Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о механизме действия ферментов 9
Глава 2. Структурно-функциональные свойства амилолитических ферментов 18
2.1. Основные представления о структурных особенностях амилаз 18
2.2. Физико-химические свойства и механизм действия амилолитических ферментов 23
2.3. Применение амилолитических ферментов 29
2.4. Особенности структуры и функции глюкоамилазы 31
Глава 3. Объекты и методы исследований 36
3.1. Объекты исследований 36
3.2. Методы исследований 36
3.2.1. Глюкозооксидазный метод определения каталитической активности глюкоамилазы 36
3.2.2. Очистка и определение молекулярной массы ферментов методом гель-хроматографии 38
3.2.3. Подготовка образцов для анализа методом инфракрасной спектрофотометрии (ИКС) 40
3.2.4. Аналитический электрофорез белков по модифицированному методу Дэвиса 43
3.2.5. Цифровая методика дифференциально-термического анализа (ДТА) для исследования процесса термической инактивации белков 43
3.2.6. Метод получения компьютерных моделей пространственной структуры белковых молекул на базе программы MolScript 44
3.2.7. Фотоокисление белков в присутствии метиленового голубого 45
3.2.8. Статистическая обработка результатов экспериментов 46
Глава 4. Выделение, очистка и исследование некоторых физико-химических свойств глюкоамилаз из Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7 и Aspergillus awamori 47
Глава 5. Кинетико-термодинамические аспекты процесса термической инактивации глюкоамилаз 64
Глава 6. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей и особенностей вторичной структуры глюкоамилаз различного происхождения 79
Глава 7. Особенности строения активного центра глюкоамилазы. Молекулярный механизм катализа реакции гидролиза крахмала 102
Заключение 122
Выводы 126
Список литературы 128
Приложение 151
- Современные представления о механизме действия ферментов
- Физико-химические свойства и механизм действия амилолитических ферментов
- Глюкозооксидазный метод определения каталитической активности глюкоамилазы
- Выделение, очистка и исследование некоторых физико-химических свойств глюкоамилаз из Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7 и Aspergillus awamori
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние десятилетия при совершенствовании многих биотехнологических процессов широко используются амилазы микроорганизмов, которые заменяют и вытесняют энзимы растительного и животного происхождения. Исследование структурно-функциональных свойств амилолитических ферментов приобретает особую значимость в связи с применением их в различных отраслях промышленности в роли биокатализаторов, а также в медицине в качестве лекарственных препаратов. Особый теоретический и практический интерес представляют исследования по выявлению оптимальных режимов функционирования ферментных препаратов глюкоамилазы (а-1,4:1,6-глюкан-4,6-глюкогидролазы, КФ 3.2.1.3), осуществляющих гидролиз гликозидных связей в молекулах крахмала. Использование глюкоамилазы в биотехнологии в роли катализатора связано с подбором эффективных продуцентов данного энзима, в качестве которых в нашей работе предложены микромицеты Aspergillus awamori и дрожжи Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7. Поиск путей регулирования биокаталитической активности фермента неразрывно связан с расшифровкой закономерностей и молекулярного механизма катализа реакции гидролиза субстрата. Для решения поставленной задачи необходимо осуществить детальное исследование физико-химических, кинетико-термодинамических свойств глюкоамилазы, особенностей первичной, вторичной, третичной структуры этого энзима, провести идентификацию функциональных групп его активного центра.
Выполненная нами работа проведена в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета, входящей в координационный план научно-исследовательских работ РАН.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы является проведение сравнительного анализа структурно-функциональных особенностей
5 глюкоамилаз из Saccharomyces cerevisiae и Aspergillus awamori.
Для достижения поставленной цели предусматривалось решение
следующих задач:
разработка эффективной методики выделения и очистки препарата глюкоамилазы из дрожжей S. cerevisiae ЛВ-7;
исследование некоторых физико-химических свойств ферментов из S. cerevisiae и Asp. awamori;
изучение кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза крахмала глюкоамилазами плесневого и дрожжевого происхождения;
создание модели перехода типа «упорядоченная , глобула -хаотический клубок» в процессе денатурации белковых макромолекул объектов исследования;
анализ аминокислотных последовательностей изучаемых ферментов для выявления гомологичных фрагментов их полипептидных цепей;
определение соотношения типов вторичной структуры и их топографии в пространственной модели молекул глюкоамилазы из S. cerevisiae и Asp. awamori;
идентификация и установление местоположения функционально-значимых групп в активном центре ферментов плесневого и дрожжевого происхождения.
