Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
Кинетические исследования механизмов ферментативных реакций в предстационарных условиях
1.1. ДНК- и РНК-полимеразы 14
1.1.1. ДНК-полимераза 1Escherichia coli (фрагмент Кленова) 17
1.1.2. РНК-полимераза бактериофага Т7 26
1.1.3. ДНК-полимеразы бактериофагов RB69 и Т4 35
1.1.4. ДНК-полимераза В 41
1.2. ДНК-лигаза бактериофага Т4 48
1.3. ДНК-метилтрансферазы 55
1.3.1. ДНК-метилтрансфераза Dam бактериофага Т4 56
1.3.2. ДНК-метилтрансфераза EcoRI 60
1.4. ДНК-гликозилазы 64
1.4.1. Урацил-ДНК-гликозилаза 67
1.4.2. Аденин-ДНК-гликозилаза 72
1.5. Заключение 76
2. Экспериментальная часть 77
3. Результаты и их обсуждение
Изучение предстационарной кинетики и конформационнои динамики оксогуанин-ДНК-гликозилаз Fpg из Е. coli и Oggl человека с ДНК
3.1. Формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза Е. coli Fpg 90
3.1.1. Неспецифический ДНК-лиганд 95
3.1.2. F-лиганд 98
3.1.3. АР-субстрат 102
3.1.4. oxoG-субстрат 105
3.1.5. Влияние основания, расположенного напротив повреждения, на взаимодействие фермента с oxoG-субстратом
3.1.6. dHU-субстрат 119
3.1.7. Заключение по разделу 3.1 12
3.2. 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза человека hOggl 125
3.2.1. Неспецифический ДНК-лиганд 128
3.2.2. F-лиганд 129
3.2.3. АР-субстрат 130
3.2.4. oxoG-субстрат 132
3.2.5. Влияние основания, расположенного напротив повреждения, на взаимодействие фермента с oxoG-субстратом
3.2.6. Влияние 8-бромгуанина на взаимодействие фермента hOggl с АР- и oxoG-субстратами
3.2.7. Взаимодействие фермента hOggl с АР-эндонуклеазой человека (Apel)
3.2.8. Заключение по разделу 3.2 150
Заключение 153
Выводы 156
Список литературы 157
Благодарности 178
- ДНК-полимераза 1Escherichia coli (фрагмент Кленова)
- ДНК-метилтрансфераза Dam бактериофага Т4
- Влияние основания, расположенного напротив повреждения, на взаимодействие фермента с oxoG-субстратом
- Влияние основания, расположенного напротив повреждения, на взаимодействие фермента с oxoG-субстратом
Введение к работе
Клеточная ДНК постоянно подвергается воздействию экзогенных и эндогенных агентов, которые являются причиной различных модификаций в геноме. Эти повреждения ДНК обладают цитотоксическим либо мутагенным эффектом и, как следствие, вызывают гибель или перерождение клеток. В ходе эволюции образовалась специализированная система защиты клетки от повреждений - система репарации ДНК. Системы репарации присутствуют во всех живых организмах от бактерий до человека и являются высоко консервативными [1-3]. Ферменты репарации ДНК играют важную роль в обеспечении функций ДНК и жизни клетки. С каждым днем увеличивается число примеров, иллюстрирующих важность репарации ДНК в предотвращении различных заболеваний [4-8]. Поэтому изучение этих ферментов в последнее время вызывает особый интерес. Знания о механизмах и особенностях действия ферментов репарации могут приблизить человечество к решению проблем раннего старения и лечения болезней, связанных с высоким уровнем генерации мутаций в геноме.
Многие поврежденные основания лишь незначительно отличаются по структуре от нормальных оснований и практически не нарушают строения двойной спирали ДНК. Тем не менее, ферменты репарации находят повреждения среди миллионов немодифицированных оснований. Одним из часто встречающихся повреждений азотистых оснований ДНК является 8-оксогуанин. Остаток 8-оксогуанина отличается от немодифицированного гуанина только двумя дополнительными атомами: атомом кислорода при С-8 и атомом водорода при N-7. Данное повреждение удаляется из ДНК 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазами. Эти ферменты обладают двумя типами каталитической активности: N-гликозилазной и АР-лиазной. Несмотря на большой интерес к выяснению природы высокой специфичности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз, многие аспекты этой проблемы до сих пор оставались неизученными. В качестве одной из гипотез, объясняющих высокую специфичность данных ферментов к 8-оксогуанину, было предположение о том, что ферменты претерпевают ряд конформационных изменений, которые способствуют образованию специфических взаимодействий с ДНК-субстратом. Такие изменения структуры фермента и ДНК-субстрата могут, в принципе, протекать как через последовательность стадий с образованием множества промежуточных состояний фермент-субстратного комплекса, так и через «согласованный» механизм с одновременным перемещением в пространстве отдельных групп и атомов фермента и субстрата для достижения каталитически компетентного состояния [9,10].
