Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важнейших задач, стоящих перед современной функциональной геномикой, является поиск молекулярно-генетических факторов, вовлеченных в формирование различных комплексных фенотипов, проявляющихся при нормальных и особенно при патологичных состояниях организма. Наиболее остро стоит вопрос о молекулярных механизмах и факторах, лежащих в основе возникновения и развития социально значимых многофакторных и мультигенных заболеваний. Типичными представителями таковых являются патологии онкологического профиля.
Согласно современным представлениям, опухолевая трансформация клеток происходит в результате ступенчатого процесса накопления и отбора соматических мутаций. Часть мутаций, не являющихся нейтральными, приводит к активации генов позитивного контроля клеточного деления (онкогенов) и инактивации генов негативного контроля (онкосупрессоров). Такие мутации дают опухолевому клону пролиферативное преимущество перед клетками-предшественниками и соседними здоровыми клетками. В результате происходит бесконтрольный рост и формирование опухолевой ткани, имеющей гетерогенную структуру с одним или несколькими доминирующими клонами. Несмотря на то, что ведущая роль в малигнизации клеток принадлежит соматическим мутациям, некоторые существующие в популяции аллели онко-значимых генов и их сочетания могут являться факторами предрасположенности к развитию новообразования и иметь прогностическое значение, оказывая влияние на различные стадии патогенеза и определяя, таким образом, путь дальнейшего развития опухоли.
Инсерции ретроэлементов, благодаря сохраняющейся ретропозиционной активности, являются богатым источником новых аллелей генов и одновременно одной из причин возникновения соматического мозаицизма. Инсерционный полиморфизм ретроэлементов считается одним из важнейших факторов вариабельности генома.
Наиболее многочисленной группой ретроэлементов в геноме человека является семейство Alu-повторов. Из более миллиона копий Alu-элементов около 2000 представляют собой полиморфные инсерции. Известно 25 de wovo-инсерций Alu, участвующих в развитии различных генетических заболеваний. Интеграции в кодирующие области генов разрушают экзоны и приводят к сдвигу рамки считывания. Подобные инсерции являются причинами возникновения болезни Дента, гемофилии А, наблюдаются при некоторых семейных случаях рака яичников и рака молочной железы. Ряд интронных инсерции может при созревании транскрипта вызывать пропуск близлежащего экзона, в том числе со сдвигом рамки считывания. С этим явлением связана причина развития синдрома Аперта и нейрофиброматоза. Последовательности Alu-элементов являются сайтами гомологичных рекомбинаций, которые нередко приводят к появлению протяженных делеций, способных захватывать один или несколько экзонов, нарушая целостность генов. Подобные делеций наблюдаются при
1 В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие заведующий Лабораторией сравнительной и функциональной геномики ИБХ РАН, д.б.н. Лебедев Ю. Б.
Список сокращений: МГМ - молекулярно-генетические маркеры; ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз; ПЦР -полимеразная цепная реакция; ОТ - обратная транскрипция; SNP - однонуклеотидные полиморфные замены.
таких заболеваниях, как наследственная копропорфирия и дефицит фактора V свертывания крови. Инсерций в интроны и 3'-нетранслируемые области способны менять профили экспрессии соответствующих генов.
Имеются косвенные данные в пользу участия Alu-элементов в опухолевом патогенезе. Показано, что плотность инсерций Alu в известных онкосупрессорах значительно выше, чем в протоонкогенах. Кроме того, при многих онкологических заболеваниях инсерций Alu-элементов оказываются деметилированы. В некоторых случаях это приводит к повышению уровня транскрипции Alu-элементов, что, в свою очередь, может способствовать увеличению частоты соматических ретропозиций Alu.
Ретропозиционная активность, способность модулировать экспрессию генов, а также вовлеченность в процесс опухолевого патогенеза делает «мастер-гены» и некоторые полиморфные инсерций Alu-элементов подходящими объектами для создания на их основе тест-систем для диагностики предрасположенности к онкологическим заболеваниям, прогноза их развития и выбора адекватной терапии. Кроме того, возможности полиморфных Alu-маркеров в области идентификации личности позволяют в перспективе создать представительный набор функциональных молекулярно-генетических маркеров, одновременно являющийся генетическим паспортом пациента. Это является важным шагом в направлении развития персонифицированной медицины.
Актуальной задачей молекулярной биотехнологии в таком контексте становится создание надежной, информативной и методически доступной системы функциональных молекулярно-генетических маркеров, применимой в медицинской практике.
Работа выполнена при финансовой поддержке и в рамках ФЦП «Научные и научно-педогогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (государственный контракт № 14.740.11.0120), грантов Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» и РФФИ 11-04-01159а.
Целью работы является создание системы молекулярно-генетических маркеров на основе полиморфных инсерций Alu-элементов для диагностики риска развития острого лимфобластного лейкоза.
Экспериментальные задачи, решаемые для достижения поставленной цели:
разработка биоинформатического алгоритма для идентификации ретропозиционно активных инсерций Alu-ретроэлементов;
биоинформатический поиск полиморфных инсерций Alu-ретроэлементов в интронах генов человека, продукты которых могут являться потенциальными участниками малигнизации кроветворных клеток;
создание системы ПЦР-адаптированных маркеров на основе выбранных инсерций Alu-элементов и сравнительное генотипирование образцов геномной ДНК здоровых доноров и пациентов с острым лимфобластным лейкозом;
сравнительный анализ транскрипции аллельных пар генов в образцах, гетерозиготных по инсерциям Alu-ретроэлементов на уровне первичных транскриптов.
Научная новизна работы. В ходе исследования разработан оригинальный алгоритм для поиска ретропозиционно активных инсерций Alu-элементов, являющихся
источником новых наследуемых и соматических инсерций Alu. С помощью данного алгоритма впервые идентифицированы человек-специфичные инсерций «мастер-генов», относящихся к наиболее активно амплифицирующимся семействам AluYa5 и AluYb8.
Подтверждено полиморфное состояние 22 инсерций Alu, впервые определены частоты их встречаемости в популяциях человека. Показан ингибиторный эффект инсерций Alu на транскрипцию генов в нормальных и опухолевых клетках крови.
Впервые показана ассоциация пяти инсерций Alu-элементов с острым лимфобластным лейкозом.
Практической ценностью обладает уникальный набор из 31 молекулярно-генетического маркера на основе полиморфных инсерций Alu. Предлагаемый набор адаптирован для задач по идентификации личности, популяционных и медико-биологических исследований. 10 маркеров на основе инсерций, имеющих выраженный ингибиторный эффект на транскрипцию генов, применимы в исследованиях патологий кроветворной системы. Пять маркеров могут быть использованы для диагностики предрасположенности к острому лимфобластному лейкозу.
Основные положения, выносимые на защиту:
Создание набора МГМ на основе инсерций Alu-ретроэлементов;
Сравнительное генотипирование ДНК здоровых доноров и доноров с ОЛЛ;
Функциональный анализ Alu-ретроэлементов в лимфоидных клетках.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010) и Международной конференции «Проблемы популяционной и общей генетики» (Москва, 2011).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах, тезисы к 6 научным конференциям.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 126 листах машинописного текста, состоит из обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы с 270 ссылками; содержит 21 таблицу, 30 рисунков.
