Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1.Хитин и хитозан - перспективные полимеры биомедицинского назначения 12
1.1.1. Источники выделения, структура, основные физико-химические свойства хитина и хитозана 12
1.1.2. Хитозан: взаимосвязь «структура - свойства» 17
1.1.3. Химическая модификация хитозана и использование производных хитозана в биомедицинской области 19
1.1.4. Биобезопасность хитина и хитозана: токсичность, биосовместимость биодеградируемость 21
1.2. Нано и микроструктур на основе хитозана для биомедицинского применения 23
1.2.1. Методы получения наночастиц хитозана 24
1.2.2. Физико-химические параметры наночастиц на основе хитозана 31
1.2.3. Влияние физико-химических параметров наночастиц на их взаимодействие с биологическими системами 32
1.3. Наночастицы хитозана как полимерные системы доставки лекарств 36
1.3.1. Введение биологически активных веществ (БАВ) в наночастицы 36
1.3.2. Контролируемое высвобождение БАВ из частиц 37
1.3.3. Наносистемы на основе хитозана для доставки доксорубицина 40
1.3.4. Наносистемы на основе хитина, хитозана и его производных для доставки
белков и пептидов 44
Глава 2.Экспериментальная часть 52
2.1. Реагенты и растворители 52
2.2. Лабораторное оборудование 53
2.3. Подготовка коммерческого хитозана к работе 54
2.3.1. Очистка хитозана переосаждением 54
2.2.1. Определение степени дезацетилирования хитозана (СД) 54
2.2.2. Определение средневязкостной молекулярной массы хитозана 2.3. Кислотный гидролиз высокомолекулярного хитозана 55
2.4. Синтез ацилированных производных хитозана 2.4.1. Синтез гексаноил-хитозана 56
2.4.2. Карбоксиацилирование хитозана 56
2.5. Получение наночастиц на основе хитозана и его производных 57
2.5.1.Получение наночастиц хитозана и его производных методом ионотропного
гелеобразования 57
2.5.2. Получение наночастиц сукциноил-хитозана (С3=80 %) методом солевого
осаждения 57
2.5.3. Получение наночастиц, меченных флуоресцеином изотиоцианатом 58
2.5.4. Получение наночастиц, меченных коммерческими флуоресцентными красителями Lightning-Link Atto 488 и Link Atto 547 58 2.6. Введение БАВ в наночастицы 59
2.6.1. Теоретический расчет заряда белков и пептидов 59
2.6.2 Сорбция белков на наночастицы ГХ и СХ 59
2.6.3. Сорбция пептидов на наночастицы ГХ и СХ 59
2. 6.4. Введение доксорубицина в НЧГХ и НЧСХ путем сорбции 60
2.6.5. Включение ДОКС в процессе формирования частиц 60
2.7. Контролируемое высвобождение ДОКС из наночастиц СХ 61
2.8. Физико-химические методы исследования 61
Определение размеров наночастиц методом конфокальной микроскопии 63
Определение количества белка по методу Бредфорд 64
2.9. Исследование биологической активности наночастиц in vitro 65
2.9. 1. Анализ цитотоксичности 65
2.9.2. Флуоресцентное окрашивание и анализ клеток методом конфокальной микроскопии 65
2.9.3. Метод проточной цитометрии 66
2.9.4.0пределение эффективности поглощения препаратов ДОКС методом флуоресцентной спектрофотометрии 66
2.9.5. Разделение клеток крови в градиенте плотности 66
2.9.6. Гемолиз эритроцитов 67
2.9.7. Взаимодействие наночастиц с плазмой крови 67
2.10. Биологическая активность НЧСХ-ДОКС in vivo 67
2.11. Биораспределение систем доставки доксорубицина 68
2.12. Фиксация тканей и приготовление криосрезов 68
Результаты и их обсуждение 69
Глава III Получение и физико-химические свойства наночастиц на основе хитозана и его производных 69
3.1.Получение наночастиц хитозана методом ионотропного гелеобразования..69
3.2. Стабилизация наночастиц хитозана 71
3.2.1. Формирование наночастиц на основе ацилированных производных хитозана методом ионотропного гелеобразования 72
3.2.2. Получение наночастиц из сукциноил-хитозана с различной степенью замещения 74
3.2.3. Физико-химические характеристики наночастиц 76
Определение размера наночастиц методом динамического светорассеяния 76
Определение размеров частиц методом атомно-силовой микроскопии 79
Определение размеров НЧ методом анализа траектории наночастиц (АТН)
Стабильность наночастиц 82
3.4.2. Взаимодействие наночастиц с кровью 83
3.4.2.1. Взаимодействие НЧ с белками плазмы крови 83
3.4.2.2. Гемолиз эритоцитов 86
3.4.2.3. Взаимодействие НЧСХ с лимфоцитами периферической крови 87
ГЛАВА IV. Взаимодействие наночастиц хитозана с белками и пептидами 88
4.1. Сорбция модельных белков на НЧГХ и НЧСХ 88
4.2. Сорбция модельных пептидов на НЧГХ и НЧСХ 92
4.3. Физико-химическая характеристика комплексов наночастиц хитозана с белками 96
4.3.1. Определение размера и дзета - потенциала комплексов белков с наночастицами методом ДСР 96
