Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 7
2. Обзор литературы
2.1. Окислители и антиоксиданты 10
2.2. Повреждения ДНК
2.2.1. Урацил и другие продукты дезаминирования оснований ДНК 13
2.2.2. Продукты электрофильного присоединения 13
2.2.3. Апурин-апиримидиновые сайты 14
2.2.4. Фотопродукты 15
2.2.5. Окисленные пиримидиновые основания 15
2.2.6. Окисленные пуриновые основания
2.2.6.1. 8-оксогуанин и формамидопиримидиновое производное гуанина 16
2.2.6.2. 8-оксоаденин и формамидопиримидиновое производное аденина
2.3. Биологические последствия окислительных повреждений ДНК 19
2.4. Репарация
2.4.1. Общий механизм эксцизионной репарации оснований 23
2.4.2. ДНК-гликозилазы 26
2.4.3. Каталитический механизм ДНК-гликозилаз 28
2.4.4. GO-система 31
2.4.5. Формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза (Fpg или MutM) 33
2.4.6. Эндонуклеаза VIII (Nei) 37
2.4.7. 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза человека, OGG1 ;... 38
2.4.8. АП-эндонуклеазы 41
2.4.9. Коррелированный поиск повреждений в эксцизионной репарации оснований 43
2.4.10. Белок-белковые взаимодействия в процессе эксцизионной репарации оснований 45
2.4.11. Полиморфные варианты гена OGG1 и риск возникновения онкологических заболеваний 2.4.11.1. Полиморфные варианты OGG1 49
2.4.11.2. Функциональность полиморфных вариантов OGG1 50
2.4.11.3. Эпидемиологические исследования ассоциации OGG1 с онкологическими и другими заболеваниями 52
3. Материалы и методы 55
3.1. Реактивы 55
3.2. Дезоксирибоолигонуклеотиды 55
3.3. Ферменты 57
3.4. Штаммы бактерий 57
3.5. Сайт-направленный мутагенез OGG1 57
3.6. Выделение 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека (OGG1) 58
3.7. Выделение АП-эндонуклеазы человека (АРЕХ1) 59
3.8. Определение концентрации белка 60
3.9. Гель-электрофорез и количественный обсчет результатов экспериментов 60
3.10. Введение 32Р метки по 5 -концу дезоксирибоолигонуклеотидов 61
3.11. Стандартные условия отжига комплементарных цепей олигонуклеотидов 61
3.12. Определение концентрации активной формы OGG1 61
3.13. Влияние ионной силы и ионов Mg"+ на специфичность OGG1 и Fpg 62
3.14. Определение кинетических параметров Fpg и OGG1 62
3.15. Определение влияния OGG1 на активность АРЕХ1 64
3.16. Взаимодействие OGGl с АП-эндонуклеазами и ДНК-гликозилазами 64
3.17. Моделирование каталитической схемы OGG1 по методу Монте-Карло.. 65
3.18. Препаративный синтез ковалентного комплекса OGG1 с дуплексами, содержащими 8-oxoGua 66
3.19. Регистрация взаимодействия комплекса flHK OGGl с АРЕХ1, Apnlp и Nfo 66
3.20. Взаимодействие комплекса ДНКЮООІ сАРЕХІ на нитроцеллюлозных мембранах 67
3.21. Получение конкатемерной ДНК 67
3.22. Определение механизма вытеснения OGG1 АП-эндонуклеазой 68
3.23. Получение субстратов для экспериментов по коррелированному расщеплению 68
3.24. Коррелированное расщепление субстратов 69
3.25. Клонирование генов mtu-nei2 и mtu-fpg2 из М. tuberculosis 69
3.26. Комплементация генами mtu-nei2 и mtu-fpg2 мутантных фенотипов Е. coli 3.27. Экспрессия и выделение белка Mtu-Nei2 70
3.28. Определение активности препаратов Mtu-Nei2 72
3.29. Образование ковалентных комплексов Mtu-Nei2 с поврежденной ДНК.. 72
4. Результаты и их обсуждение 73
4.1. Влияние ионов Mg2+ и ионной силы на специфичность 8-оксогуанин ДНК-гликозилаз Е. coli и человека 73
4.1.1. Влияние ионной силы и дивалентных катионов на активность и специфичность OGG1 и Fpg 73
4.1.2. Влияние органических анионов на специфичность Fpg и OGG1 78
4.1.3. Отсутствие влияния полиаминов, краудинг-агентов и некоторых аналогов пуринов на активность и специфичность OGG1 и Fpg 82
4.1.4. Влияние условий реакции на специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз: заключение 83
