Введение к работе
Актуальность проблемы. р-Глюкозидазы относятся к группе катаболичес-ких ферментов углеводного обмена - гликозидаз, специфически расщепляющих гликозидные связи в различных углеводсодержащих биополимерах. Особый интерес к этим ферментам вызван тем, что их генетическая недостаточность в организме человека приводит к развитию тяжелых наследственных заболеваний.
В настоящее время в тканях человека обнаружено три фермента, способных отщеплять остатки p-D-глюкозы от различных природных и синтетических субстратов. Это лизосомная и нелизосомная глюкоцереброзидазы, а также цитозоль-ная р-глюкозидаза. Наиболее широко изученным из этих ферментов является лизосомная глюкоцереброзидаза, катализирующая отщепление остатка глюкозы от глюкозилцерамида - промежуточного продукта деградации большинства комплексных гликосфинголипидов клеточных мембран. Недостаточность этого фермента в организме человека приводит к развитию одной из наиболее распространенных лизосомных болезней накопления - болезни Гоше.
В последние годы достигнут значительный прогресс в области изучения глюкоцереброзидазы. Это касается таких аспектов как очистка и анализ кинетических свойств этого фермента, установление его аминокислотной последовательности и олигосахаридного состава, выделение и экспрессия кДНК клонов, кодирующих глюкоцереброзидазу, описание процессов биосинтеза и созревания фермента. Однако это не позволило решить ряд проблем, и, прежде всего, установить причины чрезвычайно высокой клинической гетерогенности болезни Гоше, проявления которой варьируют от тяжелой формы болезни со смертельным исходом, сопровождающейся серьезными нарушениями со стороны нервной системы, до появления первых признаков заболевания у людей, возраст которых достигает 60 - 70 лет. До сих пор не удалось установить корреляции между остаточной активностью лизосомной глюкоцереброзидазы и тяжестью течения заболевания. Кроме того, до сих пор не установлена физиологическая функция двух других р-глюкози-цаз человека, также как и их роль в проявлении симптомов болезни Гоше. Для решения этих проблем представляется необходимым детальное изучение свойств л, прежде всего, субстратной специфичности различных р-глюкозидаз человека.
Для проведения таких исследований широко применяются различные приходные и синтетические субстраты. Однако использование природных субстратов
в значительной степени ограничено сложностью их выделения, введения в них радиоактивной метки и ее тестирования. Использование в качестве субстратов различных синтетических гликозидов, содержащих в агликоновой части молекулы хромогенные или флуорогенные группировки, среди которых наибольшее применение нашел 4-метилумбеллиферил-р-0-глюкозид (MGIc), значительно упрощает определение активности гликозидаз, однако не всегда сохраняет специфичность реакции. В связи с этим представляется актуальным синтез таких флуорогенных субстратов, структура агликоновой части которых частично моделировала бы строение агликоновой части природного глюкозилцерамида.
Наличие таких субстратов может позволить более детально разобраться в механизмах наследственных нарушений, связанных с развитием болезни Гоше, а также будет способствовать дальнейшему развитию теоретических представлений о механизме действия р-глюкозидаз человека и о их роли в обмене углеводсодер-жащих соединений. Кроме того, такие исследования актуальны еще и потому, что позволяют создавать новые методы диагностики лизосомных болезней накопления.
Цель и задачи исследования. Синтез новых флуорогенных р-О-гпюкози-дов, структура которых частично моделирует структуру природного глюкозилцерамида, и изучение субстратной специфичности различных р-глюкозидаз человека по отношению к синтезированным субстратам, для выявления взаимосвязи между строением агликоновой части молекулы субстрата и каталитической активностью ферментов.
В соответствии с основной целью работы были поставлены следующие задачи:
-
Синтез ряда p-D-глюкозидов на основе умбеллиферона, содержащих е агликоновой части молекулы ациламидные и алкильные заместители различное длины.
-
Исследование способности синтезированных p-D-глюкозидов расщеп ляться под действием ферментных препаратов из различных тканей и клеток че ловека.
-
Сравнительное изучение уровня ферментативной активности в норме при болезни Гоше по отношению к различным субстратам.
-
Изучение влияния природы заместителя на скорость гидролиза синтезі/
рованных субстратов под действием очищенных препаратов различных й-глю-козидаз человека.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые осуществлен синтез ряда p-D-глюкозидов 4-метилумбеллиферона, содержащих в агликоно-вой части N-ациламидные заместители различной длины. Проведено сравнительное изучение ферментативного гидролиза синтезированных субстратов под действием препаратов из различных тканевых источников в норме и при различных типах болезни Гоше, а также очищенными препаратами известных В-глюкозидаз человека (лизосомной и нелизосомной глюкоцереброзидазами и цитозольной р-глю-козидазой). Показано, что модификация структуры агликоновой части молекулы субстрата оказывает значительное влияние на каталитическую активность ферментов. На основании полученных данных, установлено существование новой формы В-глюкозидазы человека, предложена схема частичной очистки этого фермента из ткани почки человека, изучены его основные свойства, субстратная специфичность и субклеточная локализация.
Синтезированные p-D-глюкозиды 6-Ы-ациламино-4-метилумбеллиферона могут быть использованы для дальнейшего изучения свойств новой формы В-глюкозидазы человека, с целью выяснения его физиологической роли, в том числе и как эпигенетического фактора в проявлении фенотипических особенностей болезни Гоше.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Первом Всесоюзном съезде медицинских генетиков'(Киев, 1984), IV Международном симпозиуме по медицинской генетике (Германия, Айзенах, 1986), V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), VIII Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Пущино, 1987) и Восьмом рабочем совещании европейской научной группы по лизосомным болезням (Франция, Аннеси, 1991). Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции лабораторий НИИ биомедицинской химии РАМН.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на ЛфО страницах машинописного текста, содержит 4 схемы, 18 рисунков и 10 таблиц, и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы»,
Похожие диссертации на Синтез B-D-глюкозидов 6-N-ациламино-4-метилумбеллиферона и их использование для изучения субстратной специфичности В-глюкозидаз человека
