Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Микотоксины. Общая характеристика 11
1.2. Регламентированные в кормах микотоксины 14
1.2.1. Афлатоксины 14
1.2.2. Т-2 токсин 20
1.2.3. Дезоксиниваленол 23
1.2.4. Зеараленон 26
1.2.5. ОхратоксинА 29
1.2.6. Патулин 32
1.3. Энтеросорбция - способ обезвреживания кормов от микотоксинов 36
1.4. Адсорбционные свойства клеточных стенок дрожжей 40
1.5. Обоснование исследований, необходимых для получения энтеросорбента микотоксинов из дрожжей Saccharomyces cerevisiae 48
2. Материалы и методы исследований 50
2.1. Характеристика используемых материалов 50
2.1.1. Биомасса дрожжей 5 0
2.1.2. Химические реагенты 5 0
2.1.3. Ферментные препараты 51
2.1.4. Микотоксины 51
2.1.5. Витамины 5 2
2.1.6. Микроэлементы 5 2
2.1.7. Адсорбенты 53
2.1.8. Лабораторные животные 53
2.2. Методы исследований 53
2.2.1. Методы обработки дрожжевой биомассы 53
2.2.1.1. Автолиз 53
2.2.1.2. Протеолиз 53
2.2.2. Определение сырого протеина (по Кьельдалю) 53
2.2.3. Определение белка по Барнштейну 54
2.2.4. Метод проведения адсорбции микотоксинов. Выделение микотоксинов из раствора 54
2.2.5. Обнаружение и количественное определение микотоксинов 55
2.2.6. Сушка адсорбентов 56
2.2.7. Определение удельной поверхности адсорбентов
газохроматографическим методом 56
2.2.8. Определение удельной поверхности, общего объема пор, количества активных центров адсорбентов методом ЯМР 57
2.2.9. Определение функциональных групп адсорбентов 58
2.2.10. Определение насыпной плотности 5 8
2.2.11. Метод проведения адсорбции витаминов и микроэлементов 58
2.2.12. Количественный анализ витаминов 58
2.2.13. Количественный анализ микроэлементов 59
2.2.14. Метод проведения экспериментов in vivo по определению
эффективности адсорбента при острой интоксикации Т-2 токсином 59
2.2.15. Статистическая обработка экспериментальных данных 59
3. Результаты и их обсуждение 60
3.1. Сравнительная оценка адсорбции Т-2 токсина кормовыми дрожжами (Candida scottii) и дрожжами Saccharomyces cerevisiae 60
3.1.1. Сравнительная адсорбция Т-2 токсина промышленно изготовляемыми дрожжами Saccharomyces cerevisiae 61
3.2. Влияние условий обработки биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae на содержание белка в концентрате клеточных стенок 62
3.2.1. Анализ содержания белка в дрожжевых продуктах методом ЯМР-ралаксации 68
3.2.2. Влияние содержание белка в концентратах клеточных стенок на структурные свойства 74
3.2.3. Преимущество применения протеолитического ферментного препарата Protex 6L в процессе получения дрожжевых клеточных стенок 75
3.3. Сравнительная оценка адсорбции Т-2 токсина адсорбентов, полученных из дрожжей Saccharomyces cerevisiae 83
3.4. Взаимосвязь адсорбции Т-2 токсина клеточной стенкой дрожжей Saccharomyces cerevisiae со структурными свойствами адсорбентов на основе дрожжевых клеточных стенок 84
3.4.1. Различия в функциональных группах дрожжевых адсорбентов. Вероятность участия функциональных групп в адсорбции микотоксинов 91
3.5. Влияние клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae на адсорбцию Т-2 токсина 95
3.6. Влияние внешней поверхности дрожжевой клеточной стенки в адсорбции Т-2 токсина 96
3.7. Сравнительная оценка адсорбции микотоксинов адсорбентами, полученными из дрожжей Saccharomyces cerevisiae 97
3.7.1. Адсорбция афлатоксинов 97
3.7.2. Адсорбция зеараленона 101
3.7.3. Адсорбция охратоксина А 103
3.7.4. Адсорбция Т-2 токсина 105
3.7.5. Адсорбция патулина 106
3.7.6. Адсорбция дезоксиниваленола 107
3.8. Влияние клеточной стенки дрожжей в адсорбции микотоксинов 107
3.9. Сравнительная оценка эффективности адсорбции Т-2 токсина in vivo различными адсорбентами 109
3.10. Сравнительная оценка адсорбции Т-2 токсина in vitro различными адсорбентами 111
3.11. Оценка адсорбции витаминов и микроэлементов клеточной стенкой дрожжей Saccharomyces cerevisiae 114
3.12. Различие и общность адсорбентов на основе клеточных стенок дрожжей 119
3.13. Разработка технологии энтеросорбента микотоксинов из дрожжей Saccharomyces cerevisiae 120
Выводы 122
Практические предложения 123
Библиографический список 124
Приложения 140
Приложение 1 141
Приложение 2 154
Приложение 3 157
Приложение 4 159
Приложение 5
- Микотоксины. Общая характеристика
- Характеристика используемых материалов
- Сравнительная оценка адсорбции Т-2 токсина кормовыми дрожжами (Candida scottii) и дрожжами Saccharomyces cerevisiae
Введение к работе
Актуальность работы. Микотоксины продуцируются многими фитопатогенными и сапрофитными грибами, широко распространенными в почве. Продуцируемые ими микотоксины накапливаются в сельскохозяйственных культурах и продуктах питания при неблагоприятных условиях сбора, хранения и обработки.