4.2. Взаимодействие OGG1 с АРЕХ1 и влияние этого взаимодействия на специфичность OGG1 86
4.2.1. Стимуляция активности OGG1 в присутствии АРЕХ1 87
4.2.2. Активность OGG1 в присутствии АРЕХ1 для субстратов с различным положением 8-oxoGua:Cyt 88
4.2.3. Активность OGG1 в присутствии АП-эндонуклеаз из S. cerevisiae и Е. coli 89
4.2.4. Влияние других ДНК-гликозилаз и АП-лиаз на активность OGG1 90
4.2.5. Образование тройного комплекса между OGG1, ДНК и АП-эндонуклеазами 91
4.2.6. Влияние АРЕХ1 на основные кинетические параметры OGG1 95
4.2.7. Расщепление АП-эндонуклеазой АРЕХ1 субстрата, содержащего аналог АП-сайта, в присутствии OGG1 97
4.2.8. Специфичность стимуляции OGG1 в присутствии АРЕХ1 99
4.3. Процессивность ДНК-гликозилаз и ее вклад в субстратную специфичность 104
4.3.1. Коррелированное расщепление одноцепочечных и двуцепочечных субстратов урацил-ДНК-гликозилазой Е. coli (Ung) 105
4.3.2. Коррелированное расщепление ДНК и субстратная специфичность фермента Fpg 109
4.3.3. Коррелированное расщепление ДНК и субстратная специфичность фермента OGG1 111 4.3.4. Коррелированное расщепление ферментами Fpg и OGG1 субстратов, содержащих брешь 112
4.3.5. Коррелированное расщепление ДНК мутантными формами Fpg 113
4.3.6. Процессивность при вытеснении АП-эндонуклеазой фермента OGG1 из комплекса с продуктом 114
4.3.7. Влияние процессивности на специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз: заключение 115
4. Субстратная специфичность полиморфных и фосфомиметических вариантов белка OGG1 117
4.4.1. Активность и субстратная специфичность мутантных форм OGG1 при расщеплении олигонуклеотидных субстратов 119
4.4.2. Активность и субстратная специфичность мутантных форм OGG1 при расщеплении высокомолекулярной ДНК 122
4.4.3. Стимуляция активности мутантных форм OGG1 АП-эндонуклеазой АРЕХ1 125
4.4.4. Субстратная специфичность полиморфных и фосфомиметических вариантов белка OGG1: заключение 126
5. Клонирование и характеризация гомологов Nei и Fpg из М. tuberculosis 127
4.5.1. Комплементация мутантого фенотипа Е. coli 130
4.5.2. Выделение и характеризация рекомбинантного белка Mtu-Nei2 132
Заключение 136
Выводы 138
Список литературы
- Урацил и другие продукты дезаминирования оснований ДНК
- Белок-белковые взаимодействия в процессе эксцизионной репарации оснований
- Гель-электрофорез и количественный обсчет результатов экспериментов
- Расщепление АП-эндонуклеазой АРЕХ1 субстрата, содержащего аналог АП-сайта, в присутствии OGG1
Введение к работе
Актуальность проблемы. Окислительные повреждения оснований, очень часто встречающиеся в ДНК, играют важную роль в онкогенезе, старении и многих патологических процессах. За удаление небольших поврежденных оснований из ДНК отвечают ферменты ДНК-гликозилазы. В число самых распространенных повреждений ДНК входит окисленное производное гуанина — 8-оксогуанин. Это окисленное основание выщепляется 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазами Fpg и OGG1 у про- и эукариот, соответственно. Правильное функционирование системы репарации 8-оксогуанина в клетках препятствует процессам мутагенеза и канцерогенеза. Субстратной специфичности ДНК-гликозилаз посвящено большое количество работ во всем мире, однако на сегодняшний день многие определяющие ее факторы слабо изучены. Представляется, что на активность и специфичность ДНК-гликозилаз в клеточном окружении могут влиять ионная сила, наличие ионов магния, полиамины, краудинг-агенты, аналоги гетероциклических оснований, посттрансляционные модификации, механизмы поиска поврежденных оснований в ДНК, взаимодействие с другими участниками системы репарации и природные аминокислотные замены. Влияние вышеприведенных факторов практически не исследовано для ферментов репарации ДНК, в частности Fpg и OGG1.
