Содержание к диссертации
Стр.
ОГЛАВЛЕНИЕ 3
СТШСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
1. ВВЕДЕНИЕ 7
1Л. Актуальность проблемы 7
Цели и задачи исследования 9
Основные положения, выносимые на защиту 9
Научная новизна полученных результатов 11
Теоретическое и практическое значение работы. 11
Апробация работы 12
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ІЗ
2,1- Фруктаны. 13
Природные источники, функции и строение фруктанов. 13
Инулин - распространение в природе, строение, свойства, 15 биологическая роль и применение.
Микробные инулиназы. 17
Современные представления о классификации 19 гликозидгидролаз.
Каталитические механизмы действия гликозидгидролаз. 23
Построение субсайтной модели активного центра экзо- 27 действующих гликозидгидролаз.
Микробные экзо-инулиназы: исследования механизма реакции 28
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3 1
Условия роста культуры и выделение экзо-инулиназы. 31
Субстраты. 32
Общие методы. 35
Анализ N-концсвой и внутренних фрагментов аминокислотной 36 последовательности.
Измерение активности экзо-инулиназы. 37
Методы анализа каталитических свойств инулиназы. 38
Методы анализа кинетических параметров реакций гидролиза 39 экзо-инулиназой.
Методы определения аффишюстей субсайтов активного центра 40 фермента.
3.9- Определение констант ингибирования фруктоол иго сахаридами 41
реакции гидролиза сахарозы.
ЗЛО- Методы исследования траисгликозилирующей активности экзо- 42
инулиназы.
ЗЛ 1. Н-ЯМР-спектроскопия продуктов гидролиза инулина. 42
ЗЛ2, Выделение нуклеиновых кислоти клонирование инулиназного 44
гена и кДНК методом ПЦР.
ЗЛ2Л. Выделение РНК из Л. awamori 44
3.12.2. Выделение ДНК A. awamori 45
3.123- Получение кДНК гена A. awamori 45
ЗЛ2.4. ПЦР 46
3.12.5. Обратная ПЦР 46
ЗЛЗ. Кристаллизация белка и сбор рентгеноструктурных данных 47
4. РЕЗУЛЬТАТЫ 51
4Л. Выделение и физико-химические характеристики экзо- 51
инулиназы.
Характер действия экзо-инулиназы. 55
Кинетические параметры гидролиза различных субстратов экзо- 57 ипулипазой.
Определение констант ингибирования реакции гидролиза 61 сахарозы фру ктоол иго сахаридами_
Исследование траисгликозилирующей активности экзо- 63 инулиназы.
Анализ гена и кДНК экзо-инулиназьь 64
Исследование углеводного компонента экзо-инулиназы и с влияние па кристаллизацию.
Построение исходной модели и уточнение трехмерной структуры экзо-инулиназы
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список опубликованных по теме работ 9- СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
СП,
К.Ф.
н.о.
^1 ПІТ
LsdA ppm ТФУ Ед.
вэжх
EndoH
ЭДТЛ ПХМБ
Фруктоолигосахариды
Степень полимеризации
Комиссия по ферментам
не определено
Константа Михаэлиса
Константа скорости, каталитическая
Константа истинной скорости гидролиза гликозвднои связи
Левапсахараза из Acetobacter diazotrophicus
млн"1
Трифторуксусная кислота
Единицы
Тонкослойная хроматография
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Додецил сульфат натрия
Эндо-Р-И-ацетилглюкозаминидаза Н
па/?я-Нитрофенил
Константа ингибирования
Полимеразная цепная реакция
Полиэтиленгликоль
Этил енднам интетрауксусная кислота
пара-Хлормеркури и бензоат
Введение к работе
l.h Актуальность проблемы.