ГЛАВА V. Разработка системы доставки противоопухолевого препарата доксорубицина на основе наночастиц хитозана 97
5.1. Формирование комплексов наночастиц гексаноил и сукциноил хитозана с доксорубицином 98
5.2. Анализ противоопухолевой активности доксорубицина в составе наночастиц хитозана в условиях in vitro 100
5.2.1. Цитотоксическая активность доксорубицина в составе наночастиц сукциноилхитозана 100
5.2.2. Кинетика высвобождения ДОКС в условиях in vitro 101
5.2.3. Эффективность связывания НЧСХ-ДОКС с клетками различных опухолевых линий 103
5.2.4. Прохождение наночастиц сукциноилхитозана с доксорубицином в клетки и внутриклеточный трафик 103
5.3. Изучение противоопухолевой активности комплекса доксорубицина с хитозаном в модели in vivo на мышах с раком молочных желез 105
5.4. Биораспределение ДОКС и ЫЧСХ - ДОКС in vivo 106
Заключение 110
Выводы 113
Список работ, опубликованных по теме диссертации .114
Благодарности 118
Список литературы
- Химическая модификация хитозана и использование производных хитозана в биомедицинской области
- Очистка хитозана переосаждением
- Формирование наночастиц на основе ацилированных производных хитозана методом ионотропного гелеобразования
- Физико-химическая характеристика комплексов наночастиц хитозана с белками
Введение к работе
Актуальность проблемы Конец XX - начало XXI века отмечены новым направлением в создании лекарственных препаратов, связанным с разработкой адресных систем доставки лекарств. На протяжении последних десятилетий активно ведутся работы по созданию систем доставки препаратов, позволяющих увеличить время циркуляции лекарства в крови, защитить его от ферментных систем организма, включить молекулы, обеспечивающие целевую доставку, что потенциально приведет к созданию лекарств нового поколения. В качестве матриц для создания таких систем используют различные материалы, главным образом биополимеры небелковой природы, так как они характеризуются низкой иммуногенностью. Одним из перспективных материалов для создания систем доставки лекарств является хитозан - дезацетилированное производное природного полисахарида хитина. Хитозан совместим с тканями млекопитающих, низкотоксичен, деградируется гидролазами организма до олиго- сахаридов и глюкозамина. Значительным преимуществом хитозана по сравнению с прочими полисахаридами является наличие реакционноспособных (гидроксо - и аминогрупп, что позволяет получать производные с необходимыми характеристиками. В полимерную матрицу на основе хитозана и его производных могут быть включены вещества различной природы - белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, витамины, противоопухолевые препараты и др. [De Brito., et al. (2012) Food Hydrocol., Amidi., et al. (2010) Adv.Drug Deliv. Rev., Lee., et al. (2011) Int.J.Cancer, Liang.,et al. (2012) Int. J. Pharm.]. Кроме того, в зависимости от молекулярной массы и степени модификации полимера различными заместителями, могут быть получены наночастицы с различным размером и зарядом.
Несмотря на большой потенциал хитозана, как материала для биомедицинского применения, к настоящему времени на мировом фармацевтическом рынке появляются только первые зарегистрированные лекарственные препараты для наружного применения (мази, гели, ранозаживляющие пленки) [Dash et al.(2011) Progr. in Polym. Sci.]. Хитозан активно позиционируется на рынке как пищевая добавка с иммуностимулирующими свойствами. Использование хитозана и частиц на его основе для внутривенного введения находится на стадии исследований [Domb A.J.(2011) John Wiley and Sons Inc., Minami S., et al. (1996) Charbohydr. Polym.]. Для введения в клинику таких систем необходимо исследование их влияния на основные биохимические процессы в организме.
Целью данной работы является получение и характеристика систем доставки биологически активных веществ на основе наночастиц модифицированного хитозана.
Для достижения данной цели нами были определены следующие основные задачи:
-
синтезировать ацилированные производные хитозана с различными характеристиками;
-
получить стабильные наночастицы на основе синтезированных производных и изучить их физико-химические свойства;
-
исследовать сорбцию модельных белков и пептидов полученными наночастицами;
-
провести анализ токсичности и гемосовместимости полученных частиц;
-
разработать систему доставки противоопухолевого препарата доксорубицина на основе наночастиц модифицированного хитозана;
-
исследовать биораспределение и противоопухолевую активность доксорубицина в составе наночастиц in vitro и in vivo.
