Содержание к диссертации
Введение
1.1. Актуальность проблемы 7
1.2. Цели и задачи исследования 10
1.3. Основные положения, выносимые на защиту 11
1.4. Научная новизна полученных результатов 12
1.5. Теоретическое и практическое значение работы 13
1.6. Апробация работы 13
2. Обзор литературы 14
2.1. Гликозидгидролазы, механизм действия 14
2.2. Ксиланы - природные субстраты Р-ксилозидаз 20
2.3. р-Ксилозидазы микроорганизмов, физико-химические характеристики
2.4. Структурно-функциональные исследования Р-ксилозидаз 28
2.5. Трансгликозилирование, ферментативный синтез гликоконьюгатов
3. Материалы и методы 39
3.1. Субстраты для измерения ферментативной активности 39
3.2. Методы измерения ферментативной активности 39
3.3. Выделение Р-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori
3.4. Выделение Р-ксиланазы из мицелиального гриба Trichoderma reesei (семейство 11)
3.5. Выделение Р-ксиланазы из мицелиального гриба Aspergillus orizae (семейство 10)
3.6. Методы определение чистоты и молекулярной массы ферментов
3.7. Методы определения частичной аминокислотной последовательности Р ксилозидазы
3.8. Методы исследования физико-химических свойств ксилозидазы
3.9. Методы определения кинетических характеристик и констант ингибирования реакций гидролиза, катализируемых ферментами
3.10. Определение стереохимии ферментативного гидролиза р- ксилозидазы методом 'Н ЯМР спектроскопии
3.11. Исследование трансгликозилирующей активности 0- ксилозидазы
3.12. Исследование влияния рН и концентрации и-НФК и МУФК2 на выход продуктов трансгликозилирования
3.13 Препаративный синтез «-НФК2.3 и МУФК3.5 50
3.14. Препаративный синтез и-НФК4-7 50
3.15. Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методом ЯМР
3.16. Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методом масс-спектрометрии
3.17. Исследование характера действия ксиланаз семейств 10 и 11 по отношению к ферментативно синтезированным гс-НФК2.6 и МУФК2.5
4. Результаты и обсуждение 54
4.1. Выделение и физико-химические свойства Р-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori 54
4.2. Исследование первичной структуры р-ксилозидазы 57
4.3.Определение констант ионизации каталитических групп Р- ксилозидазы
4.4. Исследование стереохимии гидролиза и характера действия ксилозидазы
4.5. Исследование трансгликозилирующей активности р~ ксилозидазы
4.6. Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методами ЯМР и масс-спектрометрии
4.7. Анализ кинетических характеристик реакции гидролиза, катализируемой р-ксилозидазой
4.8. Анализ констант ингибирования реакции гидролиза, катализируемой Р-ксилозидазой
4.9. Исследование продуктов реакции трансгликозилирования, катализируемой изучаемой Р-ксилозидазой из мицелиального гриба Aspergillus awamori, в качестве субстратов для эндо-ксиланаз семейств 10 и 11
5. Выводы 90
6. Список опубликованных по теме работ 92
7. Благодарности 94
8. Список литературы 95
- Актуальность проблемы
- Гликозидгидролазы, механизм действия
- Методы измерения ферментативной активности
- Выделение и физико-химические свойства Р-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori
Введение к работе
Углеводы играют существенную роль в мириадах биологических процессов. Огромное количество различных олигосахаридных структур, обнаруженных в природе, происходит из рациональной организации ферментативного образования и разрыва гликозидных связей. Гликозидная связь является одной из наиболее прочных связей, существующих в природе. Период ее естественного распада составляет более 5 миллионов лет. Гликозидгидролазы - ферменты, способные ускорить гидролиз гликозидной связи более чем в 1017 раз, являются одними из наиболее эффективных из существующих катализаторов. Поэтому интерес к реакциям ферментативного гидролиза природных полимеров обусловлен не только фундаментальными, но и прикладными задачами.
