Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Структура и механизм действия ОГДК 10
1.2. Кинетические и регуляторные свойства оксоглутарат-дегидрогеназных комплексов и их ОГД-компонентов из различных источников 25
ГЛАВА 2. Обоснование темы и методов исследования 36
ГЛАВА 3. Очистка и общие свойства оксоглутаратдегидро-геназного комплекса из коры надпочечников быка
3.1. Выделение и очистка ОГДК 48
3.2. Данные о гомогенности и субъединичном составе ОГДК 53
3.3. Оптимальные условия для протекания реакций ОГДК 55
3.4. Температурная зависимость, термостабильность ОГДК 57
ГЛАВА 4. Стационарная кинетика реакций, катализируемых ОГДК из коры надпочечников
4.1. Зависимость скорости реакции от концентрации 2-океоглутарата, КоА и НАД+. 61
4.2. Выяснение общего кинетического механизма ОГДК 62
4.3. Ингибирование ОГДК продуктами его реакций 66
4.4. Ионы фосфата и двухвалентных металлов в обеспечении активности ОГДК 72
4.5. Роль АТФ в регуляции оксоглутаратдегидрогеназного комплекса надпочечников 80
ГЛАВА 5. Расщепление ОГДК на индивидуальные ферменты .
5.1. Применение протеазы из почек быка для расщепления ОГДК 84
5.2. Протеолитическое действие папаина на оксоглутаратде-гидрогеназный комплекс из коры надпочечников быка 87
5.3. Хроматография на геле фосфата кальция в сочетании с лимитированным протеолизом папаином 91
ГЛАВА 6. Изучение кинетических и регуляторних свойств оксоглутаратдегидрогеназы в реакции с ДХФИФ
6.1. Особенности модельной реакции и ее кинетического механизма 95
6.2. Активирующее влияние АДФ на оксоглутаратдегидрогеназу 98
6.3. Способы десенсибилизации оксоглутаратдегидрогеназы к аденозиндифосфату 100
ГЛАВА 7. Кинетическое изучение компонента ОГДК
7.1. Прямая реакция, катализируемая изолированной и входящей в состав ОГДК липоамиддегидрогеназой, и ингибирова-ние ее НАДО 106
7.2. Обратная липоамиддегидрогеназная реакция 118
Обсуждение результатов и заключение 121
Выводы : 133
Литература 135
Документы о внедрении результатов исследования 159
- Обоснование темы и методов исследования
- Температурная зависимость, термостабильность ОГДК
- Выяснение общего кинетического механизма ОГДК
- Протеолитическое действие папаина на оксоглутаратде-гидрогеназный комплекс из коры надпочечников быка
Введение к работе
Окислительное декарбоксилирование 2-оксоглутарата является одним из важнейших этапов функционирования цикла Кребса и происходит в месте пересечения нескольких метаболических путей, так как 2-оксоглутарат является общим интермедиатом обмена белков и углеводов. Известно, что оксоглутаратдегидрогеназный комплекс , состоящий из трех ферментов, катализирует сложный процесс превращения 2-оксоглутарата. Оксоглутаратдегидрогена-за, являющаяся первым компонентом комплекса, при участии ТДФ осуществляет окислительное декарбоксилирование 2-оксоглутарата, в результате чего образуется сукцинил производное липоевой кислоты, ковалентно связанное с липоатсукцинилтрансферазой, которая катализирует перенос ацила на КоА. Липоамиддегидрогеназа окисляет образовавшуюся дигидролипоевую кислоту при участии ФДД и НДД+ .
Данная многоступенчатая реакция приводит к образованию важных в энергетическом аспекте продуктов - НДЦН и сукцинил-КоА. Ключевая роль комплекса заключается в том, что он катализирует единственную в цикле Кребса реакцию, приводящую к образованию богатой энергией связи на субстратном уровне. К тому же это единственный путь биодеградации 2-оксоглутарата .