Цель настоящей работы заключалась в изучении факторов, влияющих на субстратную специфичность ферментов OGG1 и Fpg. В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи:
изучить влияние условий реакции: ионной силы, присутствия ионов Mg2+, краудинг-агентов, полиаминов и т. п. на активность и на субстратную специфичность ферментов OGG1 и Fpg;
изучить влияние АП-эндонуклеазы человека (АРЕХ1) на активность и субстратную специфичность фермента OGG1;
изучить процессивность реакции расщепления различных субстратов ферментами Fpg и OGG1 и возможный вклад процессивности в субстратную специфичность этих ферментов;
изучить влияние некоторых полиморфных и имитирующих фосфорилирование аминокислотных замен на активность и субстратную специфичность фермента OGG1;
изучить субстратную специфичность ферментов, которые в целом гомологичны белку Fpg, но отличаются от него последовательностями некоторых высококонсервативных в семействе Fpg мотивов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Работа представляет собой первое систематическое исследование на количественном уровне различных факторов, влияющих на субстратную специфичность ДНК-гликозилаз. Впервые было показано, что корректное функционирование ферментов Fpg и OGG1 обеспечивается при концентрации ионов магния и ионной силы близких к физиологическим. Известно, что АП-эндонуклеаза человека (АРЕХ1) способна стимулировать активность OGG1, однако непосредственного взаимодействия между ферментами обнаружено не было. В данной работе было показано непосредственное взаимодействие белков OGG1 и АРЕХ1, следствием которого являлось увеличение ферментативной активности OGG1 на его биологически важных субстратах. Предложена новая методика количественного анализа процессивности ферментов, специфичных к определенному участку ДНК, в частности ДНК-гликозилаз, и проведено сравнение процессивности действия Fpg и OGG1 при расщеплении разных субстратов. Впервые изучена субстратная специфичность полиморфных (A288V, D322N, S326C) и фосфомиметических вариантов OGG1 (S231E, S232E, S231/232E, S280E, S326E), как по отношению к основанию напротив 8-oxoGua, так и к активности данных форм на высокомолекулярной облученной ДНК. Впервые из Mycobacterium tuberculosis клонирован, вьщелен и охарактеризован гомолог эндонуклеазы VIII (Nei) и Fpg Е. coli — Mfw-Nei2, который по субстратной специфичности оказался наиболее близким к Nei.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы. Результаты работы были представлены на VI международной конференции по процессам узнавания нуклеиновых кислот (NACON VI, Шеффилд, Великобритания, 2004), международной конференции «Chemical and biological problems of proteomics» (Новосибирск, 2004), XXX конгрессе Федерации европейских биохимических обществ и IX конференции Международного союза биохимии и молекулярной биологии (Будапешт, Венгрия, 2005), международной конференции «Химическая биология» (Новосибирск, 2005), IX международном симпозиуме по радиационным повреждениям ДНК (Анталья, Турция, 2006), международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию со дня рождения акад. Д.Г. Кнорре (Новосибирск, 2006), Второй научной конференции «Молекулярная генетика, биофизика и медицина» «Бреслеровские чтения-П» (Санкт-Петербург, 2006) и III международной конференции «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2007).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 160 страницах, содержит 35 рисунков и 16 таблиц. Библиография содержит 357 литературных источников.
Урацил и другие продукты дезаминирования оснований ДНК
В 1979 г. в Е. coli была обнаружена ДНК-гликозилаза, выщепляющая из ДНК основание mFapy-Gua [107]. Впоследствии этот фермент получил название формамидопиридидин-ДНК-гликозилаза (Fpg). Ген fpg был клонирован с помощью скрининга геномной библиотеки Е. coli на наличие клонов с повышенной ферментативной активностью Fpg, что позволило получить рекомбинантный белок и исследовать его свойства [108, 109]. Независимо этот же ген был клонирован при поиске генов, мутации в которых селективно повышают частоту трансверсий G—»Т [ПО], поэтому в литературе часто можно встретить его обозначение mutM и соответственно фермент иногда называется MutM. После того, как было показано, что ДНК-гликозилаза, специфичная к основаниям 8-oxoGua, идентична Fpg [111], фермент получил еще одно название — 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза.
Белок Fpg Е. coli (Eco-Fpg) представляет собой мономер длиной 268 а.к.о. с расчетной молекулярной массой 30158 Да. Teiijpg кодирует полипептид длиной 269 а.к.о., но N-концевой остаток fMet отщепляется при созревании белка, что дает активный фермент с N-концевым остатком Pro [108]. В последовательности фермента обнаруживается консенсусный мотив «цинкового пальца» типа Cys4: СХ2СХ16СХ2С.
Фермент Fpg специфичен по отношению к повреждениям в дцДНК; оцДНК используется с эффективностью на несколько порядков меньше [112, 113]. Помимо mFapy-Gua, фермент может с разной эффективностью удалять из высокомолекулярной ДНК 8-oxoGua, Fapy-Gua и Fapy-Ade [111, 114]. Из ОДН-субстратов Fpg выщепляет достаточно большое число других поврежденных оснований, принадлежащих как к пуринам, так и к пиримидинам: синтетические аналоги 8-oxoGua 8-оксогипоксантин (8-охоНур) и 8-оксонебуларин (8-охоРи) [115, 116], продукты дальнейшего окисления 8-oxoGua оксазолон и оксалуровую кислоту [117], окисленные производные sAde [118], продукты раскрытия имидазольного кольца Gua после конъюгации с серным ипритом [119], аминофлуореном [115] или афлатоксином В1 [120], окисленные пиримидины Thy(OH)2 [121, 122], H2Thy [122], Ura(OH)2 [121], 5-OH-Ura [123], 5-OH-C [122, 123], 5-гидрокси-5-метилгидантоин [124], Шга [125] и уреидоизомасляную кислоту [126]. Также Fpg выщепляет О-метилгидроксиламин и О-бензилгидроксиламин из соответствующих (алкилокси)иминопроизводных по положению Г [103]. Биологическая значимость таких активностей неясна. Показано, что вышеперечисленные окисленные пиримидиновые основания не выщепляются ферментом из высокомолекулярной ДНК.
