Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 10
1.1 Приборы и методы, используемые для оценки количества микробных клеток.
1.2 Особенности культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae. 35
1.3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 52
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 52
2.1 Биологический объект исследований. 52
2.2 Оборудование для проведения ферментации. 53
2.3 Описание технологического процесса. 57
2.4 Лазерный анализатор ЛАСКА -1К. 67
Глава 3. РАЗРАБОТКА ЛАЗЕРНОГО АНАЛИЗАТОРА МОНИТОРИНГА КОНЦЕНТРАЦИИ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК И ЕГО ИНТЕГРАЦИЯ В КОМПЛЕКСНУЮ СИСТЕМУ «ЛАСКА-БИОТЕХ». 72
3.1 Разработка газоотделительного резервуара. 72
3.2 Отработка системы расположения датчиков в приборе. 75
3.3 Градуировка анализатора. 77
3.4 Интеграция анализатора в ферментационный комплекс. 85 3.4.1 Применение специального программного обеспечения. 88
Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЯ РОСТА ДРОЖЖЕЙ НА ФЕРМЕНТАЦИОННОМ КОМПЛЕКСЕ С ИНТЕГРИРОВАННЫМ АНАЛИЗАТОРОМ «ЛАСКА-БИОТЕХ». 91
4.1 Управление процессом через рОг-контрольную петлю совместно с показаниями лазерного анализатора. 91
4.2 Отъемно-доливной способ культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae. 95
Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЯ В РЕАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ ПРОИЗВОДСТВА. 108
5.1 Исследование профиля кислорода по высоте ферментера в реальных условиях производства. 108
5.2 Оценка динамики содержания кислорода при выращивании дрожжей в реальных условиях производства. 111
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 116
ВЫВОДЫ. 121
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 122
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК. 124
- Приборы и методы, используемые для оценки количества микробных клеток.
- Биологический объект исследований.
- Разработка газоотделительного резервуара.
Введение к работе
1. Актуальность темы.
Во всем мире биотехнология в настоящее время является приоритетной наукой. Развитие этой науки, стоящей на стыке микробиологии, биохимии, генетики и других отраслей знаний, способно обеспечить многие насущные потребности человека.
Это тысячелетие будет являться веком биотехнологических инноваций. Благополучие жизни на Земле, развитие и процветание экономики, как мировой, так и отдельных государств, будут во многом зависеть от отношения государственных структур к биотехнологии не как к лозунгу -"Биотехнология - приоритетное направление развития экономики", а как к важнейшей отрасли народного хозяйства, и подкрепляться не лозунгами, а конкретными делами.
Важнейшей задачей современного производства является повышение его экономической эффективности, биотехнологическая промышленность здесь не является исключением.
В принципе такую задачу нельзя решать одинаково на разных предприятиях, и если и существуют сходные подходы и решения, то это целая система мероприятий, направленных на оптимизацию различных стадий биотехнологического процесса.
Именно создание "систем" технологического контроля является главным направлением в развитии современных производств.
В связи с тем, что конкуренция на этом рынке растет с каждым днем, перед отечественным производителем возникла необходимость В повышении качества выпускаемого продукта и, одновременно, снижения его
-5-себестоимости за счет управления и, соответственно, оптимизации технологических процессов.
Оптимизация биотехнологических процессов возможна только при наличии хорошо оснащенной контрольно-измерительной системы ферментационного блока. Наряду с традиционно используемыми датчиками, такими как датчики рН и температуры, перед разработчиками встает вопрос о необходимости иметь в составе ферментационного комплекса анализатор микробных клеток, способный проводить измерения количества биомассы в режиме реального масштаба времени в широком концентрационном диапазоне, не зависящем от физико-химических свойств среды, так как этот параметр является важнейшим при культивировании клеток микроорганизмов.
Для реализации управляемого биосинтеза, в том числе и методом высокоплотностного культивирования требуется непрерывный контроль различных параметров, в том числе рОг и биомассы в ферментере. В настоящее время концентрацию биомассы, в основном, измеряют off-line, что, в свою очередь влияет на качество производственного процесса. (Mallette 1969; Harris and Kell 1985). Оперативный контроль биомассы позволит оптимизировать разработку способов достижения высокого выхода необходимого продукта.
Основным приемом, обеспечивающим такую оптимизацию в периодическом культивировании, является метод fed-batch cultivation (контроль субстратных добавок в периодическом процессе) (F. Yoshida et al. 1973).
Предполагается, что субстрат вносится в среду не только в начале, но и по некоторому (заранее определенному) алгоритму в ходе культивирования. Последующие четверть века развития этого метода дали множество примеров его эффективности. Метод находит все большее применение при
оптимизации процессов биосинтеза ряда продуктов, прежде всего в режиме высокоплотностного культивировании.