Именно такая важная позиция оксоглутаратдегидрогеназного комплекса в обмене веществ предопределяет возрастающий интерес к изучению его структуры, функции и регуляции. К настоящему л времени фермент выделен из дрожжей, бактерий, цветной капусты и нескольких тканей животного происхождения. Имеющиеся литературные данные говорят об органоспецифичности ОГДК. Вместе с тем до настоящего времени комплекс из адреналовых желез совер- шенно не изучался, хотя роль его в обеспечении основной функции коры надпочечников - стероидогенеза вытекает из того , что для данного процесса необходима энергия и внутримитохонд-риальные восстановительные эквиваленты ( iAn, Haksar, Peron , 1974) .
В лаборатории биохимии эндокринных желез, где выполнялась настоящая работа, раскрыты некоторые механизмы зависимости функции коры надпочечников от обеспеченности организма тиамином (Островский, Виноградов, 1968) , который в фосфори-лированной форме служит кофактором оксоглутаратдегидрогеназ-ного комплекса. Для углубленного изучения роли ОГДК в метаболизме коры надпочечников и обеспечении ее функции ценную информацию даст детальное исследование очищенного комплекса . Это осуществимо только при использовании адреналовых желез крупного животного. Изучение высокоочищенного фермента представит возможность найти особенности ОГДК из надпочечников по сравнению с аналогичными комплексами из других источников, что расширит и углубит знания об этом ферменте вообще. Сделать это тем более необходимо в виду того, что С.А. Струмило, С.Б.Сен-кевич, Э.А. Галицкий и др. (1983) показали важную роль оксо-глутаратдегидрогеназного комплекса в поддержании базального уровня стероидогенеза. Выяснение значения фермента в метаболизме коры надпочечников, возможности раскрытия путей его регуляции явилось целью проведенного исследования. Именно в этом и будет состоять то новое, что внесется проведенной работой в решение актуальной научной задачи современной биохимии. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие основные задачи: - разработать метод выделения и очистки оксоглутаратдегид-
7 рогеназного комплекса из коры надпочечников до электрофорети-чески гомогенного состояния; изучить кинетические параметы оксоглутаратдегидрогеназ-ного комплекса; выяснить формальный кинетический механизм реакций ОГДК и его компонентов; расщепить комплекс и получить в изолированном виде ок-соглутаратдегидрогеназу и липоамиддегидрогеназу; выяснить пути и способы регуляции оксоглутаратдегидро-геназного комплекса из надпочечников .
Научная новизна полученных результатов состоит в том, что впервые: выделен и очищен до гомогенного состояния оксоглута-ратдегидрогеназный комплекс из коры надпочечников быка; изучены его субъединичный состав и ряд общих свойств; получены в изолированном виде оксоглутаратдегидрогеназа и липоамиддегид-рогеназа; установлен формальный механизм реакций комплекса и составляющих его ферментов; определены места и доказана алло-стерическая природа действия эффекторов на комплекс; выяснены регуляторные возможности ряда кофакторов и метаболитов в отношении оксоглутаратдегидрогеназного комплекса .
Научно-практическое значение данных заключается в том , что разработан метод очистки, позволяющий получать высокоочи-щенный оксоглутаратдегидрогеназный комплекс из надпочечников, который может быть использован для изучения молекулярных механизмов его функционирования, а также для препаративной наработки ОГДК. Установлена возможность ингибирования комплекса из надпочечников окситиаминдифосфатом и тетрагидротиаминдифос-фатом, что указывает на возможность использования данных анти-коферментов в регуляции метаболизма коры надпочечников .
Новые данные о комплексе, аллостерическом характере его регуляции используются при чтении лекций по биохимии в Гродненском государственном медицинском институте . Высокоочищен-ный комплекс из надпочечников используется также в научно-исследовательской работе лаборатории коферментов Отдела регуляции обмена веществ АН БССР, лаборатории химии ферментов Института биохимии АН Литовской ССР, лаборатории технической микробиологии Научно-производственного объединения "Витамины" (г. Москва) .
На защиту выносятся следующие положения:
Метод выделения и очистки ОГД-комплекса из надпочечников, состоящий из 7 стадий и позволяющий получать гомогенный препарат. Кроме того метод получения в изолированном виде входящих в состав этого комплекса ферментов оксоглутаратде-гидрогеназы и липоамиддегидрогеназы.