Активность Fpg по отношению к S-oxoGua-содержащим субстратам привлекает особое внимание исследований по причине важной биологической роли этого поврежденного основания (разд. 2.4.4). Штаммы Е. coli, дефицитные по белку Fpg, не способны удалять 8-oxoGua и mFapy-Gua из ДНК [127, 128]. Определение значений К\\ и Acat для Fpg по отношению к 8-oxoGua и ряду его аналогов [115] позволило предположить, что для узнавания поврежденного основания необходима карбонильная группа при атоме С8 или пиррольный характер атома N7, а для катализа ДНК-гликозилазной реакции — наличие карбонильной группы при атоме Сб. Однако это правило плохо объясняет субстратные свойства Fapy-Ade и окисленных пиримидиновых оснований.
Субстратная специфичность Fpg очень ярко проявляется в специфичности к основанию напротив поврежденного. Наихудшим субстратом для фермента служит пара 8-oxoGua:Ade, а из пары 8-oxoGua:Cyt поврежденное основание удаляется намного лучше [111, 115]. По поводу относительной эффективности превращения субстратов, содержащих основания Thy и Gua напротив повреждения, в литературе нет единого мнения, но в любом случае они используются ферментом с большей эффективностью, чем 8-oxoGua:Ade [115, 129]. Последовательность, окружающая поврежденное основание, также может оказывать влияние на эффективность его выщепления [130].
Для исследования субстратной специфичности ДНК-гликозилаз, принимающих участие в репарации окислительных повреждений (Fpg, OGG1, Nei, Nth и др.) применяется два основных типа экспериментов: измерение расщепления ферментами дцОДН-субстратов, содержащих поврежденные звенья, введенные при синтезе, или измерение выщепления поврежденных оснований из поврежденной ионизирующим излучением или химическим окислением высокомолекулярной ДНК. В последнем случае для количественного определения выщепленных оснований обычно используют газовую хроматографию с масс-спектрометрической детекцией (ГХМС). Несмотря на высокую воспроизводимость обоих методов, существуют значительные различия в определяемом ими спектре субстратов ДНК-гликозилаз. Например, при анализе субстратной специфичности Fpg методом ГХМС фермент выщепляет из ДНК основания 8-oxoGua, Fapy-Gua и Fapy-Ade и не выщепляет 5-гидрокси-5-метилгидантоин, 5-OH-Ura, 5-ОН-С, Thy(OH)2 и НгТЬу, которые эффективно удаляются из ОДН-субстратов [114, 131]. Сходная ситуация наблюдается при сравнении определенной этими методами субстратной специфичности ферментов OGG1 и Nei [132] (субстратная специфичность OGG1 описана в разд. 2.4.7). Причины такого расхождения между методами на сегодняшний день неизвестны.
Помимо ДНК-гликозилазной активности, фермент Fpg обладает ассоциированной АП-лиазной активностью [133], а также способен выступать в роли dRP-лиазы, отщепляя 5 -концевой остаток 2 -дезоксирибо-5 -фосфата на месте одноцепочечного разрыва ДНК [134]. В отличие от бифункциональных ДНК-гликозилаз, принадлежащих к суперсемейству Nth, Fpg эффективно катализирует как Р-, так и 5-элиминацию, оставляя на месте повреждения однонуклеотидную брешь, обрамленную фосфатными группами [82], причем, по всей вероятности, эти реакции протекают без диссоциации фермента из комплекса с субстратом, поскольку Fpg не проявляет активности по отношению к субстратам, представляющим собой продукты р-элиминации [82].
При обработке NaBH4 комплекса Fpg с субстратом происходит образование стабильного ковалентного комплекса [88, 135]. Масс-спектрометрический анализ продуктов трипсинолиза этого комплекса позволил установить, что катализ выщепления основания ферментом Fpg проходит с образованием основания Шиффа между остатком Рго-1 и атомом С Г поврежденного dN [90]. Замена остатка Рго-1 на другие аминокислотные остатки приводит к значительной или полной инактивации Fpg в зависимости от субстрата и типа введенного аминокислотного остатка [135, 136]. Таким образом, члены семейства Fpg образуют в качестве интермедиата основание Шиффа пирролидиновой природы, несущее постоянный положительный заряд на атоме азота; возможно, именно эта особенность Fpg стимулирует его гораздо более высокую активность в реакции 8-элиминации по сравнению с другими АП-лиазами.
Помимо Рго-1, методами сайт-направленного мутагенеза в Fpg были выявлены несколько позиций, важных для активности или субстратной специфичности фермента. Замена или химическая модификация остатков Cys в мотиве цинкового пальца приводит к потере ферментом способности связывать ДНК и соответственно к потере активности [137, 138]. При систематическом исследовании роли консервативных кислотных остатков в Fpg; выяснилось, что замена остатков Glu-2 и Glu-173 остатками Gin инактивирует фермент, а остатков Glu-5 и Glu-131 — значительно снижает его ДНК-гликозилазную активность [139]. Интересно, что влияние этих замен на АП-лиазную активность фермента оказалась гораздо меньше [139]. Также разное влияние на активность фермента по отношению к различным поврежденным основаниям и к АП-сайтам оказывают замены остатков Lys-56 [140] и Lys-155 [116]: как правило, активность разных мутантных форм
Белок-белковые взаимодействия в процессе эксцизионной репарации оснований
Реакционная смесь содержала 400 нМ одного из дуплексов 250G5//C25 , 250G13//C25 или 250G21//C25\ 50 мМ NaBH4 25 мМ КС1, рН 6,8, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ и фермент в 2-кратном молярном избытке над дуплексом (концентрация приведена по активной форме фермента). Свежеприготовленный раствор NaBFLi вносили в реакционную смесь непосредственно перед добавлением OGG1, реакцию вели в течение 30 мин. при 37С. Реакционную смесь с образовавшимся ковалентным комплексом без добавления красителя наносили на 8% ПААГ и разделяли электрофорезом в неденатурирующих условиях. Затем гель радиоавтографировали, ковалентный комплекс, имеющий подвижность значительно ниже, чем двуцепочечная ДНК, вырезали из геля и элюировали в течение 16 ч. при 0С буфером, содержащим 10 мМ ЭДТА и 1 мМ ДТТ.
