Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 6
1.1 Мутация karl и её использование для получения и исследования гетерокарионов у дрожжей-сахаромицетов 6
1.2 Апоптоз у дрожжей 11
1.3 Основные свойства прионов у низших эукариот 21
ГЛАВА 2 Материалы и методы 35
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 42
ГЛАВА 3 Получение и анализ гетерокарионов со скрытым ядром 42
ГЛАВА 4 Влияние сочетания аллелей локусов МАТ и KAR1 на
выживаемость зиготических клонов 48
ГЛАВА 5 Влияние аллелей гена KAR1 на сегрегацию ядра в первую почку гетерокариона, а также на деградацию ядер в зиготе 51
ГЛАВА 6 Влияние задержки роста зигот на ядерную трансмиссию и
накопление ROS при различных комбинациях аллелей MATaKARI 61
ГЛАВА 7 Влияние цитоплазматически наследуемых факторов на ядерную трансмиссию и деградацию ядер в гетерокарионах 69
7.1 Влияние разных цитоплазматических воздействий на селекцию ядра, сегрегирующего в первую почку 72
7.2 Влияние разных цитоплазматических воздействий на ядерную деградацию 77
ГЛАВА 8 Проверка гипотезы об участии прионов в ядерной трансмиссии у гетерокарионов 19
ГЛАВА 9 Цитологические признаки апоптоза в KARI/kar/гетерокарионах...85
ГЛАВА 10 Обсуждение результатов 87
ВЫВОДЫ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94
- Мутация karl и её использование для получения и исследования гетерокарионов у дрожжей-сахаромицетов
- Материалы и методы
- Получение и анализ гетерокарионов со скрытым ядром
Введение к работе
Актуальность проблемы
Данная диссертационная работа относится к разряду фундаментальных исследований. Она посвящена изучению взаимоотношений ядерных и цитоплазматических структур в гетерокарионах дрожжей.
В настоящее время методами клеточной инженерии, пользуясь денуклеированными клетками, создают новые сочетания ядер клеток одних высших эукариот и цитоплазмы других. При этом, одной из существенных проблем оказывается взаимодействие генетических и эпигенетических факторов.
Изучать взаимовлияние ядер и цитоплазм разных клеток удобнее на модели одноклеточных низших эукариотов, используя гетерокарионы дрожжей-сахаромицетов. У этих организмов была получена мутация в гене KAR1, вызывающая запаздывание кариогамии по отношению к плазмогамии. Получаемые при этом гетерокарионы создают уникальную возможность для изучения дифференциальной трансмиссии ядер. При этом, так как дрожжи являются хорошо генетически изученным объектом, можно исследовать влияние на этот процесс таких цитоплазматически наследуемых факторов, как митохондриальная ДНК и прионовые изоформы отдельных клеточных белков. Данных о том, какие факторы цитоплазмы влияют на конкурентноспособность ядер, в литературе до сих пор нет. Более того, несмотря на то, что прионовая наследственность усиленно изучается у дрожжей, определена функция только очень немногих прионов.
Гетерозиготы KARl/karl, а также их первые почки, в большинстве своем быстро очищаются, т.е. оказываются гомогенными в отношении как ядерных, так и митохондриальных геномов. Наблюдения ряда авторов говорят о конкурентных отношениях ядер, неспособных слиться, т.к. выживает либо одно родительское ядро, либо другое.
Очищение гетерокариотических клеток от одного из ядер может быть рассмотрено в свете недавно разработанной концепции программированной клеточной гибели у дрожжей. Её наиболее изученной и распространенной формой является апоптоз. Апоптоз может запускаться как внешними факторами, например УФ излучением и изменением состава питательной среды, так и внутренними, например старением. При этом характерными чертами апоптоза являются накопление свободных радикалов в митохондриях и деградация ядерной ДНК.
Рассмотрение вопроса - осуществляется ли элиминация ядер в гетерокарионах по типу апоптоза - представляется весьма актуальным.
Научная новизна
В настоящей работе исследуется явление так называемого скрытого гетерокариоза. Впервые предложена эффективная система отбора двуядер-ных клеток, одно из ядер которых фенотипически не экспрессировано.