К началу выполнения настоящей работы была известна лишь структура формамидопиримидин-ДНК-гликозилазы (Fpg) из Thermus thermopholus в свободном состоянии [11] и отсутствовали данные о том, какие изменения претерпевают 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы при образовании фермент-субстратных комплексов. Не было также данных об изменениях конформаций ферментов в ходе протекания каталитических стадий. Кинетические исследования процессов репарации ДНК, были проведены преимущественно в стационарных условиях, не позволяющих регистрировать быстропротекающие стадии узнавания ферментами специфических сайтов в цепи ДНК. Кроме того, анализ данных проводился на основе классической двухстадийной кинетической схемы Михаэлиса-Ментен [12-14], не учитывающей возможности образования множества промежуточных фермент-субстратных комплексов.
Цель настоящей работы состояла в том, чтобы установить роль конформационной динамики ферментов и ДНК-субстратов в протекании ферментативных реакций с участием 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз из Е. coli (Fpg) и человека (hOggl) и изучить предстационарную кинетику этих процессов.
Задачи настоящего исследования состояли в следующем:
• методом «остановленной струи» с регистрацией изменений интенсивности флуоресценции остатков Тгр в ферментах и 2-аминопурина в ДНК обнаружить конформационные переходы в молекулах ферментов и ДНК-субстратов;
• при протекании процессов в условиях «одного оборота фермента» изучить детальные кинетические механизмы;
• с использованием постадийного усложнения структуры ДНК-субстрата определить молекулярную природу отдельных стадий;
• выяснить природу стадий, обеспечивающих высокую специфичность узнавания ферментами поврежденного участка в молекуле ДНК. Конформационные переходы в ходе каталитических циклов
регистрировались по изменению интенсивности флуоресценции остатков триптофана (Тгр) в ферментах и вводимых в ДНК остатков 2-аминопурина (2-аРи) в условиях «одного оборота фермента» [15, 16]. Поскольку узнавание субстратов и их превращение протекало в миллисекундном и секундном диапазонах, то в работе использовали метод остановленной струи («stopped-flow»). Для выяснения механизма узнавания поврежденного основания в ДНК был использован способ постадийного усложнения структуры ДНК-субстратов. Переход от неспецифического лиганда (наиболее простые взаимодействия) к специфическим субстратам (полный цикл ферментативных реакций), содержащим остаток 8-оксогуанина или образующийся из него в ходе ферментативной реакции в качестве интермедиата апурин/апиримидиновый сайт, позволил установить последовательность конформационных переходов в реагирующих молекулах и понять их природу. Чтобы выяснить, на какой из стадий ферментативного процесса происходит отбор специфического субстрата, то есть, как происходит узнавание поврежденного участка среди множества неповрежденных нуклеотидов, в работе исследовано поведение мутантной формы фермента Fpg Fl 10W, содержащей замену остатка Phe-110, принимающего участие в узнавании субстрата, на флуоресцирующий остаток Тгр. Кроме того, были исследованы субстраты, содержащие напротив остатка 8-оксогуанина в соседней цепи некомплементарные нуклеотиды A, G и Т.
Полученные в работе данные о кинетическом механизме и динамике конформационных превращений ферментов Fpg и hOggl при взаимодействии с ДНК-субстратами были подтверждены данными рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии [17-19], появившимися в ходе выполнения исследования в последние годы. Сопоставление конформационных изменений ферментов и ДНК-субстратов с данными о структурах свободных ферментов, их комплексов с субстратами и интермедиатами позволило построить молекулярно-кинетические модели процессов взаимодействия ферментов Fpg и hOggl с ДНК-субстратами. Полученные модели позволили связать конформационные переходы взаимодействующих молекул с элементарными актами ферментативных процессов. Предложены детальные кинетические модели взаимодействия ферментов и ДНК-субстратов и определены константы скорости отдельных стадий, входящих в эти модели. Установлены стадии ферментативных процессов, которые вносят наибольший вклад в обеспечение специфичности ферментов к ДНК-субстратам. Для фермента hOggl подтверждено и кинетически охарактеризовано участие продукта первой каталитической стадии (свободного основания oxoG) в качестве кофактора на последующей стадии - реакции р-элиминирования - приводящей к разрыву рибозофосфатного остова.