Реакционная смесь для анализа взаимодействия ряда АП-эндонуклеаз с полученным комплексом ДНК-OGGl содержала очищенный ковалентный комплекс (OGGl« OG23//C23 или 0GG1- 250G13//C25 ), 10% глицерин, 20 мМ HEPES-NaOH, рН 7,5, 1 мМ ДТТ, 50 мМ КС1 и 2 мМ ЭДТА. В некоторых случаях ЭДТА заменяли на 5 мМ MgCb. Белки Apnlp, АРЕХ1 и Nfo добавляли в реакционную смесь до конечной концентрации ЮмкМ, 2,8 мкМ и 3,4 мкМ, соответственно. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2 мин.
Для стабилизации тройного комплекса с белком АРЕХ1 использовали сшивку формальдегидом. Реакционная смесь содержала 0,25 нМ ковалентный комплекс (0GG1« 250G5//C25\ 0GG1- 250G13//C25 или 0GG1« 250G21//C25 ), 50 мМ HEPES-NaOH, рН7,5, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl и 2,8 мкМ АРЕХ1. В качестве контроля в аналогичных условиях с АРЕХ1 инкубировали неспецифический ОДН G12//C12 , длина которого примерно равна длине свободного участка 25-звенного ОДН, связанного с OGG1. Для контроля подвижности комплекса APEX 1/ДНК меченый дцОДН F23//C23 инкубировали с АРЕХ1 в отсутствие Mg . В некоторых случаях в качестве конкурентов в реакционную смесь добавляли немеченые дцОДН F12//C12 или G12//C12 до конечной концентрации 4 мкМ. АРЕХ1 вносили в реакционную смесь перед добавлением формальдегида и позволяли связаться с комплексом OGGl flHK в течение 1 мин., затем в смесь вносили формальдегид до конечной концентрации 1,8% и инкубировали в течение мин. при комнатной температуре. Перед нанесением на гель в смесь добавляли 2,5 мкл 80% глицерина.
Для анализа связывания использовали метод задержки в геле. Перед нанесением образцов на 8% неденатурирующий ПААГ, содержащий 0,5 ТВЕ, проводили предфорез в течение 3 ч. при напряжении не более 300 В. Образцы наносили при включенном токе, электрофорез вели при 8С. Для контроля подвижности в отдельную дорожку наносили раствор 0,25% бромфенолового синего в 10% глицерине. После вхождения красителя в гель на 3 мм напряжение снижали до 200 В и вели электрофорез 3 ч. Радиоактивность полос определяли радиолюминесцентным сканированием.
Белки АРЕХ1, БСА и DenV (по 3 мкг каждого) разделяли электрофорезом в системе Лэммли и переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C (GE Healthcare, США) при помощи электроблоттинга в течение 2 ч. при 40 В в буфере, содержащем 15 мМ Трис-глицин, рН 8,6 и 15% этанол. Для визуализации подвижности полос белков и маркеров часть мембраны окрашивали кумасси голубым. Для ренатурации АРЕХ1 оставшуюся часть мембраны инкубировали при 4С в течение 16 ч. в буфере TBS (10 мМ Трис-НС1, 100 мМ NaCl), содержащем 10 мМ MgCb и 1 мМ ДТТ, и блокировали в буфере TBS, содержащем 0.2% Тритон-ХЮО и 0.5% БСА, в течение 10 мин. при комнатной температуре. Юпмоль 32Р меченого ковалентного комплекса 0GG1 250G13//C25 добавляли к 10 мл буфера TBS, содержащего 0.2% Тритон-ХЮО и 0.05% БСА. Мембраны инкубировали в данном растворе при 4С в течение 24 ч., несвязавшийся комплекс OGGl HK отмывали этим же раствором (3 раза по 10 мл, каждая промывка по 10 мин.). Для визуализации результатов мембрану высушивали и подвергали радиолюминесцентному сканированию.