Оксоглутаратдегидрогеназный комплекс состоит из собственно оксоглутаратдегидрогеназы, липоатсукцинилтрансферазы и липоамиддегидрогеназы и обладает следующими общими свойствами: удельная активность высокоочищенных препаратов ОГДК относительно высокая и составляет 6-9 ед/мг ; оптимальными для функционирования ОГДК in vitro условиями являются 25-50 мМ ионная сила буфера, рН равный 7,5; фермент обладает невысокой термостабильностью и в то же время криорезистентен и др .
Доказательство того, что кинетические параметры для оксоглутаратдегидрогеназного комплекса из надпочечников соответствуют модели трехцентрового "пинг-понг" механизма, а его активность зависит от присутствия неорганического фосфата и ионов двухвалентных металлов.
Действие АДФ и НДЦН на оксоглутаратдегидрогеназу и липоамидцегидрогеназу имеет аллостерическую природу, а взаимодействие указанных ферментов с субстратами и эффекторами носит кооперативный характер, причем такое взаимодействие может осуществляться лишь в определенных условиях.
Обоснование темы и методов исследования
Чтобы получить высокоочищенный ОГДК из коры надпочечников быка предстояло разработать метод его очистки, так как оказалось, что для комплекса из этого источника есть свои особенности, заключающиеся в более трудной отделяемости его от сопутствующего пируватдегидрогеназного комплекса. Поскольку необходимо было приспособить имевшиеся методы и свести их в единую схему, остановимся на изложении этапов и тех новшеств, которые были нами внесены в процесс очистки.
Свежие бычьи надпочечники доставляли в лабораторию с Гродненского мясокомбината во льду. Дальнейшую обработку проводили в холодной комнате при температуре 0-6С. После освобождения от капсулы и мозгового вещества корковый слой надпочечников измель»: .: чали при помощи ручной мясорубки и микроизмельчителя тканей РТ-2. Позднее для этой цели стали применять винтовой пресс с диаметром отверстий сита I мм. для одного выделения митохондрий использовали 0,6-0,8 кг (60-80 шт.) надпочечников. К измельченной ткани добавляли 4 части 0,15 М KCI, содержащего 10 мМ трис-HCI буфер (рН 7,5), 0,1 мМ ЭДТА и 0,5 мМ дитиотреитол и гомогенизировали 2 мин в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Гомогенат для удаления ядер и обломков центрифугировали 5 мин при 600 g на центрифуге ЦЛР-І. Из надосадочной жидкости митохондрии осаждали центрифугированием на ЦВР-І при 9500g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливали, а образовавшийся на стенках пробирок жировой налет убирали с помощью марлевых тампонов. Затем митохондриальный осадок промывали средой выделения и центрифугировали 15 мин при 12000 g . Митохондрии суспендировали в 120-160 мл 0,02 М калий-фосфатного буфера (рН 6,5), содержащего 0,1 мМ ЭДТА и 0,5 мМ дитиотреитол. Препараты митохондрий замораживали и хранили в жидком азоте несколько дней, в течение которых накапливали необходимое количество материала.
Выделение и очистка оксоглутаратдегидрогеназного комплекса из митохондрий.
Получение митохондриального экстракта. Препараты митохондрий размораживали при температуре I8-20C , а затем опять замораживали в жидком азоте с последующим оттаиванием. Обрывки разрушенных митохондрий отделяли центрифугированием при 20000 gв течение 20 мин, получая таким образом прозрачный супернатант.
Осаждение 0ГДК полиэтиленгликолем. К полученному митохондриальному экстракту прибавляли по каплям 25%-ный водный раствор полиэтиленгликоля (мол.вес 6000) до 6%-ной концентрации его в среде при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Через 10 мин образовавшуюся взвесь осаждали центрифугированием при 25000 g в течение 10 мин на ЦВР-І. В супернатанте не определялась активность комплекса. Осадок растворяли в 35 мл 0,05 М калий-фосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 0,1 мМ ЭДТА и 0,5 мМ дитиотреитол (буфер А). Нерастворимые частицы удаляли центрифугированием.