Одним из наиболее перспективных направлений развития
биотехнологии является использование биологических катализаторов
химических реакций - ферментов. Это направление предполагает
применение как очищенных природных ферментов, так и их
рскомбинантных аналогов, свойства которых в настоящее время могут
быть модифицированы в нужном направлении при помощи
генноинженерных подходов. В современной промышленности
используются различные ферменты, в том числе гидролазы,
обеспечивающие реакции расщепления различных субстратов до
мономерой. Среди гидролаз гликоз ид гидролазы (гликозидазы, К.Ф, 3,2,1.-)
являются одной из самых широко применяемых и изучаемых групп
ферментов. Эти ферменты катализируют расщепление гликозидных
связей между двумя сахаридными остатками или углеводным и
агликоновым компонентами. Одной из причин пристального внимания к
этой группе ферментов является то, что гликозидазы оказались
чрезвычайно эффективным инструментом энзиматического синтеза
многих биологически значимых гликозидов, олигосахаридов и
гликоконьюгатов. Такое их применение основано на том факте, что
некоторые гидролазы способны обращать при определенных условиях
реакции гидролиза в направлении формирования новых гликозидных
связей. На сегодняшний день описано более сотни различных экзо-
гликозидаз (действующих на концевые углеводные остатки олиго- и полисахаридов), выделенных из широкого круга организмов и успешно примененных в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ. Ферментативный синтез имеет значительные преимущества перед традиционными методами органического синтеза, так как позволяет получать необходимые соединения практически в одну стадию и без проведения реакций блокирования и деблокирования реакционно-способных групп. Кроме того, при использовании реакций ферментативного синтеза удается получать строго определенные стереоизомеры с высоким выходом продуктов. Поэтому получение данных о взаимосвязи строения активных центров этих ферментов и их способности к проведению трансгликозилирующей реакции, несомненно, важно, тле не только дает возможность эффективно использовать траенгликозидазы в энзиматическом синтезе, но и позволяет получить новую информацию о механизме действия карбогидраз в целом. Эффективное применение гликозидаз требует тщательного изучения их свойств и как белков, и как ферментов, а также знаний первичной структуры и строения соответствующих генов. Полная совокупность фундаментальных знаний о каждом конкретном ферменте позволяет целенаправленно изменять его структуру и свойства в соответствие с производственными задачами. Среди гликозидаз выделяется группа микробных инулипаз, которые являются важными промышленными
ферментами. Среди многочисленных известных источников-
микроорганизмов наибольшее предпочтение в настоящее время отдается мицелиальным грибам рода Aspergillus^ РетсШіит и дрожжам Khiyveromyces, Но несмотря на то, что микробные ипулииазы довольно подробно охарактеризованы, до сих пор не была установлена трехмерная структура этих ферментов и субсайтная организация их активных центров. До настоящего времени не была описаны реакции обращения гидролиза (трансгликозилирования) инулиназами, выделяемыми из грибных источников. В данной работе мы подробно охарактеризовали ферментативные свойства экзо-инудиназы из Aspergillus awamori вар. 2250, показали и установили взаимосвязь между ее структурными особенностями и каталитическими свойствами,
1-2. Цели и задачи исследования.
Цель настоящей работы состояла в исследовании взаимосвязи между структурной организацией и каталитическими свойствами экзо-ипулиназы Aspergillus awamori вар. 2250.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Выделить и очистить до гомогенности ипулиназу из мицелиального гриба Aspergillus awamori вар. 2250,
Изучить физико-химические свойства очищенного фермента.
Исследовать ферментативные активность и субстратную специфичность экзо-инулиназы, а также оценить возможность обращения гидролитической реакции.
На основании анализа ферментативной кинетики построить модель субсайтной организации активного центра.
Выявить аминокислотные остатки, обеспечивающие катализ.
Сопоставить результаты исследования ферментативной активности и данные по структурной организации фермента.
L3. Основные положения, выносимые на защиту.
L Инулиназа из Aspergillus awamori вар. 2250 является ферментом экзо-
действия.
2. Экзо-инулиназа Aspergillus awamori - представитель 32 семейства
глнкозидгидролаз.
3- Активный центр фермента включает не менее пяти субсайтов
связывания с субстратом.
4, Экзо-инулиназа - гликопротеин с пятью сайтами N-гликозилирования.
5. Молекула белка представляет собой двух-доменную структуру. Asp 41
и Glu 241 - аминокислотные остатки, участвующие в акте катализа по
механизму двойного замещения.
1.4. Научная новизна полученных результатов.
В настоящей работе впервые показано, что ипулиназа Aspergillus
awamori является экзо-действующим ферментом, сохраняющим
аномерную конфигурацию субстрата и способным расщеплять как инулин
и инулоолигосахариды (р-2,1-фруктаны), так и леван и
лсваноолигосахариды (р-2,6-фруктаны). В исследованных
экспериментальных условиях инулиназа не обладает
трансгликозилирующей активностью. На основе кинетического анализа гидролиза ннулоолигосахаридов различной длины впервые установлено наличие пяти субсайтов связывания с субстратом. По данным рентгеноструктурного анализа молекула белка состоит из двух доменов: N-концевот каталитического домена, который имеет укладку пяти-лопастного р-пропеллера, и С-концевого домена со структурой <ф-сэидвич». Рентгеновские данные о структуре комплекса фермента с фруктозой дали возможность локализовать положение каталитически важных аминокислотных остатков. Впервые для инулиназ из грибных источников были идентифицированы сайты гликозилирования и показана их значимость для кристаллизации белка.