ДНК-полимераза 1Escherichia coli (фрагмент Кленова)
При избытке одного из реагентов данную систему уравнений можно проинтегрировать. Например, в случае So » Ео, можно считать концентрацию субстрата постоянной и заменить бимолекулярный нелинейный член &i[E][S] на псевдомономолекулярный &i[E][S]o, линейно зависящий только от одной переменной концентрации. При этом получается система n +1 линейных дифференциальных уравнений, которая легко решается стандартным способом путем нахождения корней характеристического уравнения степени п, собственные значения которого позволяют рассчитать значения всех констант скорости [34]. Поскольку процесс протекает в условиях множественного оборота фермента, то после протекания реакции в предстациоиарном режиме по истечении времени t » т (т - характеристическое время самой медленной стадии), реакция переходит в стационарный режим.
В условиях одного оборота фермента (Ео So) необходимо решать систему дифференциальных уравнений (1)-(6) без дополнительных упрощений, то есть численно. Однако в этом случае удается зарегистрировать все фермент-субстратные комплексы и интермедиаты реакции и охарактеризовать все стадии ферментативного процесса.
Таким образом, методы предстационарной кинетики позволяют детально проанализировать механизм ферментативной реакции. Хотя этот подход более сложен технически и при его использовании требуется трудоемкий математический анализ кинетических кривых, изучение ферментативных реакций в предстационарных условиях позволяет в значительной степени углубить знания о механизмах действия ферментов [35,36].
При изучении биологических объектов используются такие методы предстационарной кинетики, как метод прерывания реакции («quench-flow») и метод остановленной струи («stopped-flow»), которые могут быть использованы для большого круга ферментов и позволяют минимизировать объемы и количество реагирующих веществ. В основе обоих методов лежит быстрое, в течение 1 мс, смешивание взаимодействующих веществ и остановка потока реакционной смеси. Прерывание реакции в методе «quench-flow» происходит либо при быстром замораживании/нагревании реакционной смеси, либо при смешивании с веществами, блокирующими протекание реакции. Анализ состава реакционной смеси на различных временах от начала реакции в интервале времени порядка 1-1000 мс дает возможность построить кинетические зависимости для интермедиатов и конечных продуктов. В методе остановленной струи изменение концентрации веществ в ходе химической реакции регистрируется, как правило, оптическими методами, например, по изменению оптического поглощения или интенсивности флуоресценции раствора.
Хорошо известно, что триптофан (Тгр) является наиболее интенсивно флуоресцирующей аминокислотой [15], и примерно 90% всей флуоресценции белков обычно обусловлено его присутствием. Максимумы испускания флуоресценции белков зависят от локального окружения остатков Тгр в молекуле полипептида. Например, сдвиг в коротковолновую область интерпретируют, как результат экранирования триптофаповых остатков от водной фазы. В то же время процесс денатурации приводит к длинноволновому сдвигу в спектре испускания флуоресценции и, приблизительно, к одной и той же величине максимума в спектре испускания всех белков. Свойства Тгр позволяют использовать его как высокочувствительный флуоресцентный маркер конформационных изменений в молекулах белков [37-39]. Однако необходимо иметь в виду, что большинство белков содержит несколько остатков Тгр, находящихся в различном окружении, поэтому спектральные свойства каждого из них могут различаться.
Флуоресцентные свойства макромолекул часто не позволяют получать из эксперимента желаемую информацию. В таком случае используют флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по отношению к исследуемой системе, но имеют лучшие спектральные свойства. Например, при исследовании ферментативных реакций с участием нуклеиновых кислот используют аналоги нуклеотидов, которые флуоресцируют и при этом сохраняют способность к образованию водородных связей с модифицированными нуклеотидами. Конформационные переходы в молекуле ДНК, как правило, регистрируют по изменению интенсивности флуоресценции 2-аминопурина (2-аРи). Остаток 2-аРи является одним из самых привлекательных флуоресцирующих аналогов азотистых оснований. В паре 2-аРи/Т происходит образование двух водородных связей, как и в случае с аденином, в то же время в паре 2-аРи/С возможно образование как одной, так и двух водородных связей [40, 41]. Таким образом, встраивание остатка 2-аРи напротив оснований С и Т приводит к минимальным нарушениям структуры ДНК. Известно, что интенсивность флуоресценции 2-аРи очень сильно зависит от внешнего окружения. Например, при наличии стэкинг-взаимодействия между соседними основаниями, а также при образовании двухспиральных структур ДНК происходит резкое уменьшение интенсивности флуоресценции остатков 2-аРи [42]. Чувствительность характеристик флуоресценции 2-аРи к конформационным изменениям, происходящим в двойной спирали ДНК, способствует использованию именно этого маркера при исследовании взаимодействий ферментов с ДНК. 2-Аминопурин применяли для изучения кинетических характеристик различных ферментов, взаимодействующих с ДНК, например фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I [43], ДНК-полимеразы Р и X [37, 44], РНК-полимеразы бактериофага Т7 [45], ДНК-полимеразы бактериофагов Т4 и RB69 [46, 47], ДНК-метилтрансфераз [48], ДНК-гликозилаз [39] и других ферментов.