Научная новизна.
впервые в качестве источника глюкоамилазы предложен штамм хлебопекарных дрожжей S. cerevisiae ЛВ-7; разработаны эффективные методы выделения и очистки данного фермента;
выявлены оптимальные режимы функционирования ферментных препаратов глюкоамилазы из S. cerevisiae и Asp. awamori;
рассмотрены основные этапы процесса термической инактивации глюкоамилаз, выделенных из S. cerevisiae и Asp. awamori;
предложена модель перехода глобула-клубок, включающая промежуточные стадии процесса разворачивания белковой молекулы
глюкоамилазы;
осуществлен анализ первичных структур глюкоамилаз рода Saccharomyces и Aspergillus; выявлены гомологичные фрагменты их полипептидных цепей;
с помощью методов ИК-спектрофотометрии и компьютерного моделирования осуществлено изучение особенностей вторичной структуры глюкоамилаз плесневого и дрожжевого происхождения; выявлена топология всех составляющих элементов в третичной структуре молекул этих ферментов;
осуществлена идентификация функциональных групп активных центров глюкоамилаз из S. cerevisiae и Asp. awamori;
с привлечением экспериментальных данных и результатов компьютерного моделирования предложен молекулярный механизм катализа реакции гидролиза гликозидных связей в молекуле крахмала с помощью глюкоамилазы.
Практическая значимость. Результаты исследований дают дополнительную информацию о процессах термической инактивации белковых молекул, позволяют расширить представления о молекулярных механизмах ферментативного расщепления полисахаридов. Подобранные рациональные условия функционирования глюкоамилаз, выделенных из различных источников, могут применяться для оптимизации режимов реакций катализа в биотехнологическом производстве. Полученные данные могут быть использованы при чтении студентам биологических факультетов ВУЗов курсов «Химическая энзимология», «Физико-химическая биология», «Молекулярная биология и биофизика», «Биофизика».
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на VI Международной конференции «Экология и здоровье человека. Экологическое образование. Математические модели и информационные технологии» (Криница, 2001), Научной сессии сотрудников Воронежского государственного университета (Воронеж, 2001), II
7 Международном симпозиуме «Фракталы и прикладная синергетика» (Москва,
2001), IX Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование» (Дубна, 2002), 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002), Международной школе-семинаре «Нелинейные процессы в дизайне материалов» (Воронеж, 2002), II Научной конференции «Современные наукоемкие технологии» (Хургада (Египет), 2003).
Публикации. По теме диссертационной работы имеется 10 публикаций: из них 3 статьи и 7 тезисов.
На защиту выносятся следующие положения:.
Эволюционная близость молекул глюкоамилаз плесневого и дрожжевого происхождения, характеризующихся низкой степенью гомологичности полипептидных цепей, проявляется на более высоких уровнях иерархии белковых глобул.
Делеции и замены остатков в полипептидных цепях глюкоамилаз рода Aspergillus не затрагивают функционально значимых групп их активных центров, располагающихся в консервативных областях аминокислотных последовательностей белковых молекул.
Высокая степень подобия пространственной организации белковых молекул глюкоамилазы из S. cerevisiae и Asp. awamori определяет идентичность механизмов катализа гидролиза крахмала, осуществляемого данными ферментами.
Разворачивание белковой глобулы глюкоамилазы вследствие термической денатурации не является кооперативным процессом, а включает ряд промежуточных состояний.
5. Схема процессов гипотетического механизма катализа гидролиза а-
1,4-гликозидных связей в молекуле крахмала.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа включает 177 страниц машиннописного текста; состоит из Введения, 7 Глав, Заключения, Выводов, Списка литературы (220
8 источников) и Приложения. Иллюстрационный материал включает 32 рисунка
и 22 таблицы; в Приложении - 10 таблиц.