3.21. Получение конкатемерной ДНК
Введение 32Р-метки по 5 -концу ОДН kOG проводили согласно стандартной методике при концентрации ОДН в реакционной смеси 130 мкМ. Для исчерпывающего фосфорилирования 5 -концов в реакционную смесь затем дополнительно добавляли 20 ед. акт. полинуклеотидкиназы и нерадиоактивный АТР до конечной коцентрации 1 мМ. Реакцию вели 40 мин. при 37С с последующим прогревом при 95С (5 мин.), затем ОДН выделяли из реакционной смеси хроматографией на сорбенте Cis NenSorb. Реакционная смесь для кинирования ОДН кС содержала тот же буфер, 20 ед. акт. полинуклеотидкиназы и ОДН с концентрацией 125 мкМ. Реакционную смесь инкубировали при 37С 40 мин., после чего прогревали в течение 5 мин. при 95С. После фосфорилирования оба ОДН смешивали (концентрация каждого составляла 120 мкМ), нагревали до 95С и остужали до 25С в течение 2 ч. Затем к смеси добавляли 20 ед. акт. полинуклеотидкиназы, б ед. акт. ДНК-лигазы и буфер (конечная концентрация компонентов: 50 мМ Трис-НС1, рН7,5, ЮмМ MgCI2, 10 мМ ДТТ, 1 мМ АТР, 25 мкг/мл БСА). Реакционную смесь инкубировали в течение 2 ч. при комнатной температуре, затем добавляли еще 6 ед. акт. ДНК-лигазы и АТР до конечной концентрации 2 мМ и инкубировали в течение 16 ч. в тех же условиях. Очистку конкатемерной ДНК от низкомолекулярных фрагментов проводили электрофорезом в 8% ПААГ в неденатурирующих условиях. Гель радиоавтографировали, конкатемерную ДНК, имеющую меньшую подвижность по сравнению с низкомолекулярными формами, вырезали из геля и элюировали в течение 16 ч. при 0С буфером ТЕ.
Реакционная смесь содержала очищенную конкатемерную ДНК ( 0,5 мкМ в пересчете на мономер), 20 мМ HEPES-NaOH, рН 7,5, 1 мМ ДТТ, 50 мМ КС1, 5 мМ MgCl2 и 0,5 нМ OGG1. При необходимости добавлялась АРЕХ1 до концентрации 50 нМ. Реакцию проводили при 37С от 2 мин. до 2 ч. Реакцию завершали добавлением буфера для нанесения. Продукты реакции анализировали гель-электрофорезом в денатурирующих условиях.
Гель-электрофорез и количественный обсчет результатов экспериментов
Исходя из результатов моделирования, приведенных на рис. 20А, можно заключить, что наблюдаемая в опытах фаза всплеска возникает в случае минимальной схемы реакции (Схема I). Введение дополнительного равновесия с АП-сайтом приводит к исчезновению фазы всплеска до тех пор, пока величина к не становится сравнимой с константой скорости Р-элиминации (&з). В этом случае К& для связывания OGG1 с АП-сайтом составила бы 20 пМ, что на несколько порядков меньше величин, приводимых в литературе [176]. Введение третьей равновесной стадии (с продуктом р-элиминации) не приводило к заметному отклонению от кинетических кривых, полученных для случая моделирования при наличии только первых двух равновесных стадий (рис. 20Б). Таким образом, можно сделать вывод, что существование наблюдаемой фазы всплеска говорит о чрезвычайно низкой скорости высвобождения OGG1 из комплекса с АП-сайтом.
Как видно из структуры комплекса OGGl/ДНК [150] (рис. 10А), АП-сайт в комплексе скрыт внутри белковой глобулы и не может непосредственно взаимодействовать с ферментом АРЕХ1. В том случае, если АРЕХ1 специфически узнает комплексы OGGl/АП-ДНК, АП-эндонуклеаза должна иметь повышенное сродство к таким структурам. Для проверки этого предположения было исследовано расщепление ферментом АРЕХ1 субстрата, содержащего THF-аналог АП-сайта в паре с dCyd в присутствии и в отсутствие OGG1. Такой дцОДН не является субстратом для OGG1, но эффективно связывается с ферментом [176]. Активность АРЕХ1 определяли с использованием субстрата THF:dCyd в присутствии OGG1 в концентрациях 0-300 нМ, концентрация АРЕХ1 при этом оставалась неизменной (1 нМ). Зависимость активности АРЕХ1 от концентрации OGG1 имела колоколообразный характер (рис. 21), причем максимум расщепления поврежденной ДНК имел место при примерно эквимолярном соотношении субстрата и OGG1, в то время как при более высоких концентрациях OGG1 наблюдалось заметное снижение расщепления. Наблюдаемый эффект был специфичен для OGG1, так как ДНК-гликозилазы NEIL1 и NEIL2, которые способны эффективно связывать АП-сайт, не стимулировали расщепление субстрата THF:dCyd АП-эндонуклеазой АРЕХ1, а лишь конкурировали с ней за связывание субстрата, что проявлялось в резком снижении активности АРЕХ1 при высоких концентрациях NEIL1 и NEIL2. Такая же картина наблюдалась в присутствии OGG1 при замене субстрата THF:dCyd на дцОДН THF:dAdo. Не наблюдалось расщепления ДНК ферментом АРЕХ1 как в отсутствие, так и в присутствии OGG1 при замене субстрата THF:dCyd на дцОДН, содержащий пару Cyt с карбоциклическим аналогом 8-oxodGuo, который также эффективно связывается, но не расщепляется ферментом OGG1 (данные не проиллюстрированы). 40 X
Стимуляция активности АРЕХ1 ферментом OGG1. Показана зависимость глубины расщепления [Р] F23//C23 субстрата ферментом АРЕХ1 в присутствии различных концентраций OGG1. Приведены средние значения и стандартные отклонения 3 независимых экспериментов.