До середины 70-х годов доминирующим являлось мнение о невозможности получения биомассы, больше чем 30-40 г/л. В биотехнологии было введено понятие высокоплотностного ингибирования роста. Еще в 1929 г. была постулирована идея о жизненном или биологическом пространстве (С. Дж. Перт. 1978 стр.24). Потребовалось много лет, чтобы понять, что малый выход биомассы, на самом деле, был связан с малыми знаниями в биотехнологии. Следует отметить заслугу С.Дж. Перта, который в 1975 году нашел убедительные слова для опровержения идеи запрета роста с увеличением плотности среды. Достаточно снять диффузионные ограничения на доставку питательных элементов, убрать токсические продукты через полупроницаемую мембрану (или не допустить их накопления) и можно достичь выхода биомассы около 10% сухого веса на объем (выше 100г/л).
Реализация режима fed-batch по определенному алгоритму позволило получить концентрацию клеток выше 100 г/л. Но достижение таких высоких значений биомассы не является экономической целью. Решающее значение высокоплотностное культивирование приобрело при культивировании рекомбинантных штаммов продуцентов интерферона, интерлейкина, факторов роста и т.д. При этом выход продукта на конечной стадии напрямую зависит от конечной концентрации биомассы.
Таким образом, разработка комплексной системы, способной контролировать процесс ферментации, а также его оптимизировать, является приоритетной. С помощью этой системы можно решать множество задач управляемого биосинтеза. Применение системы, способной контролировать и оптимизировать процесс ферментации, как в научной среде, так и на производстве позволит оптимизировать способы достижения высокого выхода необходимого продукта.
2. Цели и задачи работы.
Основной целью явилась разработка системы управления ростом дрожжей Saccharomyces cerevisiae в ферментационном комплексе с интегрированным анализатором концентрации микробных клеток.
При этом были решены следующие задачи.
Исследования многократного светорассеяния для разработки метода измерения концентрации микробных клеток.
Разработка газоотделительного резервуара.
Создание макетного образца анализатора концентрации микробных клеток.
Создание ферментационной интегрированной системы.
Адаптация системы для мониторинга дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Разработка системы управляемого роста дрожжей на пилотном ферментационном комплексе в режиме высокоплотностного культивирования.
Изучение возможности внедрения системы в реальном производстве.
3. Научная новизна.
На основе проведенного анализа светорассеяния разработан метод многократного светорассеяния для расчета концентрации микробных клеток, а также разработан и применен алгоритм обработки индикатрис (угловых диаграмм рассеяния света) микробных клеток.
На основе серийно-выпускаемого анализатора микрочастиц ЛАСКА-1К разработан опытный образец лазерного анализатора, способный проводить измерения концентрации микробных клеток в реальном масштабе времени. Доказано, что выбранная конфигурация расположения датчиков в разных
-8-углах (датчики установлены под углами: 0, 8, 30, 150.) дает возможность перекрытия всей возможной области концентрации биомассы, а именно, в диапазоне от 0.01 до 100 г/л. При высоких значениях концентрации биомассы (от 2 до 100 г/л) фотодетектор, установленный под углом 150, регистрирует величину интенсивности светорассеяния, которая монотонно возрастает с увеличением биомассы без предварительного разведения и вне зависимости от состава питательной среды.
Для интегрирования анализатора в ферментационный комплекс, был специально разработан и поставлен перед анализатором газоотделительный резервуар.
На созданном ферментационном комплексе проведены исследования закономерностей роста и развития дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Полученные результаты были использованы для разработки алгоритма процесса ферментации в режиме отъемно-доливного и высокоплотностного культивирования, основанного на дозации источника углерода по показаниям датчика парциального давления кислорода (рСЪ) и поддержания оптимально больших значений удельной скорости роста в пределах 0,2 - 0,3 ч"1 на основе показаний лазерного анализатора.
4.Практическая ценность.
Разработана система управляемого роста дрожжей в режиме высокоплотностного культивирования с достижением конечного выхода биомассы 80 г/л дрожжей за 16 ч культивирования (производственные показатели не превышают значения 40 г/л). В качестве обратной связи использовали показания кислородного датчика и показания биомассомера.
Проведенные исследования ферментации дрожжей на пилотном комплексе, а также оценка производственных условий на Санкт-Петербургском Пищевом комбинате, показывают необходимость и
-9-возможность оптимизации процесса роста дрожжей при использовании разработанной системы.