Современные представления о механизме действия ферментов
Первое представление о ферменте появилось в 1833 г., когда А. Пайен и Ж. Персо обнаружили в осадке, образующемся при добавлении спирта к солодовому экстракту, термолабильное вещество, обладающее способностью превращать крахмал в сахар III. В 1897 г. Э. Бухнеру удалость выделить систему ферментов, осуществляющих брожение, из дрожжевого экстракта, не содержащего дрожжевых клеток. В 1922 г. Р. Вилыптеттером и его сотруд. была начата серия работ по получению энзиматических препаратов в чистом виде. В 1926 г. Дж. Самнер провел кристаллизацию уреазы; к 1940 г. число ферментов с высокой степенью очистки достигало 20 и продолжало увеличиваться, что создавало предпосылки для развития структурной энзимологии /21.
Наиболее фундаментальной проблемой энзимологии является установление механизмов действия ферментов, выяснение вопроса о том, каким образом химическое строение энзимов обеспечивает их каталитическую активность. Исследование кинетики действия ферментов, связанное с изучением влияния различных факторов на скорость катализируемой реакции, при сопоставлении с информацией об их структуре дает возможность детального рассмотрения особенностей протекания акта катализа.
Анализ данных литературы /1-12/ позволил заключить, что к числу главных факторов, определяющих характер течения ферментативных реакций, относятся: 1. концентрация фермента; 2. концентрация субстрата; 3. концентрация ионов водорода в реакционной среде; 4. температура; 5. наличие в реакционной среде активаторов, ингибиторов, либераторов; 6. давление. Высокая чувствительность ферментов к изменению оптимальных параметров протекания акта катализа как in vivo, так и in vitro обусловлена структурно-функциональными особенностями энзимов как соединений белковой природы. При отсутствии информации о структуре молекулы фермента изучение кинетики его действия оказывается единственно возможным подходом для выяснения механизма ферментативного катализа.
Д. Кошланд в 1958 г. разработал теорию индуцированного структурного соответствия фермента и субстрата, согласно которой субстрат при взаимодействии с активным центром энзима вызывает существенные изменения его конформации, вследствие чего происходит точная переориентировка функциональных групп активного центра /1,2, 11/.
Гипотетические представления о механизме ферментативного катализа были выдвинуты также Т. Брюсом (1960), А.Е. Браунштейном (1963), В.И. Ивановым и М.Я. Карпейским (1969), И.В. Березиным и К. Мартинеком (1971), В. Дженксом (1974). М.В. Волькенштейн (1964) предложил капельную модель фермента, согласно которой энергия, выделяемая при сорбции субстрата, трансформируется в энергию упругих колебаний белковой глобулы, ведущей себя подобно капле жидкости. Стоячие волны упругих колебаний образуют пучности в области активного центра, вызывающие его напряженность 161. Конформационная неравновесность фермента постулируется также в гипотетической модели, предложенной С.Э. Шнолем, Ю.И. Хургиным и Д.С. Чернавским /13/. Авторы полагают, что молекула белка является упругим твердым телом, а механизм рекуперации (возвращения) заключается в переводе энергии каталитической реакции в долгоживущую напряженную форму нативного фермента. Внутренняя диссипация энергии распространяется на всю глубину макромолекулы и вызывает при участии только особых «конструктивных» (механических) степеней свободы конформационные переходы, возвращающие фермент в неравновесное, деформированное состояние.
Согласно концепции Л.А. Блюменфельда (1972), конформационное изменение фермент-субстратного комплекса, следующее за присоединением субстрата к активному центру фермента, носит характер релаксации и включает в себя, кроме разрыва старых и образования новых вторичных связей в макромолекуле белка, также химические изменения субстрата, превращающие его молекулы в молекулы продукта 111.
По современным представлениям стационарная кинетика фермент-субстратных превращений характеризуется тем, что в системе участвует ряд промежуточных соединений: E + S - - X! k2 Х2 !ii- xi - Xn k+1 Е + Р Большинство ферментов проявляют каталитическое действие в водных растворах и являются гомогенными катализаторами. Однако без применения теории гетерогенного катализа довольно трудно представить механизмы ферментативных реакций вследствие того, что ферменты принадлежат к высокомолекулярным белкам, и необходимо учитывать существование в растворе ферментов микроповерхности раздела, присущей гетерогенным катализаторам.