Для более детального исследования влияния OGG1 на активность АРЕХ1 были определены константы стационарной кинетики Км и kcat расщепления субстрата THF:dCyd ферментом АРЕХ1 в присутствии и в отсутствие OGG1 (табл. 7). Наличие OGG1 приводило к увеличению &cat в 4 раза (с 16 мин.-1 до 64 мин.-1), однако значение при этом Км также возрастало (с 12±5нМ в отсутствие OGG1 до 100±30нМ в присутствии OGG1). Поскольку при наблюдении колоколообразной зависимости расщепления субстрата THF:dCyd АП-эндонуклеазой концентрация субстрата составляла 50 нМ, влияние присутствия OGG1 на ксЛ в этих условиях служит определяющим фактором стимуляции гидролитической активности АРЕХ1 (расчет соотношения скоростей реакции в присутствие и в отсутствие OGG1 по уравнению Михаэлиса-Ментен дает значение стимуляции в 1,6 раза, что хорошо совпадает с наблюдаемыми результатами). Возможно, что OGG1, связываясь с дцОДН THF:dCyd, вносит в молекулу ДНК конформационные изменения, которые распознаются ферментом АРЕХ1 и приводят к увеличению скорости реакции, но одновременно снижают Км- При избыточных концентрациях OGG1 ДНК-гликозилаза может конкурировать с АРЕХ1 за связывание с неспецифической ДНК и таким образом снижать общую активность АП-эндонуклеазы.
Как описано ранее, OGG1 характеризуется медленным высвобождением из комплекса с продуктом реакции, АП-сайтом. В ходе реакции на начальном этапе быстро образуется продукт с последующим медленным накоплением, что свидетельствует о высоком сродстве фермента к образующемуся АП-сайту. Анализ кривой накопления продукта расщепления 8-oxoGua:Cyt содержащего субстрата ферментом OGG1 показывает наличие фазы всплеска, амплитуда которой пропорциональна концентрации активной формы фермента в реакционной смеси. Для анализа специфичности стимуляции OGG1 белком АРЕХ1 было исследовано расщепление ферментом OGG1 в присутствии АРЕХ1 ряда ОДН-субстратов, содержащих разные модифицированные основания (рис. 22) и пары оснований.
При расщеплении ферментом OGG1 дцОДН-субстрата 8-oxoGua:Ade в отсутствие АРЕХ1 на кинетических кривых не наблюдалось фазы всплеска (рис. 23Б), что свидетельствует о меньшей скорости химической стадии реакции по сравнению с расщеплением субстрата 8-oxoGua:Cyt (рис. 23А), или о более быстром высвобождении АП-сайта из комплекса с ферментом при наличии основания Ade напротив поврежденного звена. Стационарная скорость реакции, определенная из линейной фазы кривых накопления продукта для OGG1 в отсутствие АРЕХ1, больше для субстрата 8 oxoGua:Ade, чем для 8-oxoGua:Cyt (табл. 8), однако эти скорости нельзя сравнивать непосредственно, так как для каждого из субстратов они лимитируются различными стадиями — высвобождением продукта для субстрата 8-oxoGua:Cyt и разрывом N-гликозидной связи для субстрата 8-oxoGua:Ade. Фермент АРЕХ1 более эффективно стимулировал расщепление ДНК-гликозилазой OGG1 субстрата 8-oxoGua:Cyt, чем субстрата 8-oxoGua:Ade (табл. 8, рис. 23А, Б). В целом 8-oxoGua:Cyt был лучшим субстратом для фермента OGG1, чем 8-oxoGua:Ade, как в присутствии, так и в отсутствие АРЕХ1. Более эффективная стимуляция АП-эндонуклеазой АРЕХ1 активности OGG1 по отношению к субстрату 8-oxoGua:Cyt, чем к 8-oxoGua:Ade, может вносить дополнительный вклад в имеющую большое биологическое значение С/А-специфичность OGG1.
Расщепление АП-эндонуклеазой АРЕХ1 субстрата, содержащего аналог АП-сайта, в присутствии OGG1
Регуляция белок-белковых взаимодействий посттрансляционной модификацией, и в частности фосфорилированием, представляет собой один из широко распространенных в природе механизмов регуляции функционирования белков. Выше было показано, что АП-эндонуклеаза АРЕХ1 стимулирует активность фермента OGG1 дикого типа преимущественно на корректных субстратах. В связи с этим представлял интерес вопрос о том, может ли фосфорилирование OGG1 влиять на способность АРЕХ1 стимулировать активность этой ДНК-гликозилазы.