Созданный ферментационный комплекс может быть использован для разработки более эффективных способов достижения высоких выходов биотехнологических продуктов и, соответственно, экономически более выгодных процессов культивирования микроорганизмов, а также для решения разнообразных задач управляемого биосинтеза.
5. Апробация работы и публикации.
Основные положения диссертационной работы доложены на Конференции
«Молодые ученые-85- летию академии», Санкт-Петербургская
государственная Химико-Фармацевтическая академия, 2004 г. и на втором
съезде биотехнологов России, Москва, 2004 г.
Основные результаты диссертационной работы представлены в 5
публикациях.
6. Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 138 страницах печатного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания применяемых методов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, и списка литературы. Работа иллюстрирована 39 рисунками и графиками, 9 таблицами. Список литературы включает 153 источников, из них 134 на иностранных языках.
Приборы и методы, используемые для оценки количества микробных клеток
Важнейшим технологическим параметром при культивировании клеток микроорганизмов является характеристика состава популяции (концентрация, распределение клеток по размерам, оптические и морфологические свойства, состояния агрегации и т.п.).
О росте и развитии микроорганизмов в естественных субстратах или питательных средах судят по количеству клеток в единице объема. Плотность клеток может быть определена количественно как масса или число клеток в определенном объеме образца. Клетки в образце могут быть отделены от культуральной жидкости и взвешены, либо во влажном состоянии, либо перед взвешиванием они могут быть полностью высушены до постоянного веса. Последнее обычно является более результативным.
Выбор метода для определения числа клеток зависит от цели исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов. Существуют методы, позволяющие определять общее количество микроорганизмов в исследуемом материале, или количество жизнеспособных клеток:
методы прямого счета (микроскопические);
методы подсчета колоний (методы высева);
методы мониторинга клеточной биомассы: нефелометрия, спектрофотометрия, флуорометрия, кондуктометрия, метод, основанный на показаниях по кислороду и др.
Методы подсчета количество микроорганизмов.
Методы прямого подсчета.
Чтобы определить общее количество микроорганизмов в различных материалах, применяют методы прямого подсчета клеток под микроскопом (в специальных счетных камерах, в фиксированных мазках, на мембранных фильтрах). Такие методы широко применяются в исследованиях микробиоты воды и почвы. Эффективность такого подсчета, как правило, в 10 - 10000 раз выше, чем при подсчете методом высева, так как многие микроорганизмы не растут на питательных средах, и учесть их можно только под микроскопом. Метод дает возможность получить дополнительную информацию о размерах и морфологии изучаемого объекта. Кроме того, прямой подсчет микроорганизмов производится быстрее, более дешев, оборудование для его осуществления имеется в каждой лаборатории.
Подсчет клеток в окрашенных препаратах (метод Виноградского-Брида).
Преимущество метода заключается в том, что фиксированные окрашенные препараты хорошо сохраняются и подсчет можно проводить в удобное для исследователя время.
Подсчет клеток на мембранных фильтрах.
Этот метод используют для определения количества микроорганизмов в жидких материалах с низкой плотностью клеток. Метод основан на концентрировании клеток на поверхности фильтра с последующим их окрашиванием и подсчетом в микроскопе. Выбирают фильтр с диаметром пор, позволяющим задерживать клетки, находящиеся в исследуемом материале.
Биологический объект исследований
Сущность метода заключается в использовании теории многократного светорассеяния для непрерывного определения количества клеток. Корректное определение распределения частиц по размерам, достигается в лазерных анализаторах микрочастиц только в условиях однократного светорассеяния, когда свет рассеивается только одной частицей. В этих условиях для размеров частиц, близких к размерам микроорганизмов, свет рассеивается преимущественно вперед, в малоугловой области индикатрисы (угловая диаграмма рассеяния лазерного света). При значительной концентрации микроорганизмов свет, прежде чем выйти из объекта измерения, рассеивается многократно. В этих условиях большая часть света рассеивается в дальнем диапазоне углов, в том числе и назад. Регистрация интенсивности света фотодекторами в дальнем поле углов обеспечивает решение задачи метода: непрерывной регистрации биомассы в реальном масштабе времени.
Задача, которая решается в предлагаемом методе - это существенное увеличение по верхней границе диапазона определения концентрации клеток и независимость от физико-химических свойств среды.
Основные принципы лазерного малоуглового светорассеяния.
Были разработаны различные оптические методы гранулометрического анализа: спектральной прозрачности, полной индикатрисы, многоволнового обратного рассеяния, малых углов; но только метод малоуглового светорассеяния (метод малых углов - ММУ), завоевал преимущественные позиции.