Впервые в потомстве гетерокариона показана зависимость отхожде-ния родительского ядра в первую почку от того, какую аллель гена KAR1 это ядро несет.
Рассмотрены варианты KAR1 х karl скрещиваний, у которых один из родителей лишен митохондриальной ДНК, а также варианты, когда гаплоиды обрабатывались гуанидин гидрохлоридом (GuHCl), вызывающим элиминацию некоторых дрожжевых прионов.
С помощью изогенных штаммов, отличающихся прионовой формой белка, участвующего в терминации трансляции [PSI+] фактора, впервые получены свидетельства в пользу влияния прионов на деградацию родительских ядер в гетерокарионе.
Изучалось накопление свободных радикалов у гетерокарионов и впервые получены данные в пользу связи апоптоза с гетерокариотической ядерной деградацией.
Цели и задачи исследования
Исследовать явление скрытого гетерокариоза.
Сравнить клеточный состав зиготических гетерокариотических клонов в двух типах скрещивания, отличающихся сопряжением аллелей генов МАТ и KARL
Использовать частичный педигри-анализ для выявления разных по фенотипу пар зигота/почка (или мать/дочь). Оценить количественно разные классы этих пар и, таким образом, охарактеризовать интенсивность процесса деградации ядер в зиготе. Сравнить данные, полученные в разных скрещиваниях.
Выяснить, как внешние воздействия, вызывающие задержку в почковании зигот, сказываются на частоте появления разных м/д пар.
Выяснить, как сказывается на трансмиссии и деградации ядер в зиготе обработка родительских гаплоидов агентами, вызывающими наследственные изменения цитоплазматических факторов (мтДНК и прионов).
Изучить цитологическими методами наличие в гетерокарионах таких типичных черт апоптоза, как накопление активных кислородных радикалов (ROS) и деструкция ядер.
Мутация karl и её использование для получения и исследования гетерокарионов у дрожжей-сахаромицетов
Ген KAR1 кодирует белок, который отвечает за функцию связывания с другими белками, и принадлежит органелле, служащей в клетке организатором микротрубочек. Этой органеллой является полярное тельце веретена "spindle pole body или SPB (в дальнейшем изложении будет использоваться русская транскрипция: ПТВ).
Благодаря ПТВ в клетке образуется биполярное веретено, нити которого обеспечивают митотическое деление и баланс хромосом. ПТВ представляет собой диск, встроенный в ядерную мембрану, который состоит из трех отдельных пластов (см. рис. 1.1) [1]. Наружный слой используется для построения цитоплазматических микротрубочек, в то время, как внутренний - для построения внутриядерных. Такая организация ПТВ позволяет клетке осуществлять независимую регуляцию цитоплазматических и внутриядерных микротрубочек, отличающихся своими функциями. Цитоплазматические определяют ориентацию веретена и ядра перед расхождением хромосом. Они участвуют в миграции ядер в почку в анафазе и в слиянии ядер при коньюгации. Внутриядерные микротрубочки нужны для хромосомной сегрегации. Гаплоидный геном дрожжей-сахаромицетов содержит 16 хромосом, и их сегрегация в анафазе осуществляется 16-ю микротрубочками. Дополнительные 8 микротрубочек обеспечивают связи между двумя полярными тельцами [2]. Недавно с помощью электронной микроскопии была обнаружена структура, которая как якорь притягивает ПТВ к оболочке ядра [3]. При этом ПТВ меняется в зависимости от геномной плоидности клетки. Кариогамия - процесс слияния двух ядер - индуцирует амплификацию микротрубочек в митозе [4J, причем увеличение количества микротрубочек совпадает с увеличением самого ПТВ [5]. Если в гаплоидной клетке ПТВ имеет ПО нм в диаметре, то в диплоидной - 160 нм. Очевидно, величина ПТВ и количество микротрубочек зависят от контакта с определенными сайтами ядерной мембраны. В дополнении к своей роли в организации микротрубочек, ПТВ служит местом прикрепления проспоровых мембран во время мейоза [6]. В течение клеточного цикла ПТВ воспроизводится только один раз, при этом внутри ядра формируется биполярное веретено. Удвоение можно наблюдать в конце предыдущего клеточного цикла в виде появления структуры — полумоста "half-bridge" [7] (см. рис. 1.1). Белки этой структуры участвуют в контроле за дубликацией ПТВ. Были открыты два белка - компонента структуры полумоста, вовлеченные в процесс дубликации: белок Cdc31p и Karlp [8,9]. Белок Karlp (53-кДа), как было показано значительно раньше [10, 11], играет важную роль в кариогамии при скрещивании. Роль гена KAR1 в митозе была выявлена в 90-х годах, когда удалось показать его участие в транспорте центрина в полярное тельце веретена [12]. Двойная функция белка Karlp обеспечивается двумя соседними доменами в его центральной части [13, 14].