В настоящем обзоре рассмотрены результаты кинетических исследований ферментов, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами в предстационарных условиях. Выбор конкретных ферментов, вошедших в обзор литературы, основывался на нескольких факторах: (1) это ферменты, взаимодействующие с нуклеиновыми кислотами; (2) для этих ферментов или их ближайших гомологов известны кристаллические структуры в свободном состоянии и/или в комплексе с субстратом. Несмотря на огромное количество работ посвященных ферментам, взаимодействующим с ДНК, наличие перечисленных ограничений приводит к конечному числу рассматриваемых примеров. В обзоре представлены некоторые ДНК- и РНК-полимеразы, рассмотрены также представители ДНК-лигаз, ДНК метилтрансфераз и ДНК-гликозилаз. Особое внимание направлено на связь структуры взаимодействующих молекул и конформационных изменений с кинетическим механизмом реакции и на выяснение роли отдельных элементарных стадий в протекании ферментативного процесса.
ДНК-метилтрансфераза Dam бактериофага Т4
Кроме того, было показано, что после образования ковалентного комплекса фермент-АМР аденилированный фермент связывается с ДНК и осуществляет реакцию трансаденилирования с константой скорости 1,0 ± 0,1 мин 1. После этого происходит лигирование концов ДНК с константой скорости 34,3 ± 0,3 мин"1.
Таким образом, несмотря на отсутствие структурных данных для ДНК-лигазы бактериофага Т4, в результате проведенных кинетических исследований был установлен механизм процесса аденилирования фермента. Показано, что ферментативный процесс может протекать через образование ряда комплексов с различным содержанием ионов Mg2+. Согласно полученным данным, был предложен наиболее вероятный путь реакции.
Кроме того, эксперименты, проведенные в условиях стационарной кинетики, показали, что дальнейшие стадии реакции лигирования (трансаденилирование и лигирование концов ДНК), возможно, протекают через образование нескольких переходных комплексов фермент»ДНК. Существование таких комплексов может быть объяснено высокой дискриминирующей способностью ДНК-лигазы в отношении мисматчей в области разрыва ДНК.
Метилирование ДНК тесно связано с репликацией и репарацией ДНК, контролем экспрессии генов и канцерогенезом [116]. У прокариот ДНК-метилтрансферазы (МТазы) обычно служат для защиты генома от действия эндогенных гомологичных рестриктаз, входя в состав систем рестрикции-модификации [117,118].
Данный тип химической модификации ДНК реализуют ДНК-метилтрансферазы - семейство ферментов, катализирующих перенос метальной группы от S-аденозил-Ь-метионина (AdoMet) на остатки цитозина либо аденина, встречающиеся в специфичной для каждого фермента последовательности ДНК. Выяснение молекулярного механизма действия МТаз представляет особый интерес в связи с важностью биологических функций метилирования и актуальностью поиска путей его регуляции.
На сегодняшний день достигнут значительный прогресс в понимании механизмов ферментативного метилирования ДНК. Выявлены и функционально охарактеризованы консервативные участки первичных структур МТаз [119]. Методами рентгеноструктурного анализа получены третичные структуры для ряда ферментов [120-122]. Показано, что при взаимодействии МТаз с ДНК происходит изгибание рибозо-фосфатного остова ДНК и выворачивание метилируемого основания во внеспиральное положение. В результате такой деформации метилируемое основание попадает в каталитический центр МТазы, где происходит его сближение с молекулой AdoMet. Химический механизм катализа установлен для (С5-цитозин)- [123] и (1Мб-аденин)-МТаз [124,125] и в общих чертах охарактеризован для (М4-цитозин)-МТаз.