Научная новизна
Нами получены и исследованы стабильность и физико-химические свойства наночастиц на основе гексаноил-хитозана (ГХ) и сукциноил-хитозана (СХ). С использованием ряда белков и пептидов с разными характеристиками было обнаружено, что основными силами, участвующими в формировании комплекса с хитозаном являются электростатические взаимодействия. Впервые получена и охарактеризована система доставки доксорубицина на основе наночастиц СХ при загрузке препарата в наночастицы путем сорбции, что исключает использование токсичных сшивающих агентов. В тестах in vitro показано, что наночастицы хитозана не вызывают гемолиза эритроцитов, не приводят к агрегации и изменениям в морфологии тромбоцитов и лимфоцитов, что указывает на отсутствие острой токсичности носителя для клеток периферической крови. В модели рака молочных желез in vivo проверено, что наночастицы хитозана могут вводиться внутривенно. Многократные введения наночастиц не вызывали эмболии мелких сосудов и других побочных эффектов.
В моделях in vivo и in vitro установлено, что система доставки доксорубицина на основе наночастиц сукциноил-хитозана не меняет свойств антибиотика. Результаты экспериментов по изучению биораспределения полученной системы доставки доксорубицина демонстрируют преимущественное накопление препарата в печени и опухоли. На основании полученных данных, можно сделать вывод о перспективности использования наночастиц сукциноил- хитозана в качестве системы доставки, большая селективность действия которой может быть достигнута при присоединении к системе векторных молекул.
Практическая значимость Результаты, полученные в рамках диссертационного исследования, демонстрируют перспективность применения наночастиц на основе хитозана и его производных в качестве систем доставки биологически активных веществ. Важным является тот факт, что физико-химические свойства носителя, а также диапазон биологически активных веществ, включенных в полимерный носитель, могут варьировать в зависимости от характеристик исходного хитозана и его производных. При сорбции активной субстанции на носитель необходимо учитывать, что основной вклад в процесс комплексообразования вносят электростатические взаимодействия. Кроме того, наличие реакционноспособной аминогруппы в полимерной цепи хитозана и его производных делает возможным ковалентное присоединение веществ различной природы. Показано, что наночастицы СХ являются стабильными в течение 6 месяцев, а также могут быть лиофилизованы для более длительного хранения. Установлено, что наночастицы на основе хитозана и его производных являются нетоксичными, инертными по отношению к клеткам периферической крови и могут безопасно вводиться внутривенно. Нами показано, что введение доксорубицина в систему доставки сохраняет активность антибиотика, оказывая выраженный противоопухолевый эффект.
Получен патент Российской Федерации № 2460532 от 10.09.2012 «Препарат, ускоряющий ранозаживление» авторов Богословской О.А., Рахметовой А.А., Глущенко Н.Н., Овсянниковой М.Н., Ольховской И.П., Варламова В.П., Левова А.Н., Ильиной А.В., Зубаревой А.А.
Связь работы с научными программами Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки в рамках в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы», государственный контракт № 12.527.11.0008,а также при поддержке РФФИ (проект № 09-04-00895), ФЦП (ГК № П 730, 14.740.11.0548-0724; 16.512.11.2069; 14.132.21.1671).
Апробация работы и публикации Результаты работы были представлены автором в виде устных докладов на конференциях: X международная конференция «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Нижний Новгород, 2010), XVI Seminar and Workshop New Aspects of the Chemistry and Applications of Chitin and its Derivatives"(Poland, Zakopane, 2010), XI международная конференция "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Мурманск, 2012). Материалы были также доложены и обсуждены на конференциях: 11th International Conference on Chitin and Chitosan & The 8th Asia-Pacific Chitin and Chi- tosan Symposium (Taipei, Taiwan ,2009), Bionano'09 Химическая биология фундаментальные проблемы бионанотехнологии (Новосибирск, Россия, 2009), IV Российский симпозиума Белки и пептиды (Казань, 2009), 14th International Congress of Immunology (Kobe, Japan, 2010), XXIII международная зимняя школа " Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2011), 10th International conference of the European chitin society, EUCHIS'11 (Saint-Petersburg ,Russia, 2011), V всероссийский симпозиум « Белки и
пептиды» (Петрозаводск, 2011), 2-я Международная школа «Наноматериалы и нанотехноло- гии в живых системах. Безопасность и наномедицина», (Московская область, 2011), X чтение памяти академика Ю.А.Овчинникова, (Москва, 2011), Colloids and Nanomedicine 2012 (Amsterdam, Netherlands, 2012).
Работа получила премию им. П.П.Шорыгина в 2012 году за лучшие разработки в области хитинологии.
По теме диссертации опубликовано 25 научных работ, среди них 4 статьи, в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в рецензируемом международном журнале польского хитинового общества, 2 статьи в сборниках Российского хитинового общества, 18 тезисов. Получен 1 патент РФ.
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список цитируемой литературы». Работа изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц. Список литературы включает теылок на литературные источники.