В настоящее время среди механизмов, играющих главную роль в образовании фермент-субстратного комплекса, выделяют следующие: 1) образование ковалентных связей; 2) гидрофобные взаимодействия между неполярными углеводородными радикалами молекул субстрата и дегидратированными участками белковой глобулы; 3) электростатические взаимодействия между заряженными группами субстрата и ионизированными группами фермента; 4) образование водородных связей /1, 2, 6, 7, 10, 13/. Рентгенография ферментов и фермент-субстратных комплексов (ФСК) дает прямую информацию о конформационных превращениях биомолекул. Данные рентгеноструктурного анализа (РСА) являются надежной и пока что единственной базой для количественного описания механизма каталитического акта на атомно-молекулярном уровне /5, 14-17/.
Первым белком, трехмерная структура которого стала известной, был миоглобин. Рентгеноструктурное изучение данного белка, начатое Дж. Кендрю в 1948 г., проводилось в два этапа /18/. В 1958 г. удалось построить модель молекулы миоглобина с низким разрешением, которая отражала лишь конфигурацию полипептидной цепи и положение гема. В 1960 г. Дж. Кендрю и сотруд. получили изображение третичной структуры изучаемого объекта с указанием положения каждого отдельного атома, за исключением атомов водорода.
Физико-химические свойства и механизм действия амилолитических ферментов
Продуцентами большинства амилолитических ферментов являются бактерии и микроскопические грибы. Исследования показали, что амилазы грибного и бактериального происхождения сходны по основным физико-химическим характеристикам, но существенно различаются по термостабильным свойствам и устойчивости к низким значениям рН субстрата. Большинство исследователей склонно считать, что термостабильность зависит от особенностей структуры белковой молекулы: количества водородных связей, содержания основных и неполярных аминокислот, гидрофобности молекул, наличия или отсутствия цистеиновых остатков /87/. Активными продуцентами термоустойчивых амилаз являются многие виды бактерий из рода Bacillus. Так, а-амилаза, выделенная из культуры Bacillus diastaticus, способна гидролизовать крахмал при температуре 70-100С /88/. L.L. Campbell и G.B. Manning (1961) получили кристаллический препарат а-амилазы Bacillus stearothermophilus, проявляющий каталитическую активность при 70С и выше /89/. Показано, что данный фермент не содержит остатков цистеина, стабилизаторами его молекул являются ионы Са , сывороточный альбумин и крахмал. W. Heinen и A.M. Lauwers (1975) высказали предположение, что для сохранения структуры а-амилазы Bacillus caldoliticus при высокой температуре необходимы ионы Са" /90/. I.N. Pavlova и N.A. Kichakova (1994) выделили комплекс внеклеточных амилолитических ферментов из термофильного штамма Bacillus licheniformis, проявляющих каталитическую активность в диапазоне температур 40-100С /91/. Установлено, что термостабильность полученных амилаз сильно увеличивается в присутствии крахмала: ферменты способны сохранять 100% активность в течение 90 минут при 100С в 2% растворе крахмала.