К настоящему времени для ряда МТаз предложены в большей или меньшей степени детализированные кинетические схемы реакций. В основе всех схем лежит последовательный механизм связывания субстратов с образованием каталитически-активного тройного комплекса. Однако порядок связывания субстратов, присутствие равновесий между различными формами фермента, лимитирующие стадии и характер ингибирования реакции ее продуктами отличаются для различных представителей метилтрансфераз [126-130].
В следующих разделах рассмотрены основные результаты исследований кинетического механизма реакции метилирования ДНК, катализируемой ДНК- метилтрансферазой Dam бактериофага Т4 (T4Dam) и ДНК-метилтрансферазой ЕсоШ.
ДНК-метилтрансфераза Dam бактериофага Т4 ДНК-метилтрансфераза Dam катализирует метилирование экзоциклической г-аминогруппы аденина в палиндромных последовательностях GATC. Метилирование ДНК включает образование трехкомпонентного комплекса с ДНК и AdoMet, оптимизацию конформации взаимодействующих молекул для переноса метальной группы, каталитическую стадию реакции и освобождение продуктов реакции. Химический механизм реакции метилирования был установлен достаточно давно и представляет собой прямой перенос метилыюй группы на атом азота экзоциклической аминогруппы аденина по механизму SN2 [124,125].
Многообразие и важность функций биологического метилирования ДНК делают актуальной задачу глубокого понимания механизма ферментативного катализа реакции. Кинетический механизм ферментативного процесса был предложен в 2002 году [48, 129]. Необходимо отметить, что этому предшествовал цикл работ Э.Г. Малыгина и сотр., в результате которых были получены данные, характеризующие взаимодействие фермента с AdoMet и ДНК-субстратами, содержащими различные модификации в последовательности GATC [131-134]. В результате полученных данных было показано, что перенос метилыюй группы в N6-положение аденина Т40ат-метилтрансферазой можно считать необратимым [129]. Кроме того, как показано на Рис. 37 для реакции метилирования канонического дуплекса, содержащего последовательность GATC и его полуметилированной формы характерен «всплеск» образования 3Н-меченного ДНК-продукта. Величины «всплеска» для обоих субстратов близки к концентрации фермента в реакционной смеси. Отсюда следует, что химическая стадия реакции (перенос метильной группы) происходит быстро, а лимитирование реакции идет на стадиях отщепления продуктов. Действительно, константа скорости переноса метильной группы, определенная методом прерывания реакции «quench-flow» равна 0,56 с 1, в то время как константа скорости лимитирующей стадии была равна 0,015 с"1 [135].
Влияние основания, расположенного напротив повреждения, на взаимодействие фермента с oxoG-субстратом
Регистрацию оптических кривых плавления дуплексов олигонуклеотидов, входящих в продукт ферментативной реакции, проводили с помощью специального комплекса, основанного на оптическом блоке хроматографа «Милихром» («Научприбор», Россия). Исследуемые образцы содержали эквимолярные количества олигонуклеотидов (С), (5nt) и (6nt) с концентрацией каждого 1,3x10"5 М. Кривые термической денатурации состояли из не менее 600 точек, зарегистрированных с частотой 10 точек/С. Нагревание и охлаждение образцов проводили со скоростью не более 1 С/мин. Поправка на температурное расширение воды была введена при обработке данных. Регистрацию изменений оптической плотности проводили на четырех длинах волн. Время интегрирования на одной длине волны не превышало 1,2 с.
Фермент hOggl был выделен из линии клеток Е. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой рЕТ-15Ь, несущей вставку hOgglNHis, продуктом экспрессии которой был полноразмерный белок hOggl, присоединенный к гексагистидиновой последовательности через 13-звенный олигопептидный линкер.