Ксилан - основной структурный полисахарид клеток растений, зторой по распространенности после целлюлозы полисахарид в природе. Ксилан представляет собой полимер, состоящий, в основном, из цепей P-D-ксилопиранозных остатков, соединенных 1-4-гликозидными связями Основными компонентами ксиланолитической системы, определяющими скорость гидролиза ксилана, являются два типа ферментов: эндо-ксиланазы (1,4-Р-0-ксиланогидролазы К.Ф. 3.2.1.8.), гидролизующие ксилан до коротких ксилоолигосахаридов, и Р-ксилозидазы (1,4-Р-0-ксилогидролазы К.Ф. 3.2.1.37), расщепляющие короткие ксилоолигосахариды до ксилозы и являющиеся ключевыми ферментами полной деградации ксилана (Collinset al., 2005). Огромный интерес к изучению системы ферментов, участвующих в метаболизме этого полимера, связан с их широким применением в биотехнологии. Эти ферменты используют в целлюлозно-бумажной, текстильной и пищевой промышленности (Beg et al., 2001). Интенсивное использование эндо-ксиланаз и Р-ксилозидаз в промышленном производстве постоянно стимулирует два основных направления исследований - поиск новых источников ферментов и подробное изучение их ферментативных свойств, дающее возможность более эффективно использовать данные ферменты в биотехнологических процессах.
Второе направление возможного использования гликозидгидролаз в биотехнологии основывается на том факте, что многие представители этого класса ферментов обладают не только гидролитической, но и трансгликозилирующей - синтазной активностью, и способны осуществлять ферментативный синтез различных гликоконьюгатов. Одним из примеров применения трансгликозилирующей активности гликозидгидролаз является ферментативный синтез олигосахаридов, содержащих хромофорные или флуоресцентные группы (Zeng et al., 2000; Mala et al., 1999). Гликозидгидролазы являются эффективным инструментом в синтезе подобных олигосахаридов благодаря их высокой селективности и стереоспецифичности. Такого рода субстраты используются для исследований широкого круга гликаназ (Honda et al., 2000), традиционный метод измерения ферментативной активности которых основывается на регистрации восстанавливающих концов олигосахаридов, образующихся в процессе гидролиза полимера. Данный метод имеет недостаточную чувствительность для детальных исследований ферментов, и использование таких полимерных субстратов препятствует изучению трансгликозилирующеи активности гликаназ в связи со сложностью различия продуктов гидролиза и продуктов трансгликозилирования. Метод ферментативного синтеза различных гликоконьюгатов имеет неоспоримые преимущества в сравнении с органическим, который является гораздо более дорогостоящим, трудоемким и экологически вредным. На сегодняшний день описано более сотни различных экзо-гликозидаз, выделенных из широкого круга микроорганизмов и успешно применяемых в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ. Получение данных о взаимосвязи строения активного центра ферментов и их способности к проведению трансгликозилирующеи реакции, несомненно, важно, так как не только дает возможность эффективно использовать трансгликозидазы в ферментативном синтезе, но и позволяет получить новую информацию о механизме действия гликозидгидролаз в целом. В данной работе подробно изучены физико-химические свойства, кинетические параметры реакции гидролиза и трансгликозилирующая активность фермента (3-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori, описан ферментативный синтез лара-нитрофенил ксилоолигосахаридов со степенью полимеризации 2-7 и метилумбеллиферил-ксилоолигосахаридов со степенью полимеризации 3-5 и возможность использования данных соединений в качестве субстратов для исследования ферментативных свойств экзо- и эндо- гликозидгидролаз, способных гидролизовать ксилоолигосахариды.
Актуальность проблемы
Углеводы играют существенную роль в мириадах биологических процессов. Огромное количество различных олигосахаридных структур, обнаруженных в природе, происходит из рациональной организации ферментативного образования и разрыва гликозидных связей. Гликозидная связь является одной из наиболее прочных связей, существующих в природе. Период ее естественного распада составляет более 5 миллионов лет. Гликозидгидролазы - ферменты, способные ускорить гидролиз гликозидной связи более чем в 1017 раз, являются одними из наиболее эффективных из существующих катализаторов. Поэтому интерес к реакциям ферментативного гидролиза природных полимеров обусловлен не только фундаментальными, но и прикладными задачами.