Продуценты термоустойчивых амилолитических ферментов выявлены и среди актиномицетов. M.J. Кио и P.A. Hartman в 1966 г. впервые выделили термостабильную ос-амилазу из Thermoactinomyces vulgaris /92/. Данный фермент проявляет оптимальную каталитическую активность при 70С. Н. Hidaka et. al. (1974) показали, что а-амилаза из Streptomyces hydroscopicus SF-1084 сохраняет 75% активности при 80С /93/. S.K. Obi и F.J. Odibo (1984) получили препарат высокотермостабильной а-амилазы из Thermoactinomyces specias № 15, имеющей температурный оптимум при 80С /94/. Кроме того, ведется поиск методов повышения термоустойчивости энзимов. Так, Р. Moszczynski et. al. (1994) предложили способ увеличения термостабильности ферментов за счет их химической модификации, направленной на создание более жесткой структуры /95/. Г.И. Квеситадзе (1984) при исследовании свыше 500 видов микроскопических грибов показал, что черные аспергиллы, такие как Aspergillus niger, Aspergillus batatae, Aspergillus usamii, являются активными продуцентами кислотоустойчивых амилаз. Автором показано, что биосинтез кислотостабильных амилолитических ферментов протекает исключительно при низких значениях рН порядка 2,0-2,5 /40/. Большое внимание уделяется изучению воздействия на амилолитические ферменты ингибирующих веществ. Известно, что амилазы проявляют действие в широком диапазоне рН от 1-2 до 8,5, в интервалах температур 24-100С, отличаются термо- и кислотоустойчивостью. Установлено, что инактивирующим воздействием на амилазы обладают ионы марганца, меди, цинка, динитрофторбензол, N-бромсукцинимид, тринитробензол, сульфоновая кислота /96/. К. Kabo и Т. Takagi (1995) показали, что денатурация а-амилазы из Aspergillus oryzae додецилсульфатами может модулироваться такими катионами, как ионы натрия, лития и несколькими ионами алканоаммония /97/. Y.-Ch. Shi et. al. (1995) обнаружили, что СаСЬ и NaCl, посредством стабилизации конформации, повышают термостабильность а-амилазы Bacillus subtilis /98/. A.H. Шевелькова и сотруд. (1993) изучили влияние диметиламинометилферроцена (ДМАМФ) на процесс деструкции амилоз и мальтодекстринов под действием глюко-, а- и (3-амилаз. Обнаружено, что характер влияния ДМАМФ зависит от механизма действия амилаз и строения их активного центра. Объяснение наблюдаемого эффекта предложено с точки зрения теории субсайтного строения активного центра амилаз /99/.
К. И. Неустроев и соавт. (1993), осуществив дегликозилирование глюкоамилазы из Aspergillus awamori, обнаружили снижение ее стабильности и устойчивости к собственной секретируемой протеиназе гриба /100/. Е. Л. Гвоздева и др. (1994) показали, что центр бифункционального белка-ингибитора, ответственный за связывание а-амилазы, расположен в С-концевой части молекулы и включает остаток триптофана /101/. В настоящее время еще не объяснены различия в характере действия и широте специфичности отдельных амилаз на основе строения активных центров и пространственной структуры их молекул. По мнению ряда авторов /35, 39, 102/, для проявления каталитического действия гидролаз наибольшее значение имеют карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот и С-концевых остатков аминокислот, имидазольная группа гистидина, SH-группа цистеина, ОН-группа серина.
Важное значение в проявлении активности амилаз придается SH-группам. Высказывалось предположение, что роль одной из SH-групп ос-амилазы заключается в связывании недиализированного атома кальция и тем самым в поддержании каталитической активности определенной конформации молекулы белка/102/.
Карбоксильные группы в активных центрах ферментов могут служить контактными группами для субстратов или осуществлять кислотно-щелочной катализ, оказывая влияние на полярность расположенных по соседству с ними связей и групп фермент-субстратного комплекса или вызывая электронные смещения путем образования водородных связей. Имидазольная группа гистидина является важной функциональной группой многих ферментов и обладает высокой реакционной способностью, что объясняется особенностью строения имидазола, имеющего сопряженную систему связей. В водных растворах один из атомов азота приобретает электрофильные, а другой -нуклеофильные свойства. Свойства атомов азота способны обратимо изменяться. Поэтому каждый атом имеет двойственные качества и способен действовать как кислотно-основной катализатор и переносчик положительно-и отрицательно заряженных групп /103/.
ОН-Группа серина химически инертна. Очевидно, повышение ее реактивности в активных центрах ферментов обусловлено воздействием на нее других функциональных групп, в частности, имидазольной группы гистидина, сближенной с сериновым остатком в пространственной структуре белка /103/. Данные литературы о функциональных группах, ответственных за катализ, для амилаз в целом весьма противоречивы вследствие того, что исследователи часто использовали преимущественно метод химической модификации посредством специфических реагентов. Однако, данный метод нельзя считать надежным и универсальным, так как трудно найти реагент, взаимодействующий только с какой-нибудь одной группой. Тем не менее, с его помощью получено немало данных о природе, расположении и роли групп, существенных для действия амилаз. Т. Ikenaka (1959) установил, что для действия амилазы весьма важны фенольные группы тирозина, в то время как є-аминогруппьі лизиновых остатков не имеют существенного значения для проявления ферментативной активности /104/. На основании изменения активности и кинетических характеристик A. Hoschke et. al. (1980) пришли к выводу, что тирозиновые остатки важны для всех типов амилаз, и их функция заключается в связывании субстрата /105/. Чрезвычайно сложной и малоизученной проблемой является расшифровка механизмов действия амилаз. Несмотря на имеющиеся гипотезы, ни для одного из амилолитических ферментов механизм его действия на субстрат в деталях неизвестен.