В результате скармливания сельскохозяйственным животным и птицам кормов, содержащих микотоксины, происходят отравления - микотоксикозы, которые вызывают падеж животных, снижение их продуктивности, иммунодепрессию и появления на ее фоне заболеваний другой этиологии. Микотоксины обнаруживаются и в продуктах животного происхождения (мясомолочные продукты, яйца), при поедании которых страдает и человек. В организм человека микотоксины могут попадать и с продуктами' растительного происхождения. Микотоксины могут присутствовать в^ корме без видимого роста плесени. Микотоксины устойчивы к действию' факторов окружающей среды, в том числе замораживанию, высокой температуре, высушиванию, к воздействию ультрафиолетового и ионизирующего излучений.
Микроскопические грибы (плесени) поражают, в основном, растительные объекты в процессе их вегетации или хранения. Паразитирование грибов происходит за счет питательных веществ растений, в результате чего резко снижаются урожайность сельскохозяйственных культур, питательная ценность заготовленных кормов. В результате поражения грибами ежегодно при хранении портится до 30% производимого зерна. При этом испорченное зерно зачастую используют на корм скоту, что может привести к их гибели.
С целью уменьшения или предотвращения неблагоприятного воздействия микотоксинов на здоровье сельскохозяйственных животных и птицы рекомендовано включение в корм адсорбентов. В качестве адсорбентов микотоксинов применяются цеолиты, бентониты, активированный уголь, не обладающие избирательной адсорбцией микотоксинов, одновременно адсорбируя и полезные компоненты корма (витамины, аминокислоты).
7 Превысить содержание цеолита в комбикорме: свыше 6% не представляется возможным. У цыплят-бройлеров; получавших уже 6% цеолита в составе комбикорма, отмечены негативные изменения в органах пищеварения. В тоже время, природные минеральные адсорбенты, могут содержать повышенные количества тяжелых металлов и других, опасных включений; которые, адсорбировались из, окружающей среды. В> качестве примера можно привести обнаружение ДИ0КСИНОВ5В тушках цыплят, которое было связано с применением бентонитов в рационах (ЄША- 1997г.; Австрия, Германия - 1999 г.).
Перспективными» энтеросорбентами. микотоксинов могут стать полисахариды,: в том; числе: полисахариды; клеточной стенки: дрожжей*. Клеточная стенка дрожжей? составляет около 25% сухой массы, клетки. Полисахариды клеточной стенки (глюканы, маннаны и хитин) относятся» к неперевариваемым, что очень важно- при введении подобных адсорбентов, в корма моногастричных животных ш птицы; Полисахариды, клеточной стенки дрожжей являются рецепторами: токсинов; поэтому получение селективного; к токсинам, энтеросорбента из полисахаридов? клеточных стенок: дрожжей; является весьма актуальным:
Цель и задачи: исследования; Целью настоящей работы является' разработка^ на основе экспериментальных исследований научно обоснованного способа получения: из дрожжей селективного к микотоксинам энтеросорбента.
Для достижения поставленнойцели решались следующие задачи:
выбор промышлен но изготовляемых дрожжей и рациональные способы их обработки для:получения энтеросорбента,
исследование структурных свойств и состава клеточной стенки,дрожжей;
определение адсорбционных свойств і клеточной стенки: дрожжей по отношению к микотоксинам;
определение адсорбционных свойств клеточной^ стенки дрожжей по отношению к витаминам и микроэлементам;
- получение опытной партии энтеросорбента и испытание его в условиях
in vivo.-
8 Научная новизна. 1. Обоснована целесообразность применения протеолиза дрожжевой биомассы в процессе отделения клеточной стенки от внутриклеточного содержимого для получения селективного к микотоксинам адсорбента.