L5-Теоретическое и практическое значение работы.
Полученные данные вносят существенный вклад в понимание
механизма действия представителей 32 семейства гликозидгидролаз.
Выяснение структурно-функциональных взаимосвязей для экзо-
инулиназы имеет большое значение для дальнейшей структурной модификации с целыо получения рекомбинантных ферментов с заданными каталитическими свойствами. Предполагается использование природной инулиназы и рекомбинантных аналогов для произиодства фруктозы и коротких фруктанов! имеющих важное значение в качестве пищевых добавок.
1.6. Апробация работы,
. - Материалы работы представлены на 2-ом нсмецко-польско-российском Симпозиуме по бактериальным карбогидратам (Москва, сентябрь 10-12, 2002) и на V Иберо-Американском Конгрессе по Биофизике и XXVIII Конгрессе Бразильского биофизического общества (Рио-дс-Жапеиро, Бразилия, 15 октября 2003 г.). По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы (статьи).
2.0БЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2,1, Фруктаны. 2.1.1. Природные источники, функции и строение фруктанов.
Фруктаны представляют собой полимеры, состоящие из молекулы
сахарозы, удлиненной цепочкой фруктозных единиц, соединенных (3-2,1 -
либо р-2,6-связями (Waterhous ct al, 1991; Pollock et aL, 1991). В
зависимости от типа связи они называются соответственно инулин и лепан
(рис. 1). Более 36 тысяч видов растений на Земле (или около одной трети
всей земной флоры) содержат углеводы этого типа. Фруктаны, подобно
крахмалу, служат запасными источниками энергии во многих травах и
зерновых культурах (Pollock and Cairns, 1991; Hendry, 1993) и активно
синтезируются в процессе клеточного роста (Allard and Nelson, 1991;
Caims et al., 1999)- Кроме того, в последнее время появилось немало
исследований, свидетельствующих о роли фруктанов и защите растений
от сезонных стрессов, таких как засуха и воздействие низких температур
(Vcrgauwen et al., 2000; Orthen and Wehrmeyer, 2004; Albreht et ah, 2004), a
также их функции в качестве осморегуляторон (Hincha et a!., 2002).
Фруктаны более растворимы в воде (Wiemken, 1986) и обладают
специфическим защитным действием на мембраны растений в отличие от
других полимеров, таких как декстран и крахмал (Crow, et aL, 1997;
Hincha et al., 2002). Вследствие своей плохой абсорбции в кишечном
тракте они не утилизируются макроорганизмом и соответственно
являются низкокалорийными пищевыми добавками.
Фруктоолигосахариды широко изучаются и используются в качестве пребиотиков, поскольку эти углеводы способны, как выяснилось, избирательно усиливать пролиферацию кишечных пробиотиков, в особенности бифидобактсрий (Grizard and Barthomeuf, І 999).
Рис. 1. Структуры р-2,6-фруктана(левана), А, р-2Д-фруктана (инулина), Б,
СН-нОН
CHzOH
CHjOH
2Л.2. Инулин — распространение в природе, строение, свойства, биологическая роль и применение.
Инулин является запасным углеводом для многих растений и найден во
многих видах, таких как стебли артишока Helianthus tuberosm (Edclman and
Jefford, 1964) и данделиона Taraxacum officinale (Rutherford and Deacon,
1972), в корнях цикория Ciclwrium intybus (Roberfroid, 2000), луковицах
чеснока и лука (Banmgartner et ah, 2000). Инулин и аналоги инулина - это полифруктаны с разной степенью полимеризации, состоящие из линейных (Ї-2,1-связанных поли фруктоз пых цепей с присоединенной глюкозой па нередуцирующем конце. Самая маленькая молекула фруктанов ипулинового типа - 1-кестоза (рис.2А). Хотя встречаются инулииы, в которых полифруктозная компонента присоединена не только к фруктозпому остатку сахарозы, но и к глюкозе. Это - так называемые нео-инулины (Fru),r(Cilc-FruHFru)m,(PHc.2B).