Глюкозооксидазный метод определения каталитической активности глюкоамилазы
Метод определения активности глюкоамилазы основан на специфическом определении содержания глюкозы, образующейся при действии данного фермента на растворимый крахмал.
Принцип метода заключается в окислении P-D-глюкозы кислородом воздуха под воздействием глюкозооксидазы до глюконовой кислоты. При этом образуется эквимолярное количество перекиси водорода, определяемое путем реакции окислительного азосочетания с замещенным фенолом и 4-аминоантипирином, которая катализируется пероксидазой. Интенсивность развившейся при этом окраски пропорциональна концентрации глюкозы в растворе.
Использовали растворимый картофельный крахмал. Навеску 1,17 г помещали в мерную колбу на 100 мл, добавляли 25 мл дистиллированной воды, перемешивали, доливали еще 25 мл воды и колбу помещали на кипящую водяную баню до полного растворения крахмала.
После охлаждения в колбу приливали 10 мл ацетатного буфера (рН 4,7), доводили объем раствора до 100 мл и добавляли 1-2 капли толуола. Раствор хранили при температуре 2-4С в течение месяца.
Техника определения активности глюкоамилазы. 1 мг фермента растворяли в 1 мл дистиллированной воды, к полученному раствору приливали 2 мл раствора крахмала в ацетатном буфере (рН 4,7). Смесь инкубировали в течение 10 минут в ультратермостате при 37С, после чего останавливали реакцию гидролиза, помещая пробирки с реакционной смесью на кипящую водяную баню на 2 мин. Затем охлаждали до комнатной температуры, отбирали по 0,01 мл раствора гидролизата и добавляли в каждую пробирку по 2 мл рабочего реагента. Реакционную смесь тщательно перемешивали и инкубировали 30 минут при комнатной температуре (20-25С) или 15 минут при 37С. После окончания инкубации измеряли оптические плотности опытной и калибровочной колб против контрольной пробы в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны 510 нм на КФК-3.
В качестве калибровочной пробы выступала смесь 2,0 мл рабочего реагента с 0,01 мл стандартного раствора глюкозы. Контрольная проба - 2,0 мл рабочего реагента. Концентрацию глюкозы (С) определяли по формуле: C = D0/DCT-10, (1) где D0 и DCT - оптические плотности образца и стандарта соответственно, измеряемые относительно контрольной пробы; 10 - концентрация глюкозы в стандартном растворе, ммоль/л. Расчет активности глюкоамилазы (А) проводили по формуле: где b - количество белка, мг/мл гидролизата; 10 - время гидролиза, мин.
Гель-хроматография - фракционирование смеси компонентов по размерам молекул путем прохождения их через гели с определенной величиной пор. Метод основан на принципе обратного молекулярного сита. При пропускании через колонку раствора наибольшей скоростью продвижения по колонке обладают компоненты, размер которых больше пор геля. Более мелкие компоненты могут проникать внутрь гранул геля и продвигаются по колонке медленнее, а, следовательно, выходят из колонки последними/164, 165/. R - внутренний радиус колонки, мм. Набухший сефадекс заливали в установленную строго вертикально колонку, размер которой составлял 15 х 250 мм. В процессе заполнения всегда наблюдались три зоны: первая — слой осевшего геля, вторая — слой формирующегося геля и третья - зона чистого растворителя. После достижения необходимой высоты столбика геля через колонку пропускали элюирующий буфер до тех пор, пока сефадекс не переставал уплотняться.