Химическая модификация хитозана и использование производных хитозана в биомедицинской области
Главными критериями, позволяющими применять материал в биомедицинской области, являются низкая токсичность, а также способность деградировать под действием ферментов организма. Несмотря на большое количество перспективных научных и практических разработок в биомедицинской области, касающихся применения хитина, хитозана и их производных, вопрос о биобезопасности этих уникальных полимеров остается открытым. Токсичность хитозана
Хитозан позиционируется как биосовместимый и нетоксичный материал, одобренный для использования в пищевой промышленности Японии, Италии, Финляндии [97]. В России также выпускается ряд биологически активных добавок к пище на основе хитозана, которые зарекомендовали себя как лечебно-профилактические средства с широким спектром активностей (например, «Хитан», «Полихит» (ЗАО «Биопрогресс», Россия, Московская область), «Хитозан-Эвалар» (АО «Эвалар», Россия, Алтайский край, г. Бийск), «VEGETABS», ЗАО «БиоТехнологии, Россия Нижний Новгород [98-100]. FDA разрешило использовать материалы на основе хитозана для лечения ран [101].
Согласно литературным данным, хитозан является нетоксичным полимером и относится к четвертому классу опасности [1,102]. Токсичность хитозана может варьировать в зависимости от пути введения в организм (пероральный, парентеральный и т.д.), источника получения и наличия примесей; на нее также может влиять молекулярный вес полимера, СД и плотность заряда на поверхности полимерной цепи. Например, полулетальная доза (LD5o) перорально вводимого крысам хитозана составила 16 г/кг, тем не менее, при уменьшении молекулярной массы и степени N-ацетилирования полимера его токсичность снижалась [1]. При пероральном введении хитозана кроликам наблюдали метаболизм хитозана в прямой кишке под действием хитинолитических ферментов [103]. Применение человеком хитозана per os в количестве до 6,75 г /кг не вызывало токсического эффекта на организм [103]. Таким образом, подтверждено, что хитозан не аккумулируется в организме при пероральном введении, а расщепляется под действием неспецифических ферментов (главным образом, гидролаз) до глюкозамина и низкомолекулярных компонентов, которые включаются в метаболические процессы организма.
Более противоречивые данные получены относительно парентерального, в частности, внутривенного введения хитозана. Внутривенное введение низкой (4,5 мг/кг/день) и высокой дозы полимера (50 мг/кг/день) в течение десяти дней наглядно продемонстрировало, отсутствие аномалий в первом случае и летальный эффект во втором [104].
Химическая модификация хитозана может приводить к увеличению и снижению токсичности. Важной является очистка модифицированного продукта от токсичных реагентов, используемых в ходе синтеза, а также удаление промежуточных продуктов реакции. Известным является факт, что с повышением поверхностного заряда, токсичность полимера увеличивается [1]. Таким образом, идеальным для внутривенного использования является полимер с низким зарядом [97].
Биодеградируемость хитозана Несмотря на то, что хитин и хитозан представляют собой макромолекулы, полностью отсутствующие у млекопитающих, они деградируют и абсорбируются in vivo. Биодеградация объясняется главным образом способностью хитозанов подвергаться ферментативному гидролизу лизоцимом - неспецифическим протеолитическим ферментом, представленным во всех тканях организма. Тем не менее, эти полимеры являются объектом гидролитической активности и других протеолитических ферментов, таких как пепсин, трипсин или панкреатин. Биодеградация хитозана лизоцимом зависит от СД. Полностью дезацетилированный хитозан нечувствителен к действию этого фермента, тогда как хитин и частично дезацетилированный хитозан деполимеризуются им. Для того, чтобы субстрат был опознан лизоцимом, необходимы три последовательно расположенных ацетилированных звена в полимерной цепи, хотя механизм деградации до конца не известен. Биодеградация под действием лизоцима приводит к образованию нетоксичных олигосахаридов, которые могут быть впоследствии деградированы другими ферментами.
Кристаллическая структура хитозана и ее влияние на доступность для лизоцима имеют большое значение: высоко дезацетилированные полимеры деградируются этим ферментом медленнее, чем полимеры, имеющие низкую степень дезацетилирования. Кроме СД, как уже отмечалось выше, на биодеградацию хитозана и его производные влияют молекулярная масса, рН и метод получения полимеров.
Изучение различных факторов, влияющих на биодеградацию хитозана, имеет большое значение, поскольку скорость его биодеградации определяет функциональность молекулы. Более того, скорость биодеградации также влияет на биосовместимость, поскольку быстрая биодеградация может вызвать острую воспалительную реакцию, связанную с накоплением продуктов деградации [95].
Существует целый спектр методов, которые позволяют получать нано- и микроструктуры хитозана с различными характеристиками, большинство из них описаны в многочисленных обзорных статьях [105 - ПО]. Выбор простого и доступного метода для синтеза наночастиц из хитозана и его производных требует тщательного подбора условий.