Рис, 2. Структуры 1-ксстозы, А, неокестозы, Б,
о-^-сн I ^ о
онэ . Ч нэ
ovch ,
н он *н нэ
1-Кесгоза Haowscrma
В среднем, инулиновая цепочка состоит из 30 фруктозных остатков, хотя ее
длина может варьировать в зависимости от источника этого полифруктана,
его локализации в растении и сезонных изменений (Vandamme and Derycke,
1983; Pavis et al., 2001; Yang et ah, 2004). В зависимости от степени
полимеризации и нули по по и цепи молекулярная масса фруктапа находится и
диапазоне от 3500 до 5500. Инулин плохо растворим в холодной воде, его
можно осадить в этапольно-водных растворах, химически он гидролизустся
только в кислой среде и при высоких температурах (70 - 80С). Поэтому использование микробных и растительных эндо- и экзо-ииулиназ, способных гидролизовать инулин до фруктозы или других олигосахаридов в значительно более мягких реакционных условиях, представляет собой значительно более эффективный подход для производства коротких фруктанов и фруктозных сиропов.
Инулин является натуральной низкокалорийной пищевой добавкой в ежедневном рационе человека. Это обусловлено, прежде всего, его плохой усвояемостью в организме человека из-за отсутствия гидролизующих его ферментов- В качестпе пищевой добавки инулин обычно используется для создания здорового бактериального баланса в нижнем отделе пищеварительного тракта (Menne et aL, 2000; Krusse et al., 1999; Grizard and Barthomeuf, 1999). Кроме того, описаны его антиканцерогенные свойства (Taper and Roberfroid, 1999; 2000) и его влияние на липидный метаболизм человека, в частности, способность снижать уровень холестерина и триглицеридов и крови, увеличивать отношение липопротеинов высокой и низкой плотности, ингибировать биосинтез жирных кислот (Davidson and Maki, 1999; Delzenne and Kok, 2001).
2.2* Инулиназы.
Инулиназы (фрукто-фуранозидгидролазы) - это ферменты, выделенные
из многих растительных тканей, а также бактериальных и грибных
источников, и способные расщеплять фруктоз-содержащие олигосахариды и
полимеры (фруктаны) до практически чистой фруктозы. По своему действию
инулиназы разделяются на два типа: а), экзо-инулиназы (P-D-фруктан-
фруктогидролазы, К.Ф. 3.2.1,80), катапизирующие отщепление концевых
молекул фруктозы от сахарозы, раффинозы и инулина; б), эндо-ииулипазы
(2, l-p-D-фруктан-фруктано гидролазы, К.Ф. 3.2.1,7), катализирующие
гидролиз внутренних р-2,1-фруктофуранозидных связей, образуя
инулотриозу, инулотстраозу и инулопентаозу в качестве основных
продуктов- Инвертазы (Р-фруктофуранозидазы, К.Ф. 3.2.1.26), также
способны разрывать гликозидную связь между глюкозой и фруктозой в
молекуле сахарозы, но отличаются от инулииаз практически полным
отсутствием аффинности к инулину.
Еще в начале прошлого века было обнаружено, что дрожжи
Saccharomyces marxianus, а также несколько других, тогда еще не
идентифицированных микроорганизмов, способны утилизировать инулин.
Позже было выделено и охарактеризовано немало микробных инулин аз
(Vandamme and Dercyckc, 1983). В последнее десятилетие внимание
исследователей привлекли диплоидные дрожжи вида Kluyeverimyces (Laloux
et al., 1991; Szambelan et al., 2004), а также мицелнальные грибы Aspergillus
ftcuum (EUalibi and Baratli, 1990; Uhm et al., 1998, 1999), Aspergillus niger
(Zhang et a!., 2004), Aspergillus awamori (Arand et al., 2002; Kulminskaya et al.,
2003), виды Penicillum (Onodera et al., 1992) и других. Бактериальные
инулиназы также не были оставлены без внимания и интенешшо изучаются:
Bacillus polymyxa (Kwon et ah, 2003), Geobacillus stearothermophilis (Tsujimoto
et aL, 2003), Bifidobacterium infantis (Warchol et aL, 2002), Streptococcus mutans
(Burne et aL 1992), S. salivarius (Takahashi et aL, 1985) и другие.
Микробные инулиназы весьма устойчивы к высоким температурам,
увеличивающим растворимость субстрата, и исключающим (или
существенно снижающим) микробное загрязнение при биотехнологических
процессах (Tsujimoto et aL, 2003). Грибные инулиназы часто представляют
собой смесь внутриклеточных и секреторных фруктангидролаз с высокой
активностью и стабильностью (Pandcy et al., 1999). Источником углерода и
индуктором роста для их продуцентов служат дешевые ипулин-содержащие
растительные материалы, например, корни цикория или пшеничные отруби.