Ксилан - основной структурный полисахарид клеток растений, зторой по распространенности после целлюлозы полисахарид в природе. Ксилан представляет собой полимер, состоящий, в основном, из цепей P-D-ксилопиранозных остатков, соединенных 1-4-гликозидными связями Основными компонентами ксиланолитической системы, определяющими скорость гидролиза ксилана, являются два типа ферментов: эндо-ксиланазы (1,4-Р-0-ксиланогидролазы К.Ф. 3.2.1.8.), гидролизующие ксилан до коротких ксилоолигосахаридов, и Р-ксилозидазы (1,4-Р-0-ксилогидролазы К.Ф. 3.2.1.37), расщепляющие короткие ксилоолигосахариды до ксилозы и являющиеся ключевыми ферментами полной деградации ксилана (Collinset al., 2005). Огромный интерес к изучению системы ферментов, участвующих в метаболизме этого полимера, связан с их широким применением в биотехнологии. Эти ферменты используют в целлюлозно-бумажной, текстильной и пищевой промышленности (Beg et al., 2001). Интенсивное использование эндо-ксиланаз и Р-ксилозидаз в промышленном производстве постоянно стимулирует два основных направления исследований - поиск новых источников ферментов и подробное изучение их ферментативных свойств, дающее возможность более эффективно использовать данные ферменты в биотехнологических процессах.
Второе направление возможного использования гликозидгидролаз в биотехнологии основывается на том факте, что многие представители этого класса ферментов обладают не только гидролитической, но и трансгликозилирующей - синтазной активностью, и способны осуществлять ферментативный синтез различных гликоконьюгатов. Одним из примеров применения трансгликозилирующей активности гликозидгидролаз является ферментативный синтез олигосахаридов, содержащих хромофорные или флуоресцентные группы (Zeng et al., 2000; Mala et al., 1999). Гликозидгидролазы являются эффективным инструментом в синтезе подобных олигосахаридов благодаря их высокой селективности и стереоспецифичности. Такого рода субстраты используются для исследований широкого круга гликаназ (Honda et al., 2000), традиционный метод измерения ферментативной активности которых основывается на регистрации восстанавливающих концов олигосахаридов, образующихся в процессе гидролиза полимера. Данный метод имеет недостаточную чувствительность для детальных исследований ферментов, и использование таких полимерных субстратов препятствует изучению трансгликозилирующеи активности гликаназ в связи со сложностью различия продуктов гидролиза и продуктов трансгликозилирования. Метод ферментативного синтеза различных гликоконьюгатов имеет неоспоримые преимущества в сравнении с органическим, который является гораздо более дорогостоящим, трудоемким и экологически вредным. На сегодняшний день описано более сотни различных экзо-гликозидаз, выделенных из широкого круга микроорганизмов и успешно применяемых в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ. Получение данных о взаимосвязи строения активного центра ферментов и их способности к проведению трансгликозилирующеи реакции, несомненно, важно, так как не только дает возможность эффективно использовать трансгликозидазы в ферментативном синтезе, но и позволяет получить новую информацию о механизме действия гликозидгидролаз в целом. В данной работе подробно изучены физико-химические свойства, кинетические параметры реакции гидролиза и трансгликозилирующая активность фермента (3-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori, описан ферментативный синтез лара-нитрофенил ксилоолигосахаридов со степенью полимеризации 2-7 и метилумбеллиферил-ксилоолигосахаридов со степенью полимеризации 3-5 и возможность использования данных соединений в качестве субстратов для исследования ферментативных свойств экзо- и эндо- гликозидгидролаз, способных гидролизовать ксилоолигосахариды.
Гликозидгидролазы, механизм действия