Считается, что участок белка, состоящий из 70 аминокислот, расположенный ближе к С-концу, ответственен за прикрепление ПТВ к ядерной мембране на границе с полумостом. Это следует из того, что соответствующий участок необходим и достаточен для локализации белка слияния Karlp-fi-галактозидазы в ПТВ. Делеции в соответствующем участке гена вызывают блок дубликации ПТВ, но не мешают ядерному слиянию. Функция так называемого ПТВ домена Karlp, ответственного за удвоение ПТВ, может выполняться другими белками. Это было показано в эксперименте, в котором доминантные супрессорные мутации в гене CDC31 исправляли дефект репликации ПТВ, вызванный делецией ПТВ домена в Karlp [15,16,17].
N-терминальный домен белка Karlp, ответственный за кариогамию, связывается с белком ПТВ, названным Spc72p, причем это связывание зависит от фазы жизненного цикла и от обработки феромонами. С-терминальный район белка Karlp участвует в выполнении обеих функций ПТВ, т.е. и в удвоении и в конъюгации.
Материалы и методы
В работе была использована стандартная трехбуквенная номенклатура для обозначения генотипов и фенотипов штаммов дрожжей Захаров и др. [109].
Применялись также следующие обозначения:
Ppsu - псевдоплейотропная супрессия;
ПТВ - полярное тельце веретена (SPB);
karP — родительский штамм с мутацией karl;
ММР - множественно маркированный родительский штамм;
м/д пара - пара, образуемая зиготой (матерью) и её первой почкой (дочерью);
ПС - гетерокарион;
ГКс — скрытый гетерокарион;
2п - диплоид;
Г - гибрид;
ДН/р - деградация не ре пли циро ванного ядра;
ДР - деградация реплицированного ядра;
N - объем выборки (количество пар мать/дочь);
N«- количество пар с "а" почкой;
Na - количество пар с "а" почкой;
SC - синтетическая полная среда;
SO leu - синтетическая полная среда без лейцина;
М — минимальная среда;
M+his (ade, ura, ...)- минимальные среды с гистидином (аденином, урацилом и т.д.);
MEth - минимальная среда с этанолом;
YEPD - полная среда (дрожжевой экстракт, пептон, декстроза);
YEPD+cyh - полная среда с добавлением циклогексимида;
YEPE - полная среда с добавлением этанола вместо глюкозы;
EtBr - этидиум бромид;
DAPT — краситель 4,6-диамино-2-фенилиндол;
DFD - краситель 2,7-дихлорофлуоресцин диацетат;
ThT — тиофлавин Т;
GuHCl - гидрохлорид гуанидина;
СуН клоны — клоны, устойчивые к циклогексимиду;
Chf клоны - клоны, чувствительные к хлорамфениколу;
CytC - цитохром С;
GFP - зеленый флуоресцирующий белок;
ROS — активные кислородные радикалы (reactive oxygen species);
ф FOA-среда- синтетическая среда с 5-фтороротовой кислотой;
Foa — обозначение фенотипа, проявляющегося как способность к росту на среде FOA;
LB — среда Luria-Bertani для выращивания Е.соН;
п.о. - пар оснований.