Для их роста, как правило, используют метод глубинного культивирования,
но в настоящее время разрабатываются и успешно используются
поверхностные условия культивирования. В частности, для получения экзо-
инулиназы из Aspergillus awamori нами был использован именно этот метод
(Arandetal., 2002).
Микробные инулиназы действуют в довольно широком диапазоне рН и
температур. Например, рН-оптимум для экзо-инулиназы из Bifidobacterium
infantis АТСС 15697 составляет б.0? а оптимальная температура - 37С
(Warchol et aL, 2002), для инулиназы из PefiicHUum sp, TN-88 - 4.0 и 55DC
соответственно (Moriyama et aL, 2002); для многих экзо-инулиназ из видов
Streptococcus рН-оптимум находится в диапазоне от 4.5 до 7.5, а
температурный оптимум - от 20 до 60С (Igarashi et aL, 1992; Burne and
Pcnders, 1992). Недавно была описана высоко термостабильная экзо-
инулиназа, выделенная из Geobacillus stearothermophilis (Bacillus steamthermophilis) KP1289. Данный термофил может расти при температурах от 41 до 69С, а полученная инулиназа активна при 30 - 75СС с оптимумом при 60С (Tsujimoto et аЦ 2003).
2.3. Современные представления о классификации гликозидгидролаз.
Традиционная номенклатура гликозидгидролаз (ШВ-МВ Enzyme
nomenclature, изд. 1992) основана на их субстратной специфичности и
отчасти на молекулярном механизме их действия. Такая классификация не
отражает структурных особенностей и эволюционных взаимоотношений этих
ферментов, В начале 1990-х была создана новая классификация на основе
сравнения известных к этому моменту 300 аминокислотных
последовательностей. Первоначально гликозидазы были разделены на 36
семейств (Hcnrissat, 1991). В дальнейшем определение новых
аминокислотных последовательностей гликозидаз привело к открытию
новых семейств, В настоящее время известны несколько тысяч
последовательностей карбогидраз и родственных ферментов
(трансгликозидаз и т.д.), которые сгруппированы в 97 семейств (Countinho
and Henrissat, 2000). Каждое из семейств включает белки, у которых по всей
структуре обнаружены фрагменты аминокислотных последовательностей,
состоящие из не менее 100 одинаковых остатков. Таким образом, базовым
принципом, лежащим в основе этой классификации, является гомология
белковых последовательностей. Кроме того, все представители одного и того
же семейства, как было обнаружено, демонстрируют одинаковый стереохимический результат гидролиза гликозидной связи: с обращением или сохранением аномерной конфигурации углеродного атома субстрата в месте разрыва гликозидной связи.
Согласно этой классификации, ииулиназы относятся к 32-му семейству гликозидгидролаз, сохраняющих аномерпую конфигурацию углеродного атома. Это семейство включает инвертазы (К.Ф. 3.2.і.26), ииулиназы (К.Ф. 3,2.1.7), леваназы (К.Ф. 3.2.1.65), экз о- и пул и пазы 0СФ.3.2Л.8О), сахароза:сахароза-1-фруктозилтрансферазы (К.Ф. 2.4Л.99), фруктан фруктан-1-фруктотрансфсразы (К.Ф. 2,4X100), На настоящий момент известны и зарегистрированы в соответствующих базах данных аминокислотные последовательности для ограниченного количества экзо- и эндо-инулиназ, выделенных из разных источников (табл. 1).
Таблица 1, Известные аминокислотные последовательности инулиназ-
н.о. - не определено
%>
Орпіашзч
Б^лок
Таблица 1. Известью аминокислотные последователь носі и инулинач
(продолжение), ___
Ии^лиіишА Икупинюча В Эн.ю-mi ул и кігі а
*Ы> Arand. Л.М. tioktbev. J.R. Hiandao Ncto, I Foii^arpov, R. Walikv,, O.S. Koniceva. I:.V. Глсуукйуа, A,A. Ktiteiiiskay^. K.A. ЙЬ-ііЬгЛіп, S.M. ShishJi;]iH^kov; O.V. Cliepuniavu and K.X'r Ncuiilro^v (2002) Purifies I km, ch^racten!>?"Ekni. gene cbniug, arid prdiminary X-ray іііш<ПЧ1їссч<)-ігшН]і6ійс from Aspergillus а\ттогі. IttoehemJ 362(1 у Ш-Пх
.?к*ю-Ш1\лвдша
ФруКШь1"Э[О0-
«иъйсэд 2250
-К'іШІ-І-'Ж..Ю-
_гщролїш_ИЬ_
')гш>-*шулимШ
(muA)
Ctehorhmi иііуЬич
і І'к'ґіЬ-л'/іїщ
І :
jj'BS 6Ь!>6
Наіулшій:#і (tNU) j 0#рчг^?ия'Л ташетт
і vaj. marxkmus. ЛТСС 12-124
Ретаїїшт sn TN-J
(b«D)_
Pcmviilmm зр, TN-88 ft v# шішін mm- mttcfdu!eii\
Sirvpfocotjciw rmtfews GS-5
Ипу.шш;т С!