Фракционирование полиэтилен-гликолем. 0ГДК осаждали, добавляя к ферментному препарату 25%-ный водный раствор полиэтиленгликоля порциями, повышающими концентрацию его в среде на 1% . После прибавления каждой новой порции полиэтиленгликоля белковую взвесь осаждали центрифугированием при 15000 g в течение 5 мин, а в супернатанте контролировали остаточную активность оксоглутарат- и пируватде-гидрогеназного комплексов (рис.2). ОГДК получали добавлением полиэтиленгликоля до 4%-ной концентрации. Препарат содержал до 10% (по активности) ПДК, основная часть которого выпадала в осадок при 4-6% ных концентрациях полиэтиленгликоля. После центрифугирования осадок, содержащий ОГД-комплекс, растворяли в 16-19 мл буфера А, экстрагировали в течение ночи при 0С, а затем нерастворенные частицы отбрасывали повторным центрифугированием.
Ультрацентрифугирование. В 35 мл центрифужную пробирку вносили 5 мл 12,5%-ного раствора сахарозы на буфере А и сверху наслаивали ферментный препарат (Roche, Cate , 1977). Центрифугировали в бакет-роторе при 120000 g в течение 8 ч на центрифуге VAC-601. Супернатант отбрасывали, а осадок растворяли в 10 мл буфера А.
Изоэлектрическое осаждение, рН полученного раствора доводили до 6,0 и выпадающий осадок удаляли центрифугированием. ОГДК из супернатанта осаждался прибавлением по каплям при интенсивном помешивании І н уксусной кислоты до рН 5,3. Осадок растворяли в 1-1,2 мл буфера А.
Гель-фильтрация. Полученный ферментный препарат наносили на колонку заполненную сефарозой 4В (1,6x110) и уравновешенную 0,05 М калий-фосфатным буфером, содержащим 0,1 М KGI, 0,1 мМ ЭДТА и 0,5 мМ дитиотреитол. Элюировали этой:же смесью со скоростью 12 мл в час. Объем фракции 4 мл. Во фракциях определяли концентрацию белка при 280 нм и ферментативную активность. Фракции с оксоглутаратдегидрогеназной активностью объединяли .
Осаждение полиэтиленгликолем. К объединенным фракциям добавляли 25%-ный водный раствор полиэтиленгликоля до 6%-ной концентрации. Через 15 мин центрифугировали при 100000 g в бакет-роторе на VAC-601 . Супернатант тщательно сливали, а легкий белковый налет на дне и стенках пробирки растворяли в 1,2 мл буфера А. Препараты ОГДК хранили расфасованными на небольшие порции в жидком азоте.
Полную активность ОГДК измеряли по образованию НДДН при 340 нм и температуре в кювете - 30 С на регистрирующем спектрофотометре Spekord uv vis("Karl Zeis", ГДР). Реакционная смесь содержала: 50 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7,5), 2,6 мМ дитио-треитол, 1,0 мМ MgCI2, 0,2 мМ ТДФ, 1,0 мМ НДЦ+, 0,1 мМ КоА, 5 мМ 2-оксоглутарат натрия. Несмотря на присутствие в реакционной среде всех компонентов, используемых другими исследователями для определения скорости данной реакции, концентрация КоА, калий-фосфатного буфера и его рН были подобраны непосредственно для ОГДК надпочечников. Иногда вместо калий-фосфатного использовался такой же молярности трис-HCI буфер. В отличие от некоторых других исследователей для проведения реакции брали объем пробы , равный I мл, что достигалось благодаря использованию специальной подставки под кюветодержатель. Реакция запускалась внесением ферментного препарата и измерялась начальная скорость, которую выражали в единицах ферментативной активности (образование I мкмоля НАДН за I мин при 30С).
Температурная зависимость, термостабильность ОГДК
Оказалось, что удельная активность оксоглутаратдегидрогеназного комплекса несколько понижается по мере снижения концентрации его в 100 раз. Это понижение,однако, является относительно небольшим по сравнению с изменением удельной активности от концентрации фермента в выраженно диссоциирующих ферментных системах (Курганов, 1978, Северин, Гомазкова, Красовская, Стафеева, 1978), Удельная активность оксоглутарат-дегидрогеназы, определяемая в модельной реакции с 2,6-ДХФИФ остается практически постоянной при различных концентрациях комплекса. Очевидно, для ОГДК из надпочечников, в отличие от этого фермента из мышц (Северин и др., 1978) не характерны быстро протекающие процессы диссоциации-ассоциации с образованием молекул различающихся по активности.