2. Впервые установлена взаимосвязь количества активных центров —
центров взаимодействия, расположенных на поверхности адсорбента,
образующих водородные связи с молекулами воды, с эффективностью
адсорбции микотоксина Т-2. По количеству активных центров можно косвенно
оценить адсорбционные возможности адсорбента к Т-2 токсину.
Показана селективность адсорбции микотоксинов (афлатоксинов (Вь В2, Gi и G2), охратоксина А, зеараленона, патулина и дезоксиниваленола) клеточной стенкой дрожжей S. cerevisiae по сравнению с адсорбцией витаминов и микроэлементов.
Разработан экспресс-метод определения содержания белка в дрожжах и концентратах клеточных стенок дрожжей с использованием ЯМР-релаксометра, позволяющий определить содержание белка в течение 3 минут.
Впервые установлено; что эффективность адсорбции- микотоксина Т-2 адсорбентами из дрожжей S. cerevisiae находится, в прямой зависимости от содержания в них клеточных стенок и в обратной зависимости от содержания в них белка.
Практическая значимость. На основе проведенных исследований получен энтеросорбент, обладающий высокой селективностью к микотоксинам: Т-2 токсину, афлатоксинам (Вь В2, Gi и G2), охратоксину А, зеараленону, патулину и дезоксиниваленолу. Энтеросорбент не разрушается ферментами желудочно-кишечного тракта, тем самым не вызывает вторичной интоксикации микотоксинами организма моногастричных животных. Энтеросорбент не обладает селективностью к витаминам и микроэлементам, тем самым исключается дефицит данных микронутриентов в рационе. Энтеросорбент микотоксинов рекомендуется к применению в животноводстве и птицеводстве для профилактики микотоксикозов.
9
Апробация работы. Основные положения; диссертационной работы
докладывались и обсуждались на III и IV Московском международном
конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005,
2007); III Юбилейной международной выставке-конференции
«Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва; 2005); Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения, защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005); Международном' симпозиуме- «Агроэкологическая безопасность в условиях техногенеза» (Казань, 2006); III Международной научно-практической конференции, «Проблемы экологии: наука, промышленность, образование» (Белгород, 2006); на Всероссийских конференциях: «Ресурсосберегающие, водо- и почвоохранные биотехнологии, основанные на использовании живых экосистем» (Казань, 2006), «Пищевые технологии»- (Казань,, 2006); «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2007). Энтеросорбент. микотоксинов экспонировался на« III Китайско-Российской выставке по науке и технике, Китайско-Российской ярмарке инновационных .технологий (Китай, г. Маньчжурия, 2006), Биотехнологическойг выставке-ярмарке «РосБиоТех-2007» (Москва, 2007).
Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту:
Обоснование выбора дрожжей S. cerevisiae и ферментативного способа их обработки для получения энтеросорбента.
Установленные структурные свойства клеточных стенок дрожжей S. cerevisiae, полученных при ферментативном способе обработки дрожжей.
- Установленная, взаимосвязь эффективности адсорбции микотоксинов.
клеточными стенками дрожжей^!, cerevisiae с их составом.
Сравнительные результаты адсорбции микотоксинов, витаминов и микроэлементов полученным энтеросорбентом микотоксинов из дрожжей S. cerevisiae и другими адсорбентами.
10 Технологическое решение по производству энтеросорбента микотоксинов, результаты опытных работ и испытания энтеросорбента в условиях in vivo.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и библиографического списка, содержащего 148 источников, в том числе 49 иностранных источников. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста и включает в себя 20 таблиц, 35 рисунков и 5 приложений.
Микотоксины. Общая характеристика
Микотоксины — это вторичные метаболиты микроскопических грибов (плесеней), обладающие токсичными свойствами. Есть все основания полагать, что эти вторичные метаболиты могут выполнять многочисленные функции, направленные на обеспечение выживания микроскопических грибов и их конкурентоспособности в борьбе за место в» различных экологических нишах [1, с.135].
Микотоксины образуются в цепи последовательных ферментных реакций из относительно небольшого числа химически простых промежуточных продуктов основного метаболизма, таких как ацетат, малонат, мевалонат и аминокислоты. Наиболее важными этапами биосинтеза микотоксинов являются реакции конденсации, окисления-восстановления, алкилирования и галогенизации, которые приводят к образованию различных по структуре предшественников микотоксинов. Известно пять основных путей биосинтеза микотоксинов: поликетидный, характерный для афлатоксинов, стеригматоцистина, охратоксинов; патулина и др.; терпеноидный — для трихотеценовых микотоксинов; через цикл трикарбоновых кислот - для рубратоксинов; путь, в котором исходными соединениями являются аминокислоты - эргоалкалоиды, споридесмин, циклопиазоновая кислота и др.; смешанный (сочетание двух и более основных путей) — для производных циклопиазоновой кислоты [1, с. 13 6].
