Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. АМФИФИЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРЫ: СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА 10
1.1. Строение амфифильных полимеров 10
1.2. Поведение амфифильных полимеров в растворах 12
1.3. Термодинамические аспекты ассоциации
амфифильных полимеров 15
1.4. Комплексообразование амфифильных полимеров с ПАВ в водных растворах 16
1.5. Взаимодействие амфифильных полимеров с белками 1 8
ГЛАВА 2. НАНОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ АМФИФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ 20
2.1. Основные типы полимерных наночастиц 20
2.2. Методы получения полимерных наночастиц из амфифильных полимеров 23
2.3. Получение наночастиц, содержащих БАВ и их свойства 26
ГЛАВА 3. ПОЛИМЕРНЫЕ НАНОСИСТЕМЫ ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИХ ЦЕЛЕЙ 32
3.1. Требования, предъявляемые к полимеру-носителю БАВ 32
3.1.1. Физико-химические свойства полимера 32
3.1.2. Биосовместимость 34
3.1.3. Биодеградируемость 3 5
3.2. Требования, предъявляемые к полимерным
системам доставки БАВ 36
3.2.1. Состав полимерных систем доставки 36
3.2.2. Размер полимерных систем доставки 37
3.2.3. Скорость высвобождения БАВ 38
3.3. Примеры амфифильных полимеров и наночастиц с включенными БАВ 39
3.4. Поведение полимерных наносистем в организме при основных способах введения 43
3.5. Потенциальные области применения полимерных наночастиц в качестве систем доставки БАВ 46
3.5.1. Противораковая химиотерапия 46
3.5.2. Доставка белковых молекул 4 7
3.5.3. Лечение грибковых и бактериальных инфекций 49
3.5.4. Биомедицинская диагностика 49
ГЛАВА 4. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ, ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 53
4.1. Амфифильные полимеры, используемые в работе 53
4.1.1. Амфифильные производные поли-И-винилпирролидона 53
4.1.2. Амфифильные производные декстрана 55
4.2. Биологически активные вещества, используемые в работе 58
4.2.1. Тамоксифен 58
4.2.2. Соевый ингибитор протеиназ типа Баумана-Бирк 59
ГЛАВА 5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 62
5.1. Материалы и оборудование 62
5.1.1. Материалы 62
5.1.2. Оборудование 63
5.2. Определение содержания декстрана в образцах 63
5.2.1. Антроновый метод 64
5.2.2. Метод Дюбуа 64
5.3. Количественное определение ПВП 65
5.4. Определение критической концентрации агрегации 65
5.5. Получение поли-є-капролактоновьіх микрочастиц методом нанопреципитации 66
5.6. Получение декстран-поли-е-капролактоновых микрочастиц эмульсионным методом 66
5.7. Получение наночастиц методом прямого растворения 66
5.7. 1. Получение ПВП-стеар наночастиц 66
5.7.2. Получение Dex-PCL наночастиц 67
5.8. Получение наночастиц диализным методом 67
5.9. Получение наночастиц эмульсионным методом 67
5.10. Изучение устойчивости дисперсии наночастиц 67
5.11. Изучение влияния ионной силы на агрегирование наночастиц 68
5.12. Деградация Dex-PCL наночастиц 68
5.12.1. Деградация декстраназой 68
5.12.2. Деградация липазой 69
5.13. Получение полимерных наночастиц, содержащих соевый ингибитор протеиназ типа Баумана-Бирк 69
5.14. Изучение кинетики высвобождения ВВІ из Dex-PCL наночастиц 70
5.15. Изучение кинетики высвобождения ВВІ при деградации Dex-PCL наночастиц декстраназой 70
5.16.Определение активности ВВІ 70
5.16.1. Определение антитриптической активности 70
5.16.2. Определение антихимотриптической активности 71
5.17. Включение тамоксифена в наночастицы 72
5.18. Количественное определение тамоксифена спектрофотометрическим методом 72
5.19. Изучение кинетики высвобождения тамоксифена из наночастиц 73
5.20. Электрофорез препаратов содержащих ВВІ в ПААГ 73
5.21. Хроматография смеси ВВІ и ПВП-стеар на Сефадексе 74
5.22. Гельпроникающая хроматография препаратов, содержащих ВВІ 74
5.23. Вторая производная спектров УФ поглощения 74
5.24. Определение размеров частиц методом динамического светорассеяния 75
5.25. Измерение электрокинетического потенциала наночастиц 75
5.26. Световая оптическая микроскопия 75
5.27. Конфокальная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия 76
5.28. Электронная микроскопия 76
5.28.1. Сканирующая электронная микроскопия 76
5.28.2. Трансмиссионная электронная микроскопия 76
5.28.3. Электронная микроскопия замороженных сколов 16
5.29. ЯМР спектроскопия 77
5.30. Изучение устойчивости агрегатов ПВП-стеар в присутствии сыворотки крови 77
5.31. Приготовление стандартных взвесей эритроцитов барана и кролика 77