В общем виде, метод лазерного рассеяния реализуется по следующей схеме: через кювету с суспензией частиц пропускается световой пучок когерентного излучателя (лазера), измеряется, с помощью многоэлементного фотоприемника, радиальное распределение интенсивности 1(Р), рассеянного ансамблем микрочастиц; из данных радиального распределения интенсивности вычисляется функция распределения частиц по размерам f(a). (Где р - угол рассеяния, а - диаметр частиц). По способу реализации метод относится к интегрально-оптическим методам.
Искомая функция распределения f(a) математически связана с измеряемой интенсивностью светорассеяния 1(р) уравнением Фредгольма первого рода: где К(а,Р) - ядро уравнения.
Особенностью уравнения (1) является неустойчивость его решения к малым изменениям исходных данных. Экспериментальное определение функции 1(Р) всегда происходит с некоторой ошибкой, и это приводит к тому, что уравнению в пределах этой ошибки начинает удовлетворять бесчисленная совокупность решений. Математически это означает, что задача, определяемая (1), некорректна. Степень некорректности в большей мере зависит от поведения ядра К(а,р) как функции переменной интегрирования. Если ядро обладает при фиксированном р сильным сглаживающим действием, особенно в области высоких частот, оно способно сгладить даже высокоинтенсивную функцию f(a). Указанная некорректность является неизбежной для рассматриваемого класса методов независимо от того, имеет ли (1) аналитическое решение или оно решается численными методами.
Разработка газоотделительного резервуара
В составе анализатора применяется специально разработанная проточная измерительная ячейка (Рис.16). Проточная измерительная ячейка помещается в соответствующее кюветное отделение.
Схема проточной измерительной ячейки. Вследствие того, что поступающая в проточную измерительную ячейку клеточная суспензия, отбираемая из биореактора, должна быть отделена от содержащихся в ней пузырей, газовой фазы, был разработан газоотделительный резервуар, который впоследствии был интегрирован в анализатор. Сущность работы системы отделения газовой фазы поясняется на рис.17. Клеточная суспензия отбирается из биореактора 1 и по трубке 2 поступает в газоотделительный конусообразный резервуар 3. В резервуаре установлены датчики уровня: датчик нижнего уровня 4а и датчик верхнего уровня 46. Сигналы с датчиков поступают на электронный контролер уровня
. Электронный контроллер автоматически устанавливает скорость прокачки насоса 6 так, чтобы уровень заполнения резервуара находился между нижним и верхним датчиками уровня. В газоотделительном резервуаре пузыри газа поднимаются вверх, отделяются от жидкости и далее отводятся с воздушным потоком, минуя проточную ячейку. Суспензионная жидкость, из которой удалены пузыри газовой фазы, поступает в проточную измерительную ячейку 7. После прохождения ячейки, поток суспензии соединяется с газовым потоком и возвращается в биореактор. Вся система магистралей, включающая проточную ячейку является замкнутой. Это позволяет стерильно отбирать пробу и возвращать обратно в биореактор без изменений, что особенно важно при проведении ферментации.
Проведенные опыты по выращиванию дрожжей показали хорошие результаты, клеточная суспензия поступала в измерительную ячейку полностью освобожденной от газовой фазы.
Исследование системы расположения датчиков в приборе.
Анализатор «ЛАСКА» предназначен для непрерывного контроля концентрации биомассы в биореакторе. Этот параметр является ключевым в контроле, регулировании и оптимизации микробиологических процессов.
Принцип действия анализатора «ЛАСКА» основывается на непрерывном измерении светорассеяния в широком диапазоне углов. Метод светорассеяния уже применялся для регистрации плотности биомассы, но не носил универсального характера, так как регистрация интенсивности светорассеяния основывалась на использовании одного выбранного угла и поэтому имела ограниченный диапазон в концентрации биомассы. Проведенные нами исследования с пекарскими дрожжами Saccharomyces cerevisiae показали, что в зависимости от угла регистрации интенсивность светорассеяния пропорциональна плотности биомассы в разном диапазоне значений. Для малых углов регистрации до 10 градусов (фотодатчик 1 и 2) наблюдается нелинейный характер зависимости интенсивности светорассеяния от концентрации биомассы в диапазоне концентрации биомассы от 0.01 г/л до 0.2 г/л. При более высоких значениях плотности биомассы, возникает эффект многократного светорассеяния, и значения интенсивности светорассеяния в малых углах уменьшается. Наоборот, в дальних углах интенсивность светорассеяния значимо увеличивается при повышении плотности культуры. При выбранной конфигурации расположения датчиков в разных углах возможно перекрытие всей области возможной концентрации биомассы (датчики установлены под углами: 0, 8, 30, 150.) (Рис.18).