Культуру клеток Е. coli BL21(DE3) выращивали в среде 2xYT (2 л), содержащей 50 мкг/мл ампицилина, при 37 С до оптической плотности среды 0,6-0,7 на длине волны 600 нм. После этого температуру понижали до 30 С и индуцировали транскрипцию вставки hOgglNHis добавлением изопропил-P-D-тиогалактопиранозида до 0,2 мМ. После индукции культуру инкубировали в течение 12 ч. Затем клетки осаждали центрифугированием (10 мин при 12 000 об./мин) и готовили суспензию клеток в 40 мл лизис-буфера (100 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). К суспензии добавляли фенилметилсульфонилфторид (1 мМ) и инкубировали с лизоцимом (0,5 мг/мл) в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого добавляли NaCl (до 1 М) и инкубировали 30 мин при перемешивании на магнитной мешалке. Для количественного лизиса клеток полученную суспензию обрабатывали ультразвуком (10 импульсов по 30 с, 22 ГГц). После каждого импульса суспензию клеток охлаждали в ванне со льдом в течение
Полученный клеточный лизат центрифугировали (20 мин при 12 000 об./мин, 4 С), супернатант разбавляли в 4 раза буферным раствором Ah0ggl (25 мМ фосфат калия, рН 7,4) и наносили на катионообменную колонку I (50 мл, Fractogel EMD SO-3, Merck). После этого колонку промывали 120 мл буферного раствора Bh0ggl (25 мМ фосфат калия, рН 7,4, 200 мМ NaCl). Затем катионообменную колонку I соединяли с хелатирующей колонкой II, несущей катионы Ni2+ (5 мл, НіТгар Chelating, Pharmacia) и элюировали белок 100 мл буферного раствора Bh0ggl (25 мМ фосфат калия, рН 7,4, 1 М NaCl). Хелатирующую колонку II отсоединяли и промывали 25 мл буферного раствора rh0ggl (25 мМ фосфат калия, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 50 мМ имидазол). Белок hOggl, содержащий гексагистидиновый олигопептид, элюировали 25 мл буферного раствора ДЬЕ81 (25 мМ фосфат калия, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол). Элюат разбавляли в 10 раз буферным раствором Ah0ggl и наносили на катионообменную колонку III (5 мл, HiTrap Heparin, Pharmacia). Хроматографию проводили в буферном растворе Ah0ggl и линейном градиенте 200 — 800 мМ NaCl, оптическую плотность раствора регистрировали на длине волны 280 нм. Степень чистоты белка hOggl определяли с помощью гель-электрофореза. Фракции, содержащие белок hOggl, диализовали в буфере 25 мМ фосфат калия, рН 7,4, 400 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреит, 50 % глицерин и хранили при -20 С.
Фермент Fpg был выделен из линии клеток Е. coli B834(DE3), трансформированных плазмидой рЕТ-13а, несущей ген фермента Fpg.
Культуру клеток Е. coli B834(DE3) выращивали в среде 2 YT (1 л), содержащей 25 мкг/мл канамицина, при 37 С до оптической плотности среды 0,6-0,7 на длине волны 600 нм. После добавления изопропил-Р-Б-тиогалактопиранозида до 50 мкМ культуру инкубировали в течение 6 ч при 37 С. Затем клетки осаждали и лизировали, как описано для фермента hOggl. Полученную после лизиса суспензию центрифугировали (20 мин при 12 000 об./мин, 4 С), супернатант собирали и инкубировали с 0,01 % полиэтиленимином в течение 20 мин на льду. Суспензию центрифугировали (20 мин при 12 000 об./мин, 4 С), супернатант разбавляли в 4 раза буферным раствором AFpg (20 мМ HEPES-NaOH, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреит). Полученный раствор наносили на катионообменную колонку I (50 мл, Fractogel EMD SO 3, Merck), затем колонку промывали 100 мл буферного раствора AFpg. После этого фермент элюировали с колонки 100 мл буферного раствора Б pg (20 мМ HEPES-NaOH, рН 7,5,1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреит, 1 М NaCl). Собранную фракцию разбавляли в 5 раз буферным раствором AFpg и наносили на катионообменную колонку III (5 мл, HiTrap Heparin, Pharmacia). Хроматографию проводили в буферном растворе AFpg и линейном градиенте 200 — 800 мМ NaCl, оптическую плотность раствора регистрировали на длине волны 280 нм. Степень чистоты белка Fpg определяли с помощью гель-электрофореза. Фракции, содержащие белок Fpg, диализовали в буфере 20 мМ HEPES-NaOH, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреит, 250 мМ NaCl, 50 % глицерин и хранили при -20 С.
Концентрацию ферментов определяли оптически на спектрофотометре Shimadzu UV 2100. Для этого регистрировали спектр оптического поглощения белка в буфере. В качестве раствора сравнения использовали буферный раствор. Коэффициент молярной экстинкции белков на длине волны 280 нм был равен 68420 М см"1 для hOggl и 32100 М см 1 для Fpg [197].