Известно более 300 микотоксинов. Более 10000 штаммов, относящихся к 350 видам, продуцируют микотоксины [2, с.ЗЗ]. В России, в, том числе и в Татарстане по степени распространенности наибольшее значение имеют фузариотоксины - Т-2 токсин, дезоксиниваленол (ДОН) и зеараленон. Наибольшее распространение в Центральном, Поволжском, Уральском, Сибирском, Дальневосточном регионах России имеет F. sporotrichiella. От 40 до 100% зернофуража, грубых кормов, поражено этими видами грибов, образующими Т-2 токсин, реже НТ-2 токсин [3, с.42-43].
Причины развития плесневых грибов. Плесневые грибы поражают корма при благоприятных условиях для их роста — оптимальной температуре и влажности. Подходящие условия для роста определенного вида гриба могут сложиться как в поле, так и в зернохранилищах [4, с.28]. Большинству грибов требуется, по крайней мере, 1-2% кислорода. Исключением является Fusarium moniliforme, который способен расти в условиях 60% концентрации углекислого газа и менее чем 0,5% содержания кислорода [4, с.29].
Влияние развития плесневых грибов на кормовое сырье. Экономические последствия. Следствием размножения1 плесневых грибов в кормовом сырье являются:
- снижение питательности, поскольку поражающие кормовое сырье грибьь используют питательные вещества для своего собственного роста.
- ухудшение вкусовых качеств, т.к. заражение зерна некоторыми видами грибов приводит к появлению характерного отталкивающего запаха плесени и неприятного вкуса, снижающих потребление корма;
- наличие микотоксинов, приводящее к ухудшению здоровья, задержке роста животных и снижению их продуктивности [5, с.38].
Микотоксины распределяются в продуктах переработки неравномерно, что вызвано их локализацией в определенных анатомических частях зерновки, разным сродством с химическими компонентами зерна, а также особенностями технологии переработки. В связи с этим в отдельных зернопродуктах возможно превышение ПДК даже при содержании микотоксина в зерне в пределах нормы [6, с.276]. Микотоксины могут «маскироваться» в растениях виде коньюгатов микотоксинов, не обнаружимые обычными аналитическими методами [7], что также увеличивает угрозу их поступления в организм.
Характеристика используемых материалов
В получении адсорбента микотоксинов из дрожжей Saccharomyces cerevisiae применялись дрожжи хлебопекарные сухие активные (производитель S.I.Lesaffre, Франция). Объектами сравнения служили также дрожжи Candida scottii штамм К-41 сухие неактивные (производитель ОАО «Волжский гидролизно-дрожжевой завод»), дрожжи S. cerevisiae хлебопекарные прессованные (производитель ОАО «Буинский сахарный завод»).
Прочный красный ЖЖ (диазоль красный ЖЖ), ч.д.а., 0,05%-ный раствор в 50%-ном этиловом спирте
Бензидин основной, х.ч., раствор (1 г бензидина растворяют в 200 мл смеси муравьиной кислоты и 0,55 мл концентрированной соляной кислоты)
Калий марганцовокислый, х.ч., ГОСТ 20490, раствор концентрации 15г/л
Хлорид алюминия (А1С13), ч., 50%-ный раствор
Ферментные препараты
Ферментный препарат Protex 6L (изготовитель Genencor International, США), содержащий щелочную сериновую протеазу субтилизин (К.Ф. 3.4.21.62).
Продуцент щелочной протеазы - Bacillus licheniformis.
Активность 580000 DU/g
Внешний вид — жидкость
Цвет - светло-коричневый
рН-5,4
Содержание субтилизина в препарате 5-10%
2.Г.З.2. Сок желудочный натуральный «Эквин» (Производитель ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ), содержит все ферменты желудочного сока. Получен из желудочного сока лошадей.
В экспериментах применялись стандартные образцы микотоксинов:
Государственный стандартный образец (ГСО 7939-2001) состава раствора дезоксиниваленола в ацетонитриле. Массовая концентрация дезоксиниваленола 20 мкг/см .
Государственный стандартный образец (ГСО 7936-2001) состава раствора афлатоксина В і в смеси бензола и ацетонитрила (соотношение объемов 98 : 2). Массовая концентрация афлатоксина В і 10мкг/см3.
Государственный стандартный образец (ГСО 7364-97) состава раствора афлатоксина В2 в смеси бензола и ацетонитрила (соотношение объемов 98 : 2). Массовая концентрация афлатоксина В2 10 мкг/см .