5.32. Приготовление сенсибилизированных эритроцитов барана 78
5.33. Исследование литического действия препаратов на сенсибилизированные эритроциты барана 79
5.34. Определение влияния альбумина человека на литическое действие препаратов 79
5.35. Изучение влияния наночастиц на активацию системы комплемента 79
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 81
ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ СТРОЕНИЯ И СВОЙСТВ ИССЛЕДУЕМЫХ ПОЛИМЕРОВ 81
ГЛАВА 7. ПВП-СТЕАР И DEX-PCL НАНОЧАСТИЦЫ: ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА 91
7.1. Получение полимерных наночастиц 91
7.2. Характеристика полимерных наночастиц 94
7.2.1. Размер наночастиц 94
7.2.2. Электрокинетический потенциал наночастиц 100
7.2.3. Изучение структуры полученных наночастиц
методом Н-ЯМР спектроскопии высокого разрешения 102
7.2.4. Изучение структуры Dex-PCL наночастиц
методом электронной микроскопии замороженных сколов 107
7.3. Устойчивость дисперсий наночастиц 107
7.3.1. Агрегативная устойчивость 109
7.3.2. Устойчивость к нагреванию 113
ГЛАВА 8. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ DEX-PCL НАНОЧАСТИЦ 116
8.1. Деградация наночастиц декстраназой 116
8.2. Деградация наночастиц липазами 123
ГЛАВА 9. НАНОЧАСТИЦЫ ПВП-СТЕАР И DEX-PCL С ВКЛЮЧЕННЫМИ БАВ 129
9.1. Dex-PCL микрочастицы с включенным флуоресцентным красителем 129
9.2. Наночастицы с включенным ВВІ 130
9.2.1. Включение ВВІ в Dex-PCL наночастщы 130
9.2.2. Включение ВВІ и его гидрофобизованных производных в ПВП-стеар наночастицы 134
9.3. Наночастицы с включенным тамоксифеном 139
9.3.1. Включение тамоксифена в Dex-PCL наночастицы 139
9.3.2. Включение тамоксифена в ПВП-стеар наночастицы 143
ГЛАВА 10. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НАНОЧАСТИЦ С КОМПОНЕНТАМИ КРОВИ 146
ВЫВОДЫ 152
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 153
- Строение амфифильных полимеров
- Основные типы полимерных наночастиц
- Требования, предъявляемые к полимеру-носителю БАВ
Введение к работе
В последние годы в науке сформировалось и интенсивно развивается новое направление - супрамолекулярная химия. В центре ее внимания находятся системы, способные к самоорганизации, т.е. обладающие возможностью спонтанно образовывать определенную структуру путем самосборки компонентов в супрамолекулярные ансамбли. Формирование таких структур осуществляется по принципу молекулярного узнавания за счет образования различных нековалентных взаимодействий: электростатических, гидрофобных, а также образования водородных связей. На основе использования этого принципа формируются новые подходы к созданию современных материалов, к процессам превращения и сохранения энергии, к медицинской диагностике и терапии.
Разработка методов создания супрамолекулярных структур нанометровых размеров является одной из важнейших задач современной химии. Известно, что амфифильные полимеры способны формировать самоорганизующиеся наноструктуры за счет наличия в их цепи гидрофобных и гидрофильных фрагментов. Варьируя химическое строение синтезируемых макромолекул, природу и распределение функциональных групп, удается эффективно управлять процессом молекулярной сборки, добиваясь получения сложных регулярных наноструктур различного строения, обладающих уникальными свойствами.
В настоящее время наносистемы, созданные на основе амфифильных полимеров, вызывают все возрастающий интерес в фармакологии, так как они представляют один из видов терапевтических систем и способны транспортировать лекарственные вещества внутрь клеток. При циркуляции таких носителей содержащееся в них биологически активное вещество (БАВ) защищено от инактивации, а действие лекарственного препарата пролонгируется. Кроме того, наносистемы доставки БАВ на основе амфифильных полимеров имеют следующие преимущества: 1) быстрое и воспроизводимое получение в больших количествах, 2) возможность включения плохорастворимых в воде веществ, 3) регулирование накопления препарата в различных органах и тканях организма в зависимости от размера частиц.
В этой связи, очевидно, что разработка и исследование наносистем доставки БАВ на основе амфифильных полимеров является актуальным и перспективным направлением современной биотехнологии.
Строение амфифильных полимеров
Амфифильные полимеры имеют дифильное строение, так как содержат достаточно длинные гидрофильные и гидрофобные фрагменты [1]. При этом, как правило, в состав гидрофобных звеньев включены алифатические или ароматические углеводородные радикалы (рис. 1).