Долю активного фермента определяли с помощью метода боргидридного восстановления основания Шиффа [198], образующегося между Г-атомом углерода поврежденного нуклеотида и каталитической группой в активном центре фермента (аминогруппа лизина Lys-249 для hOggl и иминогруппа пролина Рго-1 для Fpg). Для этого реакционную смесь (Юмкл), содержащую 2мкМ фермента и различные концентрации oxoG/C-субстрата (0-5 мкМ) в буфере (25 мМ фосфат калия, рН 6,8, 100 мМ NaCl, 100 мМ NaBHj) выдерживали в течение 1 ч при 25 С. После этого реакционную смесь разделяли в 12 % ПААГ. Гель окрашивали красителем «coomassie brilliant blue» (Merck, Германия). Доля активного белка составляла 65 % и 90% для hOggl и Fpg, соответственно. Во всех экспериментах использовали концентрацию активного белка.
Для получения кинетических зависимостей степени расщепления субстрата от времени использовали следующую методику. К Юмкл буферного раствора, содержащего 32Р-меченый субстрат и эквимолярное количество комплементарной цепи, добавляли 10 мкл 2,0-4,0 мкМ фермента в том же буферном растворе. После быстрого перемешивания реакционной смеси из нее отбирали аликвоты объемом 2 мкл, которые помещали в предварительно подготовленные пробирки, содержащие 3 мкл раствора 7 М мочевины, 0,1 % бромфенолового синего и 0,1 % ксиленцианола. Все эксперименты с участием белков были выполнены в буферном растворе 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5,50 мМ КС1,1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреит, 9 % глицерин при 25 С.
Влияние основания, расположенного напротив повреждения, на взаимодействие фермента с oxoG-субстратом
Ранее в работе [225] методом остановленной струи с регистрацией флуоресценции Fpg-белка было установлено, что в ходе каталитического цикла происходят множественные изменения интенсивности флуоресценции, свидетельствующие о последовательных конформационных превращениях фермента.
Фермент Fpg содержит пять остатков триптофана (Рис. 50В) [219]. Три из них (Тгр-66, Тгр-113 и Тгр-115) расположены внутри глобулы белка и, скорее всего, не вызывают изменение интенсивности флуоресценции в процессе связывания ферментом ДНК и катализа. В то же время интенсивность флуоресценции остатков Тгр-34 и Тгр-156, расположенных на поверхности фермента, может изменяться при изменении конформации белка [225]. Остаток Тгр-34 расположен в N-концевом домене и находится в непосредственной близости от ДНК-связывающей канавки, образующейся в месте соединения N- и С-концевых доменов. Кроме того, атом углерода С2 этого остатка образует Ван дер Ваальсовое взаимодействие с 5 -атомом углерода третьего от повреждения нуклеотида с З -стороны. Действительно, в недавней работе [226] методом молекулярной динамики было показано, что при взаимодействии фермента и ДНК остаток Тгр-34 является наиболее подвижным среди всех Тгр. Второй остаток Тгр-156 расположен в С-концевом домене и входит в состав ДНК-связывающей структуры «спираль-двойной поворот-спираль» (H2tH). Эта область фермента также может претерпевать конформационные изменения в процессе связывания ДНК. Исходя из этого, наблюдаемые изменения интенсивности флуоресценции, вероятнее всего, отражают конформационные изменения в области соединения N- и С-концевых доменов и структуры H2tH. Другие изменения, которые могут происходить в функционально важных частях фермента, например, в области каталитического остатка Рго-1 или С-концевого цинкового пальца, не могут быть зарегистрированы по изменению интенсивности флуоресценции остатков триптофана.
Из рентгеноструктурных данных следует, что при образовании комплексов с ферментом структура ДНК, несущая повреждение, также изменяется [219, 223]. Анализ кристаллической структуры Fpg из Bacillus stearothermophilus с дуплексом ДНК, не содержащим модифицированных нуклеотидов [227], показал, что остаток Phe-114 (Phe-110 в Fpg Е. coli) интеркалирует в ДНК. Копформационные изменения ДНК в ходе каталитического цикла можно зарегистрировать, используя ДНК-субстраты, содержащие остаток 2-аРи - флуоресцентный аналог пуриновых оснований.