2.2 Использованные штаммы, и среды для их культивирования
Штаммы дрожжей и штамм Е.соН, использованные в этой работе, представлены в таблице дрожжевые штаммы Saccharomyces cerevisiae
К5-5А MA Та his4 ade2 karl-1
К5-13 MATahis5 karl-1
168t MATahis5
169t MATahisS
F592 MAT а игаЗ leu2 his3 trpl lys2 ade2 cdc25
YTK79 MAT а игаЗ 1еи2 his В trpl lys2 [i//5 3-histone2A-GFP]
YPH499 MATa игаЗ leu2 his3 trpl lys2 ade2
YPH500 MAT а игаЗ leu2 his3 trpl lys2 ade2
YPH857 MATa игаЗ leu2 his3 trpl lys2 ade2 n// YPH925 MATa игаЗ leu2 his3 trpl lys2 ade2 karl-1 . LL20 MA Та leu2 his3
DC-5 MAT&leu2 his3
AB1380 MATa игаЗ UeXhisS trpl lys2 ade2
T9a-ND1 MATa игаЗ his3 lys2 karl-1(из тетрадного анализа гибрида YPH925 х К5-13)
T2b-ND2 MATa lys2 his5 karl-1, histone2A-GFP(из тетрадного анализа гибрида YTK79 х К5-13)
T4a-ND2 MATalys2 игаЗ 1еи2 trpl karl-1, histone2A-GFP (из тетрадного анализа гибрида YTK79 х К.5-13)
OT56/g MATaadeI-14[P$V] з, fYp". -:"?-1, --Г
AH/B MATaadel-14karl-l [PSI] . ,..- и :$ ,--/r j ,{,h бактериальный штамм Escherichia coli
HB101 recA hsdS endA leuB pro A lac J rspL
Для культивирования дрожжей использовали стандартные дрожжевые среды: полную - YEPD, минимальную среду (М), синтетическую полную среду с необходимыми добавками для каждого штамма (SC) и другие, указанные в работе Sherman et al. [110].
Для определения дыхательной компетентности использовали YEPE, где вместо глюкозы добавлялся этанол 20мл/л. Для тестирования клонов, устойчивых к цикл ore ксимиду, использовали среду YEPD, либо YEPE, с добавлением циклогексимида в концентрации 8,0 и 4,0 мкг/мл соответственно.
Отбор Ura клонов проводили на минимальной среде с 5-фтороротовой кислотой - среда 5-FOA [111].
Дрожжи выращивали при 30С. Все исключения оговорены в тексте.
Клетки E.coli выращивали при 37С на среде LB [112].
2.3 Генетические методы анализа дрожжевых штаммов
Использовались стандартные методы генетического анализа, описанные в работе Sherman et al. 1986 [110].
Частичный педигри-анализ выполнялся в соответствии с [20]. Скрещивания, в которых один из родителей нес мутацию karl-І (названные для краткости karl скрещивания) проводились следующим образом: два штамма противоположного типа спаривания выращивались до поздней логарифмической фазы на YEPD. Равные количества клеток смешивались, осаждались, а затем рассевались на YEPD и инкубировались 2 часа при 30С. Затем зиготы - гантелеобразные клетки и их первые почки, изолировались попарно на полной среде с помощью микроманипулятора. Более полный педигри-анализ включал в себя анализ материнской клетки и трех последовательных зиготических почек. Подросшие материнские и дочерние клоны высаживались штрихами на агаризованную YEPD, и через 2 дня перепечатывались на селективные среды. Пары зиготических и дочерних клонов с различным фенотипом суммировались по классам.
Для получения г ho0 клонов с отсутствием мтДНК проводился четырех - пяти кратный пересев штаммов на среде YEPD с добавкой этидиум бромида (EtBr) в количестве 100 мкг/мл. Косвенным доказательством элиминации мтДНК в большинстве клонов, согласно [113], служило отсутствие роста у более, чем 99% колоний после последнего пересева на среде, содержащей 2% этанол, YEPE.
Цитодукция проводилась следующим образом. Штамм rho, являющийся донором ядра, и rho y являющийся донором цитоплазмы, выносились штрихами на агаризованную YEPD. После 2-3 дней роста клетки, взятые с зоны пересечения штрихов, клонировались на той же среде. Через 2 дня подросшие колонии перепечатывались на селективные среды. Колонии, отвечающие потребностям rho родителя, но способные расти на среде с этанолом в качестве единственного источника углерода, отбирались как цитодуктанты [114].