Данный метод основан на взаимодействии реакционоспособных аминогрупп хитозана с альдегидной группой сшивающего агента. Эмульсию хитозана готовят путем диспергирования водного раствора полимера в масляной фазе, а затем стабилизируют подходящим поверхностно-активным веществом (рисунок 4). Полученные водные капли сшивают глутаровым диальдегидом с образованием микросфер. Метод широко используется для инкапсулирования лекарственных средств различной природы, однако он имеет ряд недостатков [108]. Основной минус этого подхода связан с тем, что использование токсичных и высокореакционноспособных сшивающих агентов может индуцировать нежелательные реакции с активным инкапсулируемым веществом. Кроме того, высокая степень сшивки приводит к незначительному высвобождению лекарственного средства in vivo.
Очистка хитозана переосаждением
УФ-спектрофотометр Shimadzu UV-1601 PC («Shimadzu», Япония);
весы аналитические ER-1821 («AND», Япония); перистальтический насос 12000 Varioperex («LKB Bromma», Швеция); камера для гель-электрофореза Mini-Protein Tetra Cell («Bio-Rad», США); pH - метр НІ 8314 («Hanna Instruments», Португалия); магнитная мешалка («IKA», Германия); центрифуга СМ50 для микропробирок («Elmi Skyline», Латвия), центрифуга Sigma 4-16 К («Sigma», США); кондуктометр Hanna Hi 8733 («Hanna Instruments», Румыния), спектрометр «Varian Е-112» («Varian», США), хроматограф жидкостной «Цвет-Яуза-01-АА» (НПО «Химавтоматика», Россия); атомно-силовой микроскоп «ИНТЕГРА Прима» («NT-MDT», Россия); ультразвуковая ванна Elmasonic S 10 Н (частота: 37 кГц) («Elma Hans Schmidbauer GmbH & Co», Германия), конфокальный микроскоп ТЕ 2000 Eclipse («Nikon», Япония); проточный цитофлуориметр («Becton Diskinson FACScan», США), криостат Micro НМ 525 («Termo scientific», Германия), вакуумные пробирки с цитратом натрия («Greiner Bio One», Австрия), флуоресцентная аналитическая система iBox («UVP», США), анализатор траектории движения наночастиц NanoSight NS500 («NanoSight»,Beликoбpитaния), хроматограф S 2100 (8укат,Германия), 90 Plus Partical Size Analyzer(«Brookhaven Instruments Co.», США), анализатор ZetaPALS»(«Brookhaven Instrument Co.», США). Высокомолекулярный хитозан (700 кДа, СД 86%) растворяли в 1% уксусной кислоте при интенсивном перемешивании в течение 10 часов. Полученный раствор фильтровали через мелкопористый фильтр (диаметр пор - 5 мкм) для удаления механических примесей. Отфильтрованный раствор титровали 12% NH4OH до рН=7,5. Наблюдали выпадение белого хлопьевидного осадка хитозана. Для очистки хитозана от низкомолекулярных примесей смесь диализовали в течение четырех суток с многократной сменой воды. По окончании диализа полученную суспензию лиофильно высушивали. Сукцинилированный хитозан переосаждали аналогичным образом растворением в 2% растворе NaOH с последующим закислением до рН 6,6 раствором уксусной кислоты (30%).
Степень дезацетилирования определяли методом кондуктометрического титрования. Для этого 200 мг хитозана растворяли в 100 мл 0,02 Н НС1. Полученный раствор титровали ОДН NaOH, добавляя его порциями по 0,1мл через каждые 30 сек при постоянном перемешивании. Объем щелочи, пошедшей на титрование, определяли графически (график зависимости электропроводности раствора от количества прилитой щелочи), рассчитывая «плато» на кривой титрования. Расчет вели по формулам: NI-VI-N2-V2 х = 161 СД = 100% х + 203 где VI- объем кислоты, мл; V2 - объем щелочи, необходимый для титрования , мл; N 1- нормальность кислоты, моль-экв/мл; N 2- нормальность щелочи, моль-экв/мл; m -масса хитозана, мг. 2.2.3. Определение средневязкостной молекулярной массы хитозана Средневязкостную молекулярную массу хитозана рассчитывали из уравнения Марка-Хаувинка для хитозанов с различной степенью дезацетилирования: ц = к-Ма, где л - характеристическая вязкость, дл/г; к и a - константы, рассчитывающиеся по формулам: к=1,64-10"30-СД14; а = -1,02-10"2-СД+1,82; СД - степень дезацетилирования, % Измерение вязкости растворов хитозана проводили в вискозиметре Уббелоде с диаметром капилляра 0,5 мм при температуре 25С. В качестве растворителя использовали 0,2 М раствор уксусной кислоты и 0,2 М раствор ацетата натрия в соотношении 1:1 по объёму. В основе метода лежит измерение времени истечения раствора полимера с последовательно уменьшающейся концентрацией его в растворе [211]. Величины удельной (туд) и приведённой (лпр) вязкости растворов хитозана рассчитывали по формулам: Луд = ті" то / то? Лпр — Луд с где Ті - время истечения раствора полимера, сек; То - время истечения растворителя, сек; с - концентрация раствора, %. Характеристическую вязкость л находили как точку пересечения экстраполированной к нулевой концентрации хитозана прямой зависимости Лпр = Лпр (с).