Зі.ло-*]ну.кііціч;а
(1iui2)
липаза
укгак р-
Фрукш* гидропат * Strefitocaceas титт UA
і дао-Р-О- ' 159
j Фру & rail Т~"шч.?- Тгтснт aesiivum Pnjem
і т-цдрлла^ wl (1- |
I R-HwH _ !__
Фруктан І-акзо- '1'rmcum a^tmmi !\ijero
підрсгша w3 (І-
ШН*3_
TrmcUm acMtvum PI 173*08
Фругітан !--моо-
іидролаіїї wl il-
5 2.1 7 і АВОІ.У.'Л влліі"<п.
3.2 J .7
1.2
дУЇ^Н0\'ЧАОШ4и
О^бгиз "1
3.2'.L80 ! A^i5703CAC44220J
1.2,1 JO , \~У>1 ЬУ-f- AXFHttMA
' A^M^.'CAC.^Ill
1.2Л.&0 . Л1?9ЯП^СЛГ37У2ХЭ і
(}ШІ5
1.2, l&o" ~ Ашт^А тмжтікі
'SX I SO AjfrHj/CAA02437J
Х6847'),'СЛА485Ш
y9UWI
-J
і-ТІ.7 " Х5?202/(:АА4|МЖї
J*2»W
QSKKH
1.2,1.7 j AJUMJ >37'ЇЇАт'Ш2Л І Q9HFAS 1 І2І~- ! "А&\Ш\&АА$4ІІІаЛ І (МЛІЛ І
'} -2 Л, 7 ! АРІ4ІШ'ААР349'Ж
Q03I7*
3Т2.І.8О Г~~ ШИЯ/АААІбШЛ
( и?829/АЛЛ2Ш9Л
І КС eo^SO/NP "205SK.
л*ш
А№уП%ЯЛ№Ш$Л
Л]5ШҐ25/і:АІШЖї
л-т-ю;СА\№т.
0К-1І.Л
і і.0.
Сравнение аминокислотных последовательностей представителей 32
семейства выявило наличие более 10 консервативных областей (Naumov and
Doroshenko, 1998). Одна из них, расположенная па N-концеін.іх фрагментзх
последовательностей, включает высоко-консервативную пару
аминокислотных остатков Asp-Pro. Остаток аспарагиновой кислоты 23, как
было показано для инвертазы из Saccharomyces cerevisiae SUC2 (Reddy and
Маїсу, 1990), является нуклеофилом в активном центре фермента. Позднее
теми же авторами было показано, что донором протона в активном центре
этого представителя 32 семейства гликозидгидролаз является
аминокислотный остаток Glu 204. Путем замены глутаминового остатка 204
на аланин исследователи показали снижение каталитической активности
мутантного фермента в 3000 раз (Reddy and Maley, 1996). Таким образом,
общий механизм катализа для всех представителей 32 семейства
предполагает участие остатка аспарагиновой кислоты в качестве нуклеофила
и глутаминовои в качестве кислотно-основного катализатора. Это
заключение было позже подтверждено сайт-специфическим мутагенезом и
структурным анализом левансахаразы из Bacillus subtilts (Meng и Futterer,
2003). Мутации Asp 86 (нуклеофила) или Glu 342 (кислотно-основной
катализатор) полностью элиминиропали активность фермента.