В настоящей работе была исследована активность фосфомиметических форм OGG1 в присутствии и в отсутствие АРЕХ1. Для всех форм способность к стимуляции ферментом АРЕХ1 была значительно снижена по сравнению с OGG1 дикого типа (рис. 32). В случае OGG1-S326E, OGG1-S231E и OGG1-S232E наблюдалось умеренная стимуляция, в то время как в случае OGG1-S280E и OGG1-S321E/S232E активности ДНК-гликозилазы в присутствии и в отсутствие OGG1 практически не отличались. 4D
В литературе сообщалось, что способность АП-эндонуклеазы АРЕХ1 стимулировать активность формы OGG1-S326C значительно снижена по сравнению со стимуляцией OGG1 дикого типа [242]. Как показывают наши данные, такая же картина характерна и для ряда других мутантных форм OGG1. Поскольку остатки S231, S232, S280 и S326 расположены на поверхности белковой глобулы OGG1 в разных местах, маловероятно, что все исследованные мутации непосредственно нарушают поверхность взаимодействия OGG1 и АРЕХ1. Возможно, что замена этих остатков приводит к изменению структуры каких-то промежуточных комплексов, имеющих место при вытеснении белка OGG1 из комплекса с продуктом реакции. Можно также отметить, что в случае OGG1-S280E, OGG1-S326E и, вероятно, OGG1-S231E фаза всплеска практически не выражена (рис. 32), что, как и в случае с расщеплением ферментом OGG1 плохих субстратов (разд. 4.2.8), может свидетельствовать о лимитировании скорости не процессом высвобождения продукта, а более ранними стадиями реакции.
Замена аминокислотных остатков в полипептидах при мутации или их ковалентная посттрансляционная модификация может иметь большое влияние на функционирование белков. Несмотря на большой интерес к возможности ассоциации природных полиморфизмов ДНК-гликозилаз человека с различными заболеваниями, на сегодня доступно очень мало биохимических данных о функциональности природных вариантов этих ферментов. Активность и специфичность изученных в настоящей работе форм OGG1-A288V, OGG1-D322N и OGG1-S326C по некоторым параметрам отличались от активности и специфичности фермента дикого типа. Так, при использовании ОДН-субстратов была выявлена повышенная С/А-специфичность фермента OGG1-D322N на фоне его в целом сниженной активности; то же, но в менее выраженной форме наблюдалось для фермента OGG1-S326C. При переходе к высокомолекулярной субстратной ДНК способность OGG1-D322N и в особенности OGG1-S326C выщеплять основания 8-oxoGua ухудшалась по сравнению с ферментом дикого типа значительно сильнее, чем при использовании ОДН-субстратов. Таким образом, функциональность этих двух природных вариантов фермента in vivo может зависеть от уровня окислительных повреждений: при необходимости более надежно различать пары 8-oxoGua:Cyt и 8-oxoGua:Ade в ходе обычного функционирования GO-системы OGG1-D322N и OGG1-S326C могут обеспечивать повышенную надежность, в то время как при необходимости репарации большого количества повреждений они могут быть менее функциональны из-за в целом сниженной активности.
Кажущееся снижение функциональности было заметно и при анализе фофомиметических форм белка OGG1, что особенно ярко проявлялось в снижении их активности по отношению к 8-oxoGua в высокомолекулярной ДНК и в потере способности стимулироваться ферментом АРЕХ1. Следует отметить, что фосфорилирование OGG1 in vivo и in vitro было описано в литературе, однако ни в одном из этих случаев не удалось определить сайта фосфорилирования [193, 194]. Вероятность фосфорилирования по предсказанным остаткам Ser весьма высока, однако не исключено, что фосфорилирование может протекать и по другим остаткам Ser/Thr в молекуле OGG1. Лишь идентификация фосфорилируемых остатков биохимическими методами позволит однозначно установить влияние этого процесса на активность и субстратную специфичность OGG1.
При наличии подгрупп ферментов с разной субстратной специфичностью в пределах одного структурного семейства важную роль в определении специфичности обычно играют мотивы, характерные только для одной из подгрупп. Например, белки Fpg и Nei принадлежат к одному семейству, и уровень их гомологии достаточно высок. Однако сравнение последовательностей и структур этих ферментов из разных видов позволяет выявить элементы, которые могут вносить вклад в субстратную специфичность Fpg и Nei (рис. 33). Для белков Fpg такими специфическими элементами являются N-концевая консенсусная последовательность Pro-Glu-Leu-Pro-Glu (специфический элемент I), интеркалирующая триада Met-73-Arg-108-Phe-l 10 (II, здесь и далее нумерация соответствует позициям в белке Е. coli), остаток Lys-155 (III) и остаток Ala (или другой малый незаряженный аминокислотный остаток) в позиции 171 (IV), в то время как для белков Nei в число специфических элементов входят N-концевая консенсусная последовательность Pro-Glu-Gly (специфический элемент I), интеркалирующая триада Gln-69-Leu-70yr-71 (II), остаток Ala (или другой малый незаряженный аминокислотный остаток) в позиции 155 (III) и остаток Arg в позиции 171 (IV) [159, 162]. В связи с этим представляет интерес вопрос, насколько сохранность этих элементов важна для определения спектра оснований, выщепляемых белками семейства Fpg/Nei, а также для других функций этих ферментов. Хорошую систему для анализа такого рода представляют собой гомологи Fpg и Nei из микобактерий, геномы которых обычно содержат несколько генов, гомологичных генами fpg и net Е. coli.