Примерами амфифильных полимеров может служить большое количество различных блок сополимеров, например: полиэтиленгликоль (ПЭГ) - полилактид [2], ПЭГ - поли(3-бензил-Ь-аспартат) [3], полиэтиленоксид (ПЭО) - поли-є-капролактон (PCL) [4], ПЭО полипропиленоксид (ППО) [5] и большое количество полимеров аналогичного строения (рис. 1).
Синтезированы блочные сополимеры с самой различной архитектурой (Таблица 1). Мультиблочные макромолекулы могут иметь регулярное или случайное чередование блоков. Получены градиентные сополимеры, в которых распределение блоков плавно меняется от одного конца цепи до другого. Наряду с линейными, известны также гребнеобразные сополимеры: к их основной цепи, построенной из однотипных звеньев, присоединены в виде зубцов гребенки блоки, состоящие из звеньев другого типа [6].
Свойства сополимеров определяются химическим строением и гидрофильно-липофильным балансом (ГЛБ) их макромолекул. В зависимости от ГЛБ такие сополимеры могут быть как масло- , так и водорастворимыми, в связи с чем можно выделить два класса сополимеров: иономеры и гидрофобно-модифицированные полимеры [17].
Поведение амфифильных полимеров в растворах
Поведение амфифильных полимеров в растворах определяется строением их блоков, а также термодинамическими качествами растворителя по отношению к составляющим сополимер блокам. Предпочтительное сродство растворителя к одному из блоков усиливает внутримолекулярное фазовое распределение. Обобщая экспериментальные данные, можно построить концентрационную фазовую диаграмму системы амфифильный полимер - селективный растворитель (рис. 2) [18].
При очень низких концентрациях амфифильных полимеров в растворах (менее 0,1%) образуются мономолекулярные ассоциаты. В диапазоне от 0,1 до 20-60% (в зависимости от природы компонентов) в растворе уже существуют мультимолекулярные ассоциаты. При более высокой концентрации образуются упорядоченные периодические структуры, которые в силу высокой пространственной организации часто называют суперрешетками [18].
Основные типы полимерных наночастиц
Полимерные наночастицы (ПН) представляют собой компактные коллоидные образования, состоящие из макромолекулярных веществ и имеющие размеры от 10 до 1000 нм. Все коллоидные дисперсии можно разделить на три принципиально различные группы - лиофильные частицы, лиофобные частицы и ассоциаты частиц. В зависимости от агрегатного состояния и морфологических особенностей ПН можно подразделить на: нанокристаллы, нанокапсулы, наносферы, полимерные мицеллы и липосомы [47].
Полимерные мицеллы. Мицеллы можно отнести к группе лиофильных коллоидных систем, представляющих собой ассоциаты молекул ПАВ. Мицеллами называются такие коллоидные частицы, которые включают в себя большое семейство дисперсных систем, состоящих из дисперсной фазы, находящейся в дисперсионной среде. По размеру частиц коллоидные дисперсии занимают место между молекулярными дисперсиями с размером не более 1 нм и коалесцентными дисперсиями, размер которых превышает 0,5 мкм. Более точно можно сказать, что средний размер используемых мицелл на основе амфифильных полимеров составляет от 5 до 100 нм в диаметре [48].
Морфология мицеллярных форм, которые можно получить из амфифильных полимеров, довольно разнообразна. Обычно предполагается, что сополимеры образуют мицеллы близкие по форме к сферическим. Однако в большом количестве публикаций показано, что существует множество мицеллярных форм несферической формы. Это различные палочкообразные формы, кольца, ламеллярные структуры, ленточные формы, трубчатые структуры, гексагональные упаковки (рис. 7).
Липосомы образуются при диспергировании в водной среде мембран животных клеток и липидов. В зависимости от размера и числа бислоев липосомы делятся на три класса: мультиламеллярные везикулы, малые моноламеллярные везикулы, диаметром менее 100 нм, большие моноламеллярные везикулы, диаметром более 100 нм [49].
Обычно мембрана липосом состоит из фосфолипидов растительного и животного происхождения (подсолнечное масло, соя, яичный желток), а также из керамидов, холестерола, жирных кислот, синтетических ионных и неионных ПАВ. Для того чтобы получить полимерные аналоги биологических мембран и полимерные липосомы в гидрофильную или гидрофобную часть фосфолипидов (либо схожих по строению синтетических аналогов) вводят группы, способные полимеризоваться в ориентированных упорядоченных системах. В качестве полимеризующихся групп обычно используют остатки метакриловой кислоты, связанные с концевыми алифатическими цепями. Полимерные липосомы также получали поликонденсацией эфиров длинноцепочечных аминокислот, например С24Н49СН(ЫН2)СООСНз [50]. Еще одним новым подходом к созданию полимерных липосом является введение водорастворимых полимеров в структуру липидных слоев липосомальных оболочек (мембран), что позволяет повысить их устойчивость и длительность циркулирования в кровеносном русле (Stealth - липосомы, рис. 8), и создает дополнительные предпосылки модификации липосом, например, для придания им векторных свойств. В частности, для модификации липосомальных оболочек используют амфифильные производные ПЭГ, ПВП, акриламида [51].
