочкой, образованной молекулами воды, связанными с поверхностью белка водородными связями [36,177-180]. Эта водная оболочка (или, по крайней мере, некоторая ее часть) является неотъемлемой составной частью белка и необходима для поддержания его структуры и нормального функционирования. Удаления связанных молекул воды в процессе высушивания (под действием органических растворителей, нагревания) приводит к значительным изменениям. На рис. 4.1а представлены экспериментальные данные, полученные в данной работе об изменении ПА трипсина иммобилизованного на ДАЦ в процессе хранения. Там же приведена зависимость падения ПА иммобилизованного на ДАЦ Тр полученного в оптимальных условиях (сплошная линия). Были найдены оптимальные условия, метод модификации и степень модификации текстильного носителя для иммобилизации [48,170], при которых практически не происходит инактивации Тр в процессе иммобилизации.
Похожие диссертации на Разработка промышленных технологий получения новых медицинских материалов на основе модифицированных волокнообразующих полимеров, содержащих биологически активные белковые вещества