Образец хитозана средневязкостной молекулярной массы М„ 10 кДа, со степенью дезацетилирования 98 % получали в результате кислотного гидролиза соляной кислотой. Для этого растворяли 15 г высокомолекулярного ХТЗ (ММ=700 кДа, СД= 86 %), в 90 мл 6 М НС1. Полученный раствор нагревали на водяной бане, перемешивая в течение 3-х часов. Реакцию останавливали, охлаждая раствор до комнатной температуры. Для получения хитозана в виде основания осадок отфильтровывали, растворяли в бидистиллированной воде, подтитровывали раствором NH4OH до рН=8 и диализовали против дистиллированной воды с многократной сменой растворителя, лиофильно высушивали. Выход продукта реакции составлял 50 %. Степень полидисперсности и ММ образца определяли методом гель-проникающей ВЭЖХ (хроматограмма образца приведена в приложении 1).
600 мг хитозана (ММ=200 кДа, СД=86%, либо ММ=10 кДа, СД=98%) растворяли в смеси, состоящей из 36 мл 1% уксусной кислоты и 60 мл метанола. Полученный раствор разделяли на 3 аликвоты по 30 мл, к которым добавляли 30, 40, 60 мкл капронового ангидрида. Реакцию проводили в течение 5 минут при интенсивном перемешивании. Полученные образцы диализовали против дистиллированной воды в течение суток. Затем каждую аликвоту подтитровывали 12% раствором NH4OH до рН=8. Наблюдали выпадение белого хлопьевидного осадка хитозана. Полученную суспензию диализовали против дистиллированной воды, а затем лиофильно высушивали. Выход конечного продукта составлял 60-70 %. Степень замещения по ацильному остатку определяли методом Н-ЯМР спектроскопии. Спектры гексаноильных производных хитозана приведены в приложении 2.
Формирование наночастиц на основе ацилированных производных хитозана методом ионотропного гелеобразования
Исходная концентрация полимера, из которого конструируют частицы, как правило, влияет на их физико-химические характеристики. Мы исследовали влияние исходной концентрации СХ от 1 до 2,5 мг/мл. Концентрацию более 2,5 мг/мл не использовали ввиду ухудшения его растворимости в условиях опыта. Было показано, что размер частиц в диапазоне этих концентраций находился в пределах от 250 до 500 нм (таблица 7).При этом наблюдалась тенденция к увеличению их размера при большей исходной концентрации СХ. Заряд частиц составил - 20-25 мВ. При конечной концентрации СХ 1 мг/мл формировались наночастицы с размером 200-250 нм. Следовательно, оптимальной считали исходную концентрацию сукциноил - хитозана 1 мг/мл. Таблица 7 - Влияние концентрации сукциноил-хитозана на характеристики, получаемых частиц Концентрация Размер частиц, Доля частиц по Дзета сукциноилхитозана нм интенсивности, % потенциал, мВ мг/мл
Как уже было отмечено в литературном обзоре, физико-химические характеристики (размер, дзета-потенциал) играют ведущую роль для применения их в качестве НСД. Необходимо, чтобы система было тщательно охарактеризована с использованием нескольких методов. Нами для характеризации наночастиц, помимо используемого выше метода динамического рассеяния света, были также использованы конфокальная и атомно-силовая микроскопия, а также метод анализа траектории наночастиц. Рассмотрим каждый из методов отдельно. 1) Определение размера наночастиц методом динамического светорассеяния Метод динамического светорассеяния, известный также как метод фотон-корреляционного или квазиупругого рассеяния света, используется для измерения размера объектов от 1 до 1000 нм и проведения исследований в области химии полимеров для анализа свойства отдельных молекул и их ассоциатов [219].
При анализе диаметра полученных частиц ГХ и СХ методом ДСР в мультимодальном режиме было выявлено бимодальное распределение по размеру (рисунок 19). Первый пик соответствовал индивидуальным частицам, второй - их агрегатам. Основную фракцию составлял пул индивидуальных частиц ( рисунок 19 А и Б) размером 120-190 нм для ГХ и 160-250 нм для СХ. При анализе по интенсивности значительная доля сигнала распределялась на агрегаты (рисунок 19 В и Г).