Гликозидгидролазы (0-гликозидгидролазы, К.Ф. 3.2.1.) - катаболические ферменты углеводного обмена, катализирующие гидролитическое расщепление 9-гликозидной связи. Формально гидролиз может быть представлен как нуклеофильное замещение при аномерном центре гликоновой (неотщепляемой) части субстрата, протекающее с сохранением или обращением конфигурации, при этом стереохимия гидролиза является характерной особенностью данного фермента (рис.1). Рисунок 1. Гидролиз гликозидной связи, катализируемый гликозидгидролазами: 1) с сохранением конфигурации при аномерном центре гликоновой части субстрата; 2) с обращением конфигурации. Гликозидгидролазы, как правило, высоко специфичны к конфигурации расщепляемой гликозидной связи и к размеру и типу моносахаридного остатка и обнаруживают большую широту специфичности в отношении структуры агликона (отщепляемой части субстрата). Эти свойства легли в основу традиционной номенклатуры гликозидгидролаз, отражающей особенности строения специфических субстратов и характер действия на них ферментов (Enzyme Nomenclature, изд. 1992). Согласно данной номенклатуре, различают три типа гликозидгидролаз: гликозидазы, эндо-гликаназы и экзо-гликаназы (рис.2):
Гликозидазы катализируют отщепление концевого остатка моносахарида от гликозидов, олигосахаридов, гликопептидов и гликопротеинов (Р-глюкозидаза, Р-галактозидаза, P-N-ацетилглюкозаминидаза, а-глкжозидаза и ДР-). Эндо-гликаназы катализируют реакцию гидролиза гликозидной связи в гомо- или гетерополисахаридах, которая удалена от начального и концевого остатков полимера (лизоцим, а-амилаза, эндо-ламинариназа, гиалуронидаза и др.). Экзо-гликаназы катализируют отщепление концевых остатков моно или олигосахарида от гомополисахаридов (целлобиогидролаза, Р-амилаза и ДР-) Рисунок 2. Схема реакции гидролиза, катализируемого гликозидгидролазами согласно Enzyme Nomenclature:!) гликозидазы; 2) эндо-гликаназы; 3) экзо гликаназы. і) #-Ю Ф-О-Ю Ф-Ю-Ю 2) - о-к х -к - -ю- - з) О » ОЧН Многочисленные кристаллографические исследования структуры ферментов и фермент-субстратных комплексов, имеющиеся на данный момент, подтвердили появившуюся в 70-е годы концепцию Тома и Хироми о многосайтной структуре активных центров карбогидраз (Hiromi, 1970; Hiromi et al., 1973). Основой этой концепции является предположение, что активный центр ферментов, действующих на полимерные субстраты, можно рассматривать как состоящий из сайтов или участков, каждый из которых связывает мономерный остаток полимера.
Согласно номенклатуре Дэвиса, (Davies et al., 1997), отражающей совокупность известных к настоящему времени субсайтных структур гликозидгидролаз, эндо-гликаназы имеют в активном центре несколько сайтов связывания как с невосстанавливающего так и с восстанавливающего конца субстрата, соответственно -п, +п; гликозидазы содержат только два сайта связывания, -1 и +1; и экзо-гликаназы обладают структурой -1 или -2, +п. Катализ происходит между сайтами -1 и +1 (рис.З). Число сайтов, энергия связывания каждого сайта и константы скорости гидролиза могут быть рассчитаны из экспериментальны): данных (Allen, 1980). В начале 1990-х была создана классификация, которая отражает структурные особенности и эволюционные взаимоотношения гликозидгидролаз. Она основана на гомологии известных аминокислотных последовательностей ферментов (Coutinho and Henrissat, 1999; http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/). Согласно этой классификации, гликозидгидролазы, содержащие в своей структуре не менее 100 одинаковых аминокислотных остатков, были сгруппированы в 97 семейств., причем представители одного и того же семейства обнаруживают одинаковую стереохимию гидролиза гликозидной связи. Общепринятый механизм действия так называемых "сохраняющих" гликозидаз - механизм двойного замещения SN2 (Koshland, 1953; McCarter and Withers, 1994) - предполагает последовательное осуществление двух нуклеофильных атак и включает две стадии (рис.4):
Методы измерения ферментативной активности
Р-Ксилозидазную активность всех ферментных препаратов измеряли спектрофотометрическим методом на длине волны 400 нм с использованием и-НФК в качестве субстрата. Реакцию проводили при 37С в 50 мМ натрий-ацетатном буфере рН 4.0 в объеме 50 мкл и останавливали добавлением 2 мл 10% раствора ЫагСОз. Одну единицу активности фермента определяли как активность, необходимую для получения 1 мкМ л-НФ за одну минуту при данных условиях. Другие нитрофенольные производные Сахаров тестировали в качестве субстратов аналогичным образом.