Исследуемую пробу фермента в объеме 1 мл (1 мг препарата растворяли в 1 мл буфера) наносили на обезвоженную поверхность сефадекса. После того, как раствор впитывался, поверхность геля несколько раз промывали равными объемами элюента. Определение молекулярной массы ферментов проводили методом гель-хроматографии на сефадексе G-150. На колонку размером 18 х 500 мм наносили 2 мл предварительно очищенного ферментного раствора. Элюцию фракции осуществляли фосфатно-цитратным буфером (рН 4,7). Скорость элюции составляла 1 мл за 5 минут. Наличие белка во фракциях определяли по методу Лоури /164/. 2. Па поверхность сефадекса, заполненного буферным раствором, наслаивали растворы белков-маркеров объемом 0,1 мл ( 2 мг/мл). В качестве маркеров использовали белки с известной молекулярной массой: инсулин (6 кДа), цитохром С (13 кДа), интерферон (22 кДа), бычий сывороточный альбумин (68 кДа), каталазу (200 кДа). Элюцию осуществляли по методике, описанной выше. По полученным данным строили калибровочную прямую: по оси ординат откладывали десятичный логарифм молекулярных масс белков, а по оси абсцисс - величины их объемов выхода. По этому графику определяли кажущиеся молекулярные массы исследуемых белков.
Для приготовления таблетки использовали оптически чистый монокристаллический КВг. Измельчение контрольного образца КВг массой 7 мг проводили в вибраторе Ардена в течение 4 минут. При перемешивании КВг с исследуемым образцом соотношение по массе составляло 9,5 мг КВг:0,15 мг объекта. Полученную порошкообразную смесь массой 2 мг всыпали в отверстие пресс-формы и путем вращения пуансона выравнивали поверхность смеси. Пресс-форму подвергали герметизации с помощью шпинделя пресса и осуществляли вакуумирование до давления 133 Па в течение 2 минут. Далее производили прессование ручным прессом в течение 5 минут с усилием 600 МПа. Полученную таблетку диаметром 3 мм вставляли во внутренние направляющие универсального держателя спектрофотометра. Вызванное оттенение рамным кольцом компенсировали при использовании данных памяти поправок спектрофотометра. Во время приготовления таблетки и регистрации ИК-спектров относительная влажность воздуха в помещении не превышала 75%.
Измерения величин светопропускания белковых образцов проводили с помощью многофункционального ИК-спектрофотометра SPECORD М-80 (Германия) в диапазоне 4000-400 см"1.
Выделение, очистка и исследование некоторых физико-химических свойств глюкоамилаз из Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7 и Aspergillus awamori
Для изучения структурно-функциональных свойств ферментов, исследования механизмов катализируемых ими реакций необходимы высокоочищенные препараты, свободные от примесей, способных влиять на скорость процесса превращения субстрата в продукт. В качестве продуцента глюкоамилазы нами были выбраны хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae ЛВ-7. Анализ данных литературы указывает на многообразие комбинаций используемых авторами методов получения амилолитических препаратов с высокой степенью чистоты /172-177/. Мы изучили влияние на эффективность выделения и очистки глюкоамилазы различных органических растворителей, а также условий хроматографирования.
Культивирование продуцента проводили в лабораторных условиях в два этапа. Сначала дрожжи выращивали твердофазным способом в чашках Петри в течение 48 ч при температуре 26-27С и рН субстрата 4,7-5,0, используя в качестве питательной среды агар и солодовое неохмеленное сусло (8% сухого вещества). На втором этапе полученный инокулят вносили в колбы в мелассную среду (меласса - 10% сухого вещества) и осуществляли культивирование глубинным методом в течение 24 ч при температуре 30-32С и рН субстрата 4,7-5,0. Готовую биомассу продуцента сушили 3-4 дня при 25-27С, измельчали до порошкообразного состояния. Для разрушения клеточной стенки и перевода глюкоамилазы в раствор дрожжи тщательно растирали с песком или измельченным стеклом. Экстракция фермента может быть проведена с использованием бидистиллированной воды, однако, учитывая тот факт, что амилазы обычно проявляют максимум каталитической активности в диапазоне значений рН 4,5-5,0, для данной цели применяли ацетатный буфер с рН 4,7. Экстрагирование глюкоамилазы осуществляли при постоянном перемешивании в течение 1,5-2,0 ч при температуре 20-22С из 5% раствора дрожжей.