При регистрации динамики конформационных переходов в Fpg методом остановленной струи в работе [225] в качестве субстратов использовали короткие дуплексы олигодезоксирибопуклеотидов, содержащие остатки oxoG, АР, F и G. По данным стационарных кинетических исследований [228] положение поврежденного основания в олигонуклеотиде влияет на величину константы Михаэлиса Км. В ДНК-субстратах Км имеет наибольшее значение (60 нМ), если поврежденное основание расположено ближе к краю, и постепенно уменьшается при отдалении от края, достигая наименьшей величины уже в шестом положении (8 нМ). Дальнейшее изменение локализации остатка oxoG не приводило к изменению Км. Одновременно с этим каталитическая константа скорости увеличивается при отдалении от края, достигая максимальной величины к шестому положению. Эти данные свидетельствуют о том, что для эффективного связывания поврежденного участка ДНК и последующего катализа необходимо, чтобы с 3 - и 5 -сторон от повреждения располагались 5-6 нуклеотидов. Кроме того, данные рентгеноструктурного анализа [219, 223] также показывают, что контакты, образующиеся в комплексе фермент»ДНК, затрагивают участок ДНК длиной не более 10 пар нуклеотидов. Поэтому для предотвращения возможного скольжения фермента вдоль цепи ДНК при поиске специфического сайта в работе [225] были использованы 12-звенные дуплексы. Исследование проводилось в условиях «одного оборота фермента», что позволило наблюдать весь каталитический цикл, включая конечную стадию - распад комплекса фермента с продуктами разрыва цепи ДНК.
Настоящая работа представляет собой расширенное по сравнению с [225] исследование конформационной динамики и кинетического механизма ферментативного процесса с участием Fpg-белка. Как и в [225], для исследования различных стадий ферментативного процесса были использованы наборы ДНК-субстратов, включающие специфические и неспецифические сайты узнавания. В качестве специфических субстратов были использованы ДНК-дуплексы длиной 12 нуклеотидов, содержащие в одной из цепей либо остаток 8-оксогуанина (oxoG-субстрат), либо остаток 5,6-дигидроурацила (dHU-субстрат). Кроме того, были использованы дуплексы, содержащие либо АР-сайт (АР-субстрат), который является промежуточным продуктом реакции, либо аналог АР-сайта, содержащий вместо 2 -дезоксирибозы остаток 2-оксиметил-З-окси-тетрагидрофурана (F-лиганд). Дуплекс, несущий такой остаток, имеет все структурные особенности АР-субстрата, но не способен расщепляться под действием фермента, поскольку не содержит в Г-положении гидроксильпую группу. В качестве неспецифического субстрата использовали дуплекс олигонуклеотидов, не содержащих модифицированных нуклеозидов. Такой выбор субстратов был обусловлен тем, что при переходе от неспецифического лиганда к природному субстрату фермента происходит добавление дополнительных взаимодействий между реагирующими молекулами. Этот подход позволил разделить конформационные изменения в белке, свойственные взаимодействиям с определенными группами в субстрате в процессе его узнавания и расщепления. В то же время использование флуоресцирующих аналогов субстратов (содержащих остаток 2-аРи) позволило выделить конформационные изменения ДНК-субстратов при взаимодействии с ферментом
Кроме того, в работе был использован мутантный фермент Fpg F110W, несущий замену фенилаланина-110 на остаток флуоресцирующей аминокислоты -триптофана. Согласно рентгеноструктурным данным Рпе-110 участвует в процессе связывания субстрата и, следовательно, его замена на остаток триптофана позволила получить информацию о стадиях фермент-субстратного взаимодействия, протекающих в этом процессе.
Неспецифический ДНК-лиганд Взаимодействие Fpg с неспецифическим лигандом - дуплексом олигонуклеотидов, содержащем модифицированную Уотсон-Криковскую пару (G/C), приводит к образованию неспецифического комплекса. Согласно [229], после образования комплекса Fpg HK фермент скользит вдоль двойной спирали в поиске поврежденного нуклеотида. При этом, образующиеся контакты между атомами белка и ДНК, должны приводить к дискриминации участков ДНК, содержащих и не содержащих повреждение. В то же время, сеть образующихся связей должна быть достаточно лабильной, чтобы фермент был способен перемещаться вдоль ДНК.
Ранее в работе [225] были получены кинетические кривые для случая взаимодействия фермента Fpg с G/C-лигандом. Из Рис. 51 видно, что в течение 3 мс происходит уменьшение интенсивности флуоресценции остатков Тгр белка. Данный процесс был описан Схемой 21, включающей лишь одну обратимую стадию. Полученные в результате обработки кинетических кривых величины констант скорости реакций образования и распада комплекса Fpg ДНК приведены в Таблице 15. Значения полученных констант скорости свидетельствовали о том, что скорость наблюдаемого процесса близка к диффузионно-контролируемому пределу, для которого константа скорости прямой реакции лежит в диапазоне 10-10 М" хс" [230].