Р-Ксиланазную активность ферментных препаратов определяли по методу Сомоджи-Нельсона (Somogyi, 1952) с использованием ксилана в качестве субстрата. Одну единицу ферментативной активности определяли как образование 1 мкМ редуцирующего сахара в следующих условиях: реакцию проводили в растворе 50 мМ натрий-ацетатного буфера рН 4.0 с концентрацией ксилана 5 мг/мл при температуре 37 С. . Выделение Р-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori Штамм Aspergillus awamori, использованный в работе, был предоставлен Ч коллекцией Петербургского института ядерной физики. Культивацию мицелиального гриба Aspergillus awamori, выделение и очистку (3 ксилозидазы из Aspergillus awamori проводили согласно процедуре, описанной нами для Р-ксилозидазы из Trichoderma reesei (Golubev et al., 2000), модифицированной добавлением двух хроматографических стадий очистки - фенилинтеракции и гель-фильтрации. Культуру растили в объеме 20 л при температуре 30 С с аэрацией в течение 96 часов на среде, содержащей г/л: КН2Р04, 1; NaNC ; MgS04, 0,5; пептон 5; пшеничные отруби, 10; глюкоза, 5; дрожжевой экстракт, 2,5. Для т отделения мицелия культуральную жидкость центрифугировали 3000 об/мин в течение 40 минут, супернатант концентрировали в 30 раз, обессоливали и переводили в 20 мМ трис-HCl буфер рН 7.5 (буфер А) на полых волокнах (Кириши Россия). Грубый препарат Р-ксилозидазы наносили на колонку DEAE Toyopearl (20x500 мм), уравновешенную буфером А, и элюировали « российская государственна раствором ЇМ NaCl в этом же буфере. Элюат обессаливали диализом против буфера А и наносили на колонку TSK DEAE-5PW (21.5 х 150 мм) (Pharmacia-LKB), уравновешенную буфером А. Элюирование осуществляли линейным градиентом (0-0.5 М) раствора NaCl в буфере А.
Фракции, содержащие Р-ксилозидазную активность, концентрировали на мембране Amikon РМ-30 до объема 5 мл, диализовали против 20 мМ натрий-ацетатного буфера рН 4.0 (буфер В) и наносили на колонку TSK SP 5PW (21.5 х 150 мм) (Pharmacia-LKB), уравновешенную буфером В. Элюирование осуществляли линейным градиентом (0-0,5 М) раствора NaCl в буфере В. Фракции, содержащие Р-ксилозидазную активность, наносили в растворе 1.7 М (NH4)2S04 в буфере В на колонку Phenyl-Superose HR (5 х 50 мм) (Pharmacia Biotech), уравновешенную раствором (NH4)2S04 той же концентрацией в буфере В. Хроматографию проводили с использованием линейного градиента (1.7-0 М) раствора (NH4)2S04 в буфере В. Заключительной стадией очистки Р-ксилозидазы являлась гель-фильтрация на колонке Sephacryl S-200 (35 х 700 мм) (Pharmacia), уравновешенной раствором 0.1 М NaCl в буфере В. Раствор Р-ксилозидазы обессаливали диализом против дистиллированной воды и лиофильно высушивали. 3.4. Выделение Р-ксиланазы из мицелиального гриба Trichodermareesei (семейство 11)
Грубый препарат Р-ксиланазы был любезно предоставлен доктором Андреем Мясниковым (Danisko-Cultor Оу, Финляндия). Ксиланазную активность отделяли от ксилозидазной гель-фильтрацией на колонке Sephacryl S-200 (35 х 700 мм) (Pharmacia), уравновешенной раствором 20 мМ натрий-ацетатного буфера рН 4.0, содержащего 0.1 М NaCl. Очищенный раствор фермента обессаливали диализом против дистиллированной воды и лиофильно высушивали.
Выделение и физико-химические свойства Р-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori
Секретируемая P-D-ксилозидаза была выделена из культуральной жидкости мицелиального гриба Aspergillus awamori и очищена со степенью очистки 4000 до гомогенного состояния с использованием пяти хроматографических стадий (табл. 3) Очищенный фермент имел удельную активность 4.2±0.1 ед/мг и содержал менее 0,1% примесных экзо-гликозидазных активностей. Фермент выдерживал лиофилизацию и хранение при 4С без потери активности в течение года.
Анализ очищенного фермента в денатурирующих условиях с использованием электрофореза в полиакриламидном геле (Laemmli, 1970) показал, что фермент мигрирует в виде единичной зоны с молекулярной массой 125±1 кДа (рис.8). Молекулярная масса нативного фермента, оцененная при помощи гель-фильтрации, составила 250±5 кДа. Сравнение результатов определения молекулярных масс фермента, полученных в денатурирующих и неденатурирующих условиях, позволяет сделать вывод, что фермент состоит из двух одинаковых субъединиц. Электрофоретическая зона чистой Р-ксилозидазы имеет размытые границы, что типично для большинства гликопротеинов. Таблица 3. Стадии выделения Р-ксилозидазы.