При измерении размера частиц в суспензии методом ДСР в унимодальном режиме сложно правильно определить размеры полученных объектов, что связано с нелинейным характером рассеяния светового сигнала на крупных объектах. Компании, производящие приборы для анализа размеров частиц по светорассеянию, компенсируют это явление функцией «dust cut-off», то есть удаляют из учитываемых событий очень крупные объекты, например, пыль. Для суспензии частиц, полученных на основе хитозана, формирование крупных объектов является нормой. Так, установка функции «dust cut-off» от 1 до 90% практически не меняла характера распределения (сохранялось бимодальное распределение, данные не приводятся), а только снижала размеры объектов второго пика. Соответственно, принципиальным моментом является анализ распределения объектов по размеру в мультимодальном режиме. Анализ при этом следует проводить как по числу объектов (соотношение крупных и мелких объектов оценивается по площади под соответствующими кривыми), так и по интенсивности для визуализации крупных объектов. Следовательно, метод ДСР является основным при определении размеров наночастиц в суспензии и имеет свои преимущества и недостатки. К преимуществам стоит отнести возможность измерения большого числа проб за короткий промежуток времени, высокую точность, а также возможность детектирования, как одиночных частиц, так и их агрегатов. Важно так же использовать дополнительные методы измерений, позволяющие не только измерить, но и увидеть объект исследования. К таким методам можно отнести различные виды микроскопии. Б Нмочкпфсгпртдмгвии)
Распределение частиц гексаноил-хитозана (А, В) и сукциноил-хитозана (Б, Г) по размеру методом динамического светорассеяния. Измерения регистрировали по числу объектов (А-В) и интенсивности (Г - Е).
В настоящее время конфокальная микроскопия широко используется для изучения биологических объектов, поскольку позволяет получить более контрастное изображение по сравнению с оптической микроскопией, а также в ряде случаев делает возможным построение трехмерного изображения [220]. Для изучения размера и морфологии наночастиц ГХ и СХ частицы предварительно были помечены флуоресцеин изотиоционатом как описано в разделе «Методы исследования» в качестве препарата сравнения использовали полистирольные частицы известного размера. Было установлено, что в поле зрения имеются как одиночные частицы, имеющие форму, близкую к сферической (размер частиц варьировал в пределах 300-400 нм), так и их агрегаты (около 1 мкм и выше) (рисунок 20 А, Б, В). Эти результаты отличаются от полученных при использовании метода ДСР в среднем на 100 нм, эти различия, вероятно, связаны с дифракцией света на
Конфокальная микроскопия ФИТЦ - меченных наночастиц гексаноил-хитозана (А), сукциноил-хитозана (Б) и полистирола (В). Увеличение х 10000. Линейными отрезками приведены размеры объектов, оцениваемые с помощью встроенной линейки на конфокальном микроскопе.
Определение размеров частиц методом атомно-силовой микроскопии
Атомно-силовая микроскопия явилась еще одним методом определения формы и размера частиц на основе модифицированного хитозана. В ходе эксперимента установили, что размер частиц ГХ и СХ, измеренный этим методом составляет 20-100 нм, при этом в смеси также имеются агрегаты частиц большего размера. Различия в размере частиц, определяемых методом ДСР, связаны, в первую очередь, с удалением растворителя в ходе подготовки пробы. На рисунке 21 А, Б, В представлены результаты сканирования образцов наночастиц ГХ и СХ, а так же полистирольных частиц, известного размера (500 нм). В случае с полистирольными частицами результаты измерений АСМ и ДСР совпадают с погрешностью до нескольких нанометров не смотря на то, что измерения этими двумя методами проводятся в соверешенно разных условиях. Сопоставление результатов измерений полистироловых частиц и наноструктур на основе модифицированного хитозана методами АСМ и ДСР говорит о том, что в случае механически прочных полистироловых наночастиц оба метода равноправны, однако, в случае наночастиц на основе модифицированного хитозана АСМ измерения после высушивания образца не отображают реальные параметры наноструктур в жидкости, хотя и могут быть использованы для определения стабильности, жесткости образцов и для определения степени загрузки наночастиц лекарственной формой. Кроме того, одним из основных преимуществ АСМ (аналогично и для ТЭМ), является способность визуализации исследуемых образцов. Для получения достоверных значений размеров наночастиц методом АСМ, в случае если данные наноструктуры не являются механически жесткими и удаление растворителя критично для конструкции, является использование АСМ с возможностью сканирования в жидкости, поскольку только такие измерения позволят получать результаты, соответствующие реальным.
Физико-химическая характеристика комплексов наночастиц хитозана с белками
Природные полисахариды хитин и хитозан называют биологически активными соединениями XXI века. За последние годы исследование хитина и хитозана стало отдельной отраслью науки, называемой «хитинологией». Важной особенностью этих биополимеров является практически неограниченные возможности направленной модификации, что позволяет получать структуры любого молекулярного веса путем гидролиза (химического или ферментативного) с разнообразными функциями с изменением заряда, гидрофобности и др.