Для элиминации прионов использовался гидрохлорид гуанидина (GuHCl). Дрожжевые клетки инкубировались на агаризованной среде YEPD с GuHCl в концентрации 5 мМ в течение 2-х дней и затем перепечатывались на свежую среду YEPD+GuHCl. После трех последовательных пересевов на этой среде клетки снова рассевались на чашках с YEPD+GuHCl для получения отдельных колоний [63].
Получение и анализ гетерокарионов со скрытым ядром
Мы использовали Ura фенотип у множественно маркированных штаммов YPH500 и F592 для идентификации их ядра в скрытом состоянии. Эффективный способ получения гетерокарионов (ГК) и их потомков со скрытым ядром от множественно маркированного родителя (ММР) представлен на рисунке ЗЛ.
ММР скрещивали на агаризованной среде YEPD с rho дериватом штамма К5-13, несущим только одну ауксотрофность по гистидину и мутацию karl (для краткости родительские штаммы с мутацией karl в дальнейшем обозначены karP). Спустя 3-4 суток популяционная смесь рассеивается на YEPD и переносится методом отпечатков на две среды: минимальную синтетическую, в которой глюкоза заменена этанолом (MEth), и на такую же среду, куда добавлен гистидин (MEth + his) (рис. 3.1, а). Через 2-3 суток на среде MEth вырастают только гибридные клетки, а на MEth+his кроме них, потомки ГК, которые имеют rho цитоплазму и экспрессирующееся ядро от К5-13. После отсева таких цитодуктантов штрихами на YEPD мы проверяли, не содержат ли они также ядро от ММР (рис. ЗЛ, б). Для этого методом отпечатков цитодуктанты His типа переносили на синтетическую среду без добавок. Эта селективная среда была призвана обнаружить клоны, в клетках которых проявилось скрытое ядро, так как только экспрессия обоих ядер приводит к прототрофности. Другая среда, на которой проверялись His rho цитодуктанты, содержала 5-фтороротовую кислоту (FOA). На этой среде отбираются только те клетки, которые нуждаются в урациле. Так как штаммы ММР имеют Ura фенотип, мы рассчитывали отобрать на FOA клетки, несущие скрытое ядро Ura родителя, которое стало экспрессироваться. В наших опытах на FOA давали колонии вторичного роста ММР фенотипа только те клоны, которые прорастали на М среде. Чтобы правильно идентифицировать клоны, выросшие на FOA, их снова отсевали на эту среду и переносили на ряд селективных сред, как это показано на рисунке 3.1, в. При этом на среде M+ura очевидно вырастают гибридные клоны, потерявшие одну из гомологичных хромосом с геном дикого типа URA3. На среде
M+ura+his идет селекция клеток с ядром от К5-13, приобретших Ura
фенотип в результате спонтанного мутагенеза (они на схеме заключены в прямоугольник). На среде с комплексной добавкой, включающей все аминокислоты и азотистые основания, в которых нуждаются ММР штаммы, можно отобрать клетки, не растущие на двух других средах (на рис. ЗЛ, в они заключены в овал). В ходе дальнейшей проверки определялись их отдельные ауксотрофности. Идентичность фенотипа клонов, отобранных на FOA, с фенотипом ММР говорит о том, что в клетках первоначально отобранных цитодуктантов с экспрессируемым ядром от штамма кагР в скрытом виде присутствовало ядро от ММР штамма. Выявление на FOA клонов, идентичных ММР, дает нам основание считать часть цитодуктантов кагР типа, дающих вторичный рост на М (как это показано на рис. 3.1, б), скрытыми гетерокарионами (ГКс).
Блот-гибридизация по Саузерну у ГКс, взятых с YEPD, и его дериватов, отобранных на соответствующих селективных средах (М и FOA), подтверждает получение штаммов, в которых четко проявляются аллели, пришедшие от ММР из цитодуктантов кагР типа. Как видно из рисунка 3.2, ГКс, выросший на среде YEPD, несет аллели немутантного типа, пришедшие от кагР (дорожка 3). Полосы, соответствующие мутантным аллелям ММР (в данном опыте YPH500, дорожка 2), появляются у сегрегантов, отобранных на М среде (ГКс/М, дорожка 4), причем штамм делается неотличим от истинного гибрида (дорожка 1) и у сегрегантов, отобранных на FOA среде (ГКс/FOA, дорожка 5).