Стандартный образец (СОП 0008-97) состава раствора афлатоксина Gj в смеси бензола и ацетонитрила (соотношение объемов 98 : 2). Массовая концентрация афлатоксина Gi 10 мкг/см3.
Стандартный образец (СОП 0010-97) состава раствора афлатоксина G2 в смеси бензола и ацетонитрила (соотношение объемов 98 : 2). Массовая концентрация афлатоксина G2 10 мкг/см Государственный стандартный образец (ГСО 7941-2001) состава раствора охратоксина А в смеси бензола и уксусной кислоты (соотношение объемов 99 : 1). Массовая концентрация охратоксина А 50 мкг/см .
Государственный стандартный образец (ГСО 7943-2001) состава раствора зеараленона в бензоле. Массовая концентрация зеараленона 20 мкг/см3.
Стандартный образец (СОП 002-94) состава раствора Т-2 токсина в бензоле. Массовая концентрация Т-2 токсина 100 мкг/см3.
Стандартный образец (СОП 009-95) состава раствора патулина в этилацетате. Массовая концентрация патулина 10 мкг/см3.
В экспериментах применялись стандартные образцы витаминов.
Холинхлорид (витамин В4); осч, производитель Merck KGaA, Германия
Никотиновая кислота (витамин В5), осч, производитель AppliChem GmbH, Германия
Тиамина гидрохлорид (витамин В і), производитель AppliChem GmbH, Германия.
Ретинола ацетат 95% (витамин А), производитель AppliChem GmbH, Германия.
Пантотенат кальция (витамин В3), производитель AppliChem GmbH, Германия.
DL-a-токоферол ацетат 98%, производитель AppliChem GmbH, Германия
Рибофлавин 98% (витамин В2), производитель AppliChem GmbH, Германия.
DL-a-холекальциферол (витамин D3), производитель Merck KGaA, Германия.
Сравнительная оценка адсорбции Т-2 токсина кормовыми дрожжами (Candida scottii) и дрожжами Saccharomyces cerevisiae
Нами проведены исследования in vitro по определению возможности адсорбции микотоксина Т-2 кормовыми дрожжами {Candida scottii штамм К-41) и дрожжами Saccharomyces cerevisiae. Данные объекты являются компонентами рациона сельскохозяйственных животных и птиц.
Была проверена адсорбция микотоксина Т-2 in vitro течение 30 минут при температуре 38С в соотношении токсин : адсорбент 1:1000. Результаты представлены в таблице 1.
Как видно из представленных данных, адсорбция Т-2 токсина при температуре 38С и при рН 7,0 изменяется в широких пределах. Однако наблюдается следующая тенденция. Инактивированные дрожжи Saccharomyces cerevisiae, обладают большей адсорбционной способностью по отношению к микотоксину Т-2 как в нейтральной, так и в кислой среде по сравнению с адсорбционной способностью инактивированных дрожжей Candida scottii. Инактивированные дрожжи
Saccharomyces cerevisiae обладают практически равной по значению эффективностью адсорбции Т-2 токсина в обоих случаях. Установлено, что при проведении адсорбции при температуре среды 20С достоверного увеличения или снижения адсорбционной способности инактивированных дрожжей Candida scottii и Saccharomyces cerevisiae не происходит.
Таким образом, проведённые исследования позволяют сделать вывод о том, что инактивированные дрожжи Saccharomyces cerevisiae обладают адсорбирующей способностью к Т-2 токсину, в опытах in vitro, в большей степени, чем дрожжи Candida scottii.
Сравнительная адсорбция Т-2 токсина промышленно изготовляемыми дрожжами Saccharomyces cerevisiae
Экспериментальные данные адсорбции Т-2 токсина термически инактивированными при 105С дрожжами S. cerevisiae (изготовитель S.I.Lesaffre) и дрожжами S. cerevisiae (изготовитель ОАО «Буинский сахарный завод») не выявило достоверных преимуществ между дрожжами (табл.2). Для чистоты эксперимента сухие дрожжи S.I.Lesaffre были предварительно доведены до влажности 75%, а затем подвергались конвекционной сушке.
Таблица 2 Адсорбция Т-2 токсина промышленно изготовляемыми дрожжами
Saccharomyces cerevisiae
Однако постоянное значение влажности сухих дрожжей упрощает проведение экспериментов, связанных с протеолизом дрожжей и выделением из них клеточных стенок, результаты экспериментов более точны и воспроизводимы. Поэтому последующие эксперименты проводились с применением дрожжей S. cerevisiae (S.I.Lesaffre).