Данное исследование посвящено наноструктурированным хитозанам, которые, несомненно, можно назвать одной из форм модификации хитозановой молекулы. Данные структуры являются широко изучаемыми, прежде всего из-за возможности получения направленных систем доставки (НСД) лекарств с контролируемыми параметрами (размером, дзета-потенциалом, гидрофобностью), в результате чего в такие системы могут быть загружены различные биологически активные вещества (БАВ) с высокой эффективностью. На основе хитозана возможно получение НСД с рН-зависимым высвобождением БАВ, что может быть использовано для разгрузки препаратов в месте целевого действия.
Получение стабильных наночастиц является одной из основных проблем при разработке НСД на основе хитозана. Показано, что склонные к агрегации хитозановые наночастицы могут быть стабилизированы при введении гидрофобных заместителей. Установлено, что среди различных ацилированных производных стабильные наночастицы формируются из ГХ, характеристики которых можно варьировать при изменении молекулярной массы полимера, а также степени замещения гидрофобным заместителем. Наночастицы с высоким поверхностным зарядом обладают более выраженными мукоадгезивными свойствами, что имеет преимущество для доставки лекарств мукозальным путем. С другой стороны, известно, что для парентерального введения такие частицы представляют группу повышенного риска и способствуют агрегации форменных элементов крови.
В данной работе частицы нагружали препаратом доксорубицином с помощью сорбции с целью избежать использование токсичных сшивающих агентов (глутаровый альдегид, карбодиимид). Эффективность сорбции БАВ была различной для двух типов частиц, полученных на основе гексаноил- и сукциноил-хитозана. Мы установили, что ведущий вклад в процесс сорбции БАВ на наночастицы вносят электростатические взаимодействия. Это особенно ярко выражено в случае молекул с небольшой молекулярной массой (доксорубицина, коротких пептидов), взаимодействие с белками носит более сложный характер и обусловлено комплексом взаимодействий (гидрофобных, электростатических, водородных связей).
Следующая задача состояла в выяснении влияния включения БАВ в наночастицы на биологическую активность. Модельной молекулой служил противоопухолевый препарат ДОКС. В тестах in vitro на токсичность и методом проточной цитометрии показано, что токсичность ДОКС заключенного в носитель и его захват опухолевой клеткой, незначительно снижается, что связано с более медленным высвобождением БАВ из НЧСХ. Также было продемонстрировано, что высвобождение ДОКС из носителя более эффективно при кислом рН, что является подходом к более селективной доставке в опухоль, рН которой ниже, чем в здоровых тканях.
Мы показали, что сорбция ДОКС на наночастицы не приводит к длительному удержанию ДОКС в составе частиц. ДОКС высвобождается, по-видимому, в результате гидролиза хитозана и попадает в ядра клеток уже после 2-х часов инкубации с клетками в культуре in vitro. Аналогичная картина локализации ДОКС в ядрах клеток нами была выявлена на криосрезах ткани опухоли мышей, получавших ДОКС в составе частиц. Высокая активность ДОКС, заключенного в НЧСХ, а так же его рН-зависимое высвобождение явились предпосылками для дальнейших испытаний in vivo.
Нами были проведены исследования эффективности ДОКС при доставке наночастицами СХ на мышах с перевиваемой опухолью молочной железы, вызванной гиперэкспрессией гена Wnt-І. В ходе испытаний in vivo не было обнаружено статистически достоверных различий между действием свободного ДОКС и ДОКС в составе наночастиц. Как свободный ДОКС, так и ДОКС в составе носителя оказывали сравнимый положительный противоопухолевый эффект, регистрируемый по уменьшению объема опухоли. Острая токсичность ДОКС, определяемая по весу экспериментальных животных, была низкой и сравнимой для ДОКС и НЧСХ-ДОКС, что, вероятно, связано с низкой дозой вводимого противоопухолевого препарата.
Согласно литературным данным, лекарства заключенные в НЧ размером от 100 до 400 нм ,способны избирательно накапливаться в опухоли благодаря эффекту повышенной проницаемости сосудов и нарушению лимфатического дренажа опухоли (EPR-эффект). Для исследования биораспределения полученных нами НЧСХ-ДОКС использовали метод экстракции ДОКС из органов (печени, почек, опухоли, селезенки). Количество ДОКС в экстрактах органов оценивали по флуоресценции при длине волны возбуждения 490 нм и рассчитывали в нанограммах ДОКС на орган и на грамм ткани органа. По распределению ДОКС в тканях препарат накапливался преимущественно в печени и опухоли. Из достоверных отличий обнаружили также большее содержание ДОКС в почках при доставке в составе наночастиц. Полученные данные показывают, что использование системы доставки может способствовать накоплению лекарства в опухоли, но основным очагом локализации является печень.
Наличие функциональных групп в молекуле хитозана делает возможным присоединение различных целевых молекул (фолиевой кислоты, гликозилированнных белков, антител). Работы по созданию такой НСД с направляющими вектором будут проведены в дальнейшем.