Множественное сравнение аминокислотных последовательностей
фруктоз ил трансфераз, инвертаз, леианаз, инулиназ и сахароза-б-
фосфатгидролаз выявило наличие консервативного мотива Arg-Льр-Рго
(RDP-мотив), который, по всей видимости, иїрает обшую функциональную
роль для всех представителей 32-го семейства (Hcnikoff et al.,1991; Sprcnger et al., 1995; Chavez et al., 1998). Роль остатка аспарагиновой кислоты в этом мотиве для левансахаразы из Acetobacter diazotrophicus SRT4 (LsdA) была изучена методом сайт-специфического мутагенеза (Batista et al., 1999). В результате LsdA-мутапт, D309N, продемонстрировал пониженную активность (кСйі уменьшилось в 75 раз по сравнению с диким типом) в отличие от значения константы Михаэлиса, которое осталось неизменным. Таким образом, показано, что этот остаток аспарагиновой кислоты играет существенную роль для каталитической функции фермента. В качестве дополнительного доказательства функциональной роли аспартата в этом мотиве для представителей семейства 32 был создан мутант левансахаразы из Bacillus subtilis, где Asp 274 был заменен на Ala, который оказался практически неактивным (Meng and Futterer, 2003).
2.4. Каталитические механизмы дсііствин глико^идгидролаз.
Как было установлено, представители 32-го семейства гликозидгидролаз
являются так называемыми «сохраняющими» гликозидазами
( т.е. и субстрат, и продукт ферментативной реакции имеют одинаковую аномерную конфигурацию (Sinnott, 1990; Jacobson et al., 1994, 1995; Withers, 1995). Механизм действия этих ферментов описан ниже. Гликозидгидролазы же, обращающие аномерпый углеродный атом («обращающие» гликозидазы), катализируют гидролиз гликозидной
связи по другому механизму (McCarter and Withers, 1994; Rye and Withers, 2000; Zechc! and Withers, 2000).
Механизм: действия «сохраняющих» гликозидаз, вперпые предложенный еще 50 лет назад (Koshland, 1953) и общепринятый сегодня (McCarter and Withers, 1994), представляет собой реакцию двойного замещения, гді: Сі субстрата подвергается двум последовательным нуклеофильным атакам (McCarter and Withers, 1994; Davies and Henrissat, 1995). Каждая из атак обращает СІ-атом, приводя в результате к продукту с той же самой конфигурацией, что и субстрат. У «обращающих» гликозидаз, напротив, происходит лишь одна нуклеофильная атака на С1 сахарного субстрата, в результате чего аномерная конфигурация в этом положении обращается при ферментативном гидролизе.
На рис. 3 представлен механизм реакции двойного замещения
«сохраняющей» гликозидазы. На первой стадии (гликозилирование) атом
кислорода аминокислотного остатка (нуклеофила), участвующего в
каталитическом акте, атаїсует электрофильный СІ гексозного кольца с
разрывом гликозилыюй связи и образованием ковалентно-связанного
щ промежуточного комплекса «фермент-субстрат». На второй стадии
(дегликозилирование) происходит вторая нуклеофильная атака субстрата в комплексе «фермент-субстрат» молекулой воды, депротопированной вторым аминокислотным остатком (общей кислотой/основанией). На этой стадии образуется продукт реакции и регенерируется фермент.
Рис. 3. Схема каталитического механизма реакции «сохраняющей» экзо-гликозидазы.
уі а г ШсЛ'ШЛ'ма
вчымт а/о&тв, i-i?
7 / '
О О
1^*П*Эф-1П
/1 т
*Ч.
СИ 0 ?Г с
*>*
о*.
он <
CM Off о
И СПОТ чІПо-tft
О
См И
о. о"
Y
Гл лкшкл иропяі її іе
Дсі^шгаїїнл iipxiiiJ и к
Витгерс с соавт. (McCarler and Withers, 1994) показали, что две каталитических карбоксильных аминокислоты гликозидгидролаз находятся на противоположных сторонах гексозного кольца, содержащего лабильную гликозильную связь. Два механизма действия гликозидаз («сохраняющий» и «обращающий») являются следствием различной архитектуры каталитического центра ферментов. В частности, у «сохраняющих» гликозидгидролаз расстояние между аминокислотными остатками, вовлеченными в акт катализа, составляет 5.5 Л, а у «обращающих» - 9.5 А (Ly and Withers, 1999). Таким образом, информацию о механизме действия гликозидгидролазы можно получить из рентгеноструктурного анализа молекулы белка.
Следствием описанного гидролитического механизма является абсолютная аномерная селективность гликозидаз. Наряду со строгой специфичностью по отношению к уходящим и нуклеофильным группам эта особенность позволяет обращать реакцию гидролиза, катализируемую «сохраняющими» гликозидгиролазами. В прямой, гидролитической, реакции
уходящая группа - это гликозил, а нуклеофилом (акцептором гликозила) служит вода. Однако в качестве акцептора гликозильной группы может выступать пизкомолекулярныи спирт или моносахарид. При концентрациях субстрата и акцептора выше действующих значений Км реакции переноса гликозильных групп контролируются кинетически (реакциия 1)г следовательно, все возможные продукты переноса, действительно, возможны, исходя из действия «сохраняющих» гликозидаз на сахариды. Вода в этом случае действует как конкурентный нуклеофил, приводя к нежелательной реакции гидролиза. Обращение гидролиза или конденсация моносахарида и спирта, где вода является уходящей группой (реакция 2)у контролируется термодинамически.