Требования, предъявляемые к полимеру-носителю БАВ
Если изначально применение полимеров для получения лекарственных препаратов основывалось на эмпирическом подборе, то в настоящее время в результате многочисленных исследований были сформулированы основные требования, которым должны отвечать полимеры медицинского назначения, в том числе амфифильные полимеры для иммобилизации БАВ.
Поведение полимерного вещества после его попадания в организм в значительной мере может определить распределение соответствующего биологически активного вещества по органам и тканям и время его нахождения в организме. Это поведение может зависеть от многих факторов. На выбор подходящего полимера влияют три основных фактора: физико-химические свойства, биодеградируемость и биосовместимость полимера [83].
Физико-химические свойства полимера
Полимеры медицинского назначения должны обладать высокой чистотой, т.е. содержать минимальное количество различных примесей, в том числе и примесей мономера. Добиться последнего иногда бывает трудно, поскольку полимер представляет собой термодинамически нестабильную систему, всегда содержащую некоторое количество мономера. Оптимально, поэтому, использовать сополимеры на основе нетоксичных мономеров.
Молекулярная масса. Существенное значение имеет молекулярная масса полимера, поскольку именно она определяет скорость выведения соответствующего препарата из кровотока и его попадание в определенные органы. Даже инертный в биологическом отношении синтетический полимер может вызвать нежелательные явления в организме, если его молекулярная масса превосходит некую критическую величину. Так, слишком крупные макромолекулы полимеров или их фрагментов, которые предположительно должны выводиться из организма через почки, на самом деле могут накапливаться в почечных канальцах, снижая эффективность почечной фильтрации. Это явление называют «физической» токсичностью. Громадное значение имеет величина молекулярной массы и для фармакологически активных полимеров, вводимых парентерально. При этом имеются указания на то, что дезинтоксикационное и пролонгирующее действия полимеров проявляются только при наличии полимерных цепей с молекулярной массой выше 7000. С другой стороны, для некоторых типов лекарственных полимеров наибольший эффект достигается при молекулярной массе 60 - 200 тысяч [84]. Молекулярная масса фармакологических полимеров играет существенную роль для снижения токсичности препаратов. В частности, об этом свидетельствуют данные по токсичности различных алкалоидов и их низко- и высокомолекулярных производных [85]. Существенное значение оказывает молекулярная масса также на свойства высокомолекулярных соединений, обладающих собственной физиологической активностью. Наиболее полно этот вопрос изучен для полианионов, как известно, являющихся активными индукторами интерферона и антистрессовыми препаратами. Обстоятельный обзор их свойств позволяет сделать вывод о том, что зависимость токсичности этих полимеров зависит от их молекулярной массы [86]. Так, было показано, что синтетические полианионы на основе сополимера дивинилового эфира и малеинового ангидрида низкой молекулярной массы являются потенциальными стимуляторами макрофаговой фагоцитозной функции и обладают противоопухолевой активностью, однако при этом может отсутствовать противовирусная активность. Наоборот, образцы с молекулярной массой более 15 000 ингибируют макрофаговую функцию, но способствуют повышению антивирусного и иммунологического действия. Таким образом, молекулярная масса полимеров биомедицинского назначения должна лежать в диапазоне от 1 до 600 кДа [87].
Молекулярно- массовое распределение. Еще один важный параметр синтетического полимера - распределение по массе его молекул. В случае природных полимеров все молекулы в образце обычно имеют одинаковый размер. В случае синтетических полимеров в зависимости от способа их получения присутствует целый набор макромолекул разного размера, обладающих разной скоростью выведения из организма. В такой ситуации точное предсказание поведения полимерного препарата в организме затруднительно. Все это еще раз указывает на необходимость глубоких исследований влияния молекулярной массы на поведение полимеров в организме и переход к применению препаратов со строго контролируемыми молекулярно массовыми характеристиками [88].
Строение боковой цепи. Накопленные к настоящему времени данные позволяют заключить, что строение боковой цепи играет важную роль с точки зрения особенностей взаимодействия реагирующих веществ и эффективности получаемых систем [88, 84]. Строение боковой цепи имеет значение, как в случае нерастворимых, так и в случае растворимых полимеров-носителей. Если для низкомолекулярных присоединяемых блоков длина боковой цепи играет подчиненную роль, то в случае присоединения к носителям высокомолекулярных лигандов, расстояние между боковыми функциональными группами полимера-носителя и его основной цепью оказывается весьма существенным фактором [88].