Стадия очистки Объем,мл Общеекол-вобелка, мг Общая активность, ед. Удельная активность, ед/мг Степень очистки Выход % ДСН-электрофорез р-ксилозидазы из Aspergillus awamori Слева: очищенная р-ксилозидаза Aspergillus awamori; справа: белковые маркеры - миозин (205 кДА), Р-галактозидаза из Escherichia coli (116 кДа), фосфорилаза b из кролика (94 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа). Да При изучении физико-химических свойств р-ксилозидазы было установлено, что фермент обладает наибольшей активностью в диапазоне рН 3.5 - 4.5 (рис. 9), что характерно для большинства грибных Р-ксилозидаз (табл. 1). Фермент демонстрирует большую стабильность при кислых рН, чем при щелочных. Р-Ксилозидаза сохраняет более чем 80% активности при инкубации в течение часа при температуре 60С. При исследовании зависимости ферментативной активности Р-ксилозидазы от присутствия двухвалентных ионов металлов Са2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+ и ЭДТА, было показано, что данные соединения не оказывают влияния на активность фермента. Рис. 9. рН- и температурный оптимумы реакции гидролиза, катализируемой Р-ксилозидазой из Aspergillus awamori. з ТемператураС 4.2. Исследование первичной структуры Р-ксилозидазы Определение аминокислотной последовательности пептидов (5-ксилозидазы, полученных обработкой фермента бромцианом, было выполнено в лаборатории химии белков (Институт биотехнологии, Финляндия). По результатам сравнительного анализа аминокислотных последовательностей полученных пептидов, осуществленного с помощью программы CLUSTAL W (Thompson et al. 1994) была установлена высокая степень гомологии аминокислотной последовательности Р-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori с Р-ксилозидазами семейства 3 гликозидгидролаз (рис. 10). Наиболее высокую степень гомологии - более 80% - фермент демонстрирует по отношению к двум Р-ксилозидазам из Aspergillus Niger. Мицелиальные грибы Aspergillus Niger являются природными источниками мутантного вида Aspergillus awamori, выведенного в лабораторных условиях.
К настоящему времени нет ни одной трехмерной сіруктурьі представителей Р-ксилозидаз из семейства 3 гликозидгидролаз, однако совсем недавно нами была опубликована структура низкого разрешения р-ксилозидазы из мицелиального гриба Trichoderma reesei (семейство 3), полученная методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Данные позволили выявить трехдоменную структуру фермента и общий вид полипептидной цепи. Главный домен представляет из себя типичный (а/3)8 барель, два других домена, по-видимому, представляют собой р-структуры. (Rojas et al., 2005).
Рксі - р-ксилозидаза из Aspergillus awamori; KCAN p- ксилозидаза из Asp. Niger, № CAB06417.1.; PKCAN - Р-ксилозидаза из Asp. Niger, № AAD13106.1.; pKcEN - Р-ксилозидаза из Emericella nidulans, № САА73902 .1.; рксА - Р-ксилозидаза из Aspergillus oryzae, № BAA28267.1.; РксАО - Р-1,4-ксилозидаза из Aspergillus oryzae, № BAA24107.1.; PKCHJ - р-ксилозидаза из Нуросгеа jecorina, № CAA93248.1.; РксТЕ - р-ксилозидаза из Talaromyces emerisoni, № AAL32053.2. 4.3. Определение констант ионизации каталитических групп 0 ксилозидазы
Профиль рН-зависимости фермента, построенный в координатах ккат/Км может дать существенную информацию об ионизации каталитических групп в его активном центре. Профиль рН-зависимости Р-ксилозидазы (рис.11), имеет вид типичной колоколообразной кривой, полученной для многих других представителей гликозидгидролаз (Bravman et al., 2003), (Vocadlo et al., 2002). Рисунок 11. рН-зависимость кинетических параметров гидролиза п-НФК, катализируемого (3-ксилозидазой из Aspergillus awamori 30 ш и 10 Вид кривой предполагает, что ферментативный катализ зависит от ионизации двух аминокислотных остатков. Обязательным условием первой стадии гидролиза, стадии гликозилирования, является протонирование группы, осуществляющей кислотно-основной катализ, и депротонирование нуклеофильной группы. Кислая область кривой определяет протонирование нуклеофила, а щелочная - депротонирование кислотно-основного катализатора (Becker et al., 2001). Значения p/fa ионизации групп свободного фермента, определенные из формы кривой ккат /Км, имеют значения рН 2.2 и 6.4 соответственно. Для 3 семейства гликозидгидролаз в качестве каталитических аминокислотных остатков определены Asp и Glu, которые играют, соответственно, роль нуклеофильной группировки и кислотно-основного катализатора (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/).