Гликозил-ORi + R2OH «-+ Гликозил-ORz + RiOH (1)
Гликозил-ОН + RiOH +-> Гликозил-ORi + Н20 (2)
Несмотря на многочисленные литературные данные о
трапегликозилирующих способностях многих представителей 32-го
семейства, в частности, сахароза хахарозфруктозилтрансфераз,
фруктап:фруктанфруктозилтрапсфераз и циклофруктозилтраисфераз, на сегодняшний день не была описана трансгликознлирующая активность именно экзо-инулиназ.
Щ?
2,5. Построение субеайтной модели активного центра экзо-дсйствующих гл и коз ид гид рол аз.
Согласно теории Хироми (Hiroini, 1970; НіготІ et al., 1973), для
построения схематической модели субеайтной организации активного центра
экзо-действующей гликозидгидролазы необходимо знание кинетических
параметров гидролиза олигосахаридов различной длины, а именно константы
Михаэлиса (К^) и скорости реакции (кса1). Два допущения лежат в основе
этой теории: 1. каждый субсайт имеет свою собственную аффинность к
гликозидному остатку олигомерного субстрата, при этом отсутствует
пересечение между субсайтами; 2. субсайтные аффинности являются
аддитивными величинами. Существенным является постоянство значений
константы истинной скорости гидролиза гликозидной связи К\п1ґ. Отсюда
сродство субстрата становится суммой аффинностей для каждого
гликозидного остатка субстрата, доступного для связывания. Различия в
значениях скоростей гидролиза kC3l обусловлены разным вкладом
продуктивных комплексов для различных субстратов. Впервые субсайтная
теория Хироми была применена для глюкоамилазы (Hiroini el al., 1973),
позже ее с успехом использовали для определения аффинностей различных
экзо-гликозидаз: а-глюкозидаза (Kimura et aL, 1990), [ї-глюкозидаз из
Aspergillus /wger (Yazaki et aL, 1997) и Candida wickerlmmii (Freer, !993), экзо-
Р-1,3-глюканазы из Trichoderma viride (Kulmmskaya et al., 2001) и многих
других.
2.6, Микробные икзо-инулиназы: исследования механизма реакции.
Существует ряд методик, с помощью которых можно изучать механизм
действия выбранной гликозидгадролазы. Они включают, как правило,
исследования рН-зависимости, ингибирования, вторичного изотопного
эффекта и структурно-функциональные эксперименты, определение
каталитических аминокислот при помощи мечения их фтор-со держащими
сахарами, реакций с деокси-аналогами субстратов или сайт-направлен но го
мутагенеза. На сегодняшний день только часть вышеперечисленных
экспериментов в отношении микробных экзо-инулиназ были описаны
разными авторами. Известны аминокислотные последовательности, и
клонированы гены не менее 10-ти экзо-инулиназ из различных источников;
Geobacillvs slearothermophiliS) Tsujiinoto et al., 2003; Bacillus polymyxa, Kwon
et al., 2003; PenicilHnm sp., Moriyama et al., 2002; Thermotoga maritima, Licbl et
al., 1998; Aspergillus awamori, Arand et al., 2002, и др. Для всех
представителей семейства 32 установлен каталитический механизм действия
- с сохранением аномерной конфигурации субстрата и продукта. При
помощи сайт-направленного мутагенеза и аффинным меченисм выявлены
^ аминокислотные остатки, участвующие в акте катализа дрожжевой
инвертазы, а именно остаток аспарагиновои кислоты в качестве нукдеофила
и остаток глутаминовой кислоты в качестве общего кислотно-основного
катализатора (Rccldy and Maley, 1990; 1996). Подробные же структурные
данные на основе рентгеновского анализа были получены совсем недавно
для инвертазы из Thermotoga maritima (Alberto е al., 2004), а для экзо-
инулипаз на сегодняшний день опубликованы лишь предварительные (Arand
et alM 2002). Таким образом, наша работа восполняет существующий пробел в
наших знаниях о структурно-функциональных особенностях важных
промышленных ферментов, экзо-инулиназ, и дает более полное