Известно, что белковые молекулы в присутствии органических растворителей способны образовывать агрегаты и выпадать в осадок, так как сила электростатического притяжения обратно пропорциональна диэлектрической постоянной среды, которая в данном случае уменьшается /1, 60/. В этой связи нами было изучено влияние различных концентраций (50,0-83,3%) ацетона, изопропилового и этилового спиртов на эффективность осаждения глюкоамилазы.
Анализ литературы показал, что при комнатной температуре большинство ферментов быстро денатурируется органическими растворителями /1, 49, 51, 164/. Низкая температура не только предохраняет фермент от инактивации, но и усиливает осаждающее действие растворителей. Поэтому культуральную жидкость охлаждали до -2С, органические растворители - до -6 С. Внесение осадителя в экстракт фермента проводили при постоянном перемешивании, поместив колбу в емкость со льдом. Далее осуществляли центрифугирование при 3000 g в течение 15 минут. Полученный осадок растворяли в минимальном объеме ацетатного буфера (рН 4,7) для снижения в препарате концентрации органического растворителя. Определение количества белка в осадке осуществляли по методу Лоури /164/, удельную активность рассчитывали с помощью глюкозооксидазного метода. Результаты экспериментов (табл. 2) свидетельствуют о том, что использование органических растворителей в диапазоне концентраций 50,0-83,3%) по-разному отражается на выходе глюкоамилазы и величине ее удельной активности. Выявлено, что максимальный выход фермента 38,6% наблюдается после осаждения изопропиловым спиртом в концентрации 80,0%, что на 1,5% больше по сравнению с действием этилового спирта и на 5,1% превышает данную величину для ацетона. При более низких значениях концентрации органических растворителей процент выхода глкжоамилазы понижается незначительно, однако, удельная активность составляет лишь -30% от максимальной величины. Высокие концентрации осадителей (83,3%) снижают каталитическую активность глкжоамилазы и уменьшают выход фермента на 5%. Следовательно, осаждение глкжоамилазы из культуралыюй жидкости дрожжей S. cerevisiae ЛВ-7 целесообразно осуществлять с помощью 80,0%) изопропилового спирта, т.к. именно в этом случае выход фермента максимален (38,6%), а удельная активность достаточно высокая (0,43 ед/мг). Результаты наших экспериментов хорошо согласуются с данными литературы. Так, Е.Я. Калашников (1959) показал высокую эффективность применения изопропилового спирта для выделения амилолитического комплекса из экстракта поверхностной культуры Aspergillus oryzae /178/. W.M. Fogarty et al. (1983) установили, что осаждение (3-амилазы из фильтрата культуральной жидкости Bacillus subtilis IMD198 изопропанолом позволяет существенно повысить выход по активности по сравнению с другими органическими растворителями /179/.
Получение ферментных препаратов основано на осаждении белка путем дегидратации его мицелл и снятия заряда гидрофильной молекулы органическими растворителями или нейтральными солями. При этом важную роль играет начальная величина концентрации ионов водорода ферментной вытяжки. Известно, что из одного и того же раствора при различных значениях рН можно получить неодинаковый выход осадков, содержащих разное количество фермента /1, 164/. Это связано с тем, что наиболее полно ферменты осаждаются при величине рН, соответствующей изоэлектрической точке данного белка. Так как для глюкоамилазы из дрожжей S. cerevisiae ЛВ-7 подобные данные отсутствуют, мы проводили осаждение изопропанолом в концентрации 80,0% из экстрактов, приготовленных на ацетатном буфере с диапазоном значений рН 3,5-6,0.
Обнаружено (табл. 3), что наибольший выход глюкоамилазы (37,3%) наблюдается в интервале величин рН 4,5-5,0 с максимумом при рН 4,7. В этом же диапазоне значений концентрации ионов водорода в среде фермент проявляет высокую каталитическую активность, максимальная величина которой зафиксирована при рН 4,7 и составляет 0,42 ед/мг, что вполне согласуется с данными литературы /47, 119-121, 180/.
С целью выявления оптимальной для выделения глюкоамилазы концентрации культуральной жидкости дрожжей фермент осаждали 80% изопропиловым спиртом из экстрактов с 5-30% содержанием продуцента.
![Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания](/i/i/4306/51263.png "Прионный детерминант [PSI+] дрожжей Saccharomyces cerevisiae: структурная организация и механизмы поддержания Крындушкин Дмитрий Сергеевич")