Изучая ОГДК из надпочечников быка мы провели исследование с целью проверки влияния температуры как на его кинетическую активность, так и в плане повышения термостабильности. Следует отметить, что этот вопрос является недостаточно изученным и для ОГДК из других источников. Влияние температуры на начальную скорость ОГДК изучалось в условиях I мМ концентрации субстрата в реакционной среде. На рис.9 представлена зависимость скорости оксоглутаратдегидрогеназной реакции от температуры в координатах Аррениуса в отсутствие и в присутствии эффекторов ОГДК . Графический метод позволяет довольно просто вычислить энергию активации, так как зависимость lgv от I/T является прямой с наклоном, равным -EQ(2,303 R) (Диксон, Уэбб, 1982, стр.244). Температурный коэффициент QT , показывающий во сколько раз увеличивается скорость ферментативной реакции при повышении температуры на ЮиС, для ОГДК из надпочечников до 24С равен -2,3, а после 24 -1,9. Излом графика зависимости; v от I/T при критической температуре (24G) свидетельствует об изменении кажущейся энергии активации, определенной графически с помощью уравнения Аррениуса, от 72600 до 52900 Дж Моль""1.
Однако, добавление в среду 0,1 мМ концентрации НАДН приводит к увеличению Еа и различие в ней на трис-HGI буфере без и в присутствии НАДН составляет 29800 Дж Моль"1.
Для объяснения явления изменения энергии активации при определенной критической температуре был выдвинут ряд гипотез , некоторые из которых1 базируются на представлении о переключении в целостном процессе реакций с различными температурными коэффициентами при изменении температуры. В исследуемом диапазоне температур зависимость скорости реакции от -ьдля ОГД-компонента комплекса в системе с искусственным акцептором электронов -2,6-дихлорфенолиндофенолом является прямолинейной и не имеет излома. Скорость липоамиддегидрогеназной реакции гораздо выше скорости реакции целостного комплекса, поэтому она не может быть I лимитирующей при любой температуре. Отсюда можно предположить, что конформационный переход при 24С осуществляется на уровне і ЛСТ-компонента, который занимает центральное место в структуре и оказывает влияние на функционирование всего комплекса.
С повышением температуры скорость реакции ОГДК растет и это мы наблюдали в исследуемом диапазоне температур от 15 до 40С , однако, уже при 40С происходит довольно быстрое замедление реакции комплекса, связанное с его термоинактивацией . При 40С оказалось возможным исследовать термоустойчивость ОГДК и испытать пути повышения ее. В течение 10 мин инкубации при данной температуре в трис-HCI буфере в присутствии 0,5 мМ дитиотреитола активность комплекса снижается на 60% (рис.10). Самый высокий стабилизирующий эффект наблюдался при инкубации фермента в присутствии бычьего сывороточного альбумина (2%) на фоне исходного буфера с 0,5 мМ дитиотреитолом. Снижение активности в течение 20 мин в присутствии альбумина составило всего Ь% . Это говорит о том, что для защиты ОГДК от термоинактивации важное значение имеет белковое окружение. Ионы магния также обладают термостабилизирующей способностью. Используемый некоторыми авторами глицерин ( George et al., 1969 , Ngo, Bar-bean , 1978, Сенкевич, Струмило, 1983) в 25%-ной концентрации способствует сохранению активности и ОГДК из надпочечников . Другие кофакторы, такие как 2-ОГ, ТДФ, КоА, НДД+, а также калий-фосфатный буфер большого стабилизирующего действия на надпочеч-никовый комплекс не оказывали. В одном из исследований термостабильности при 30С комплекс в течение часа терял только 6% своей активности. Стабильность ферментных препаратов зависит и от концентрации ОГДК в растворе, повышаясь с увеличением ее . При низких температурах (0-4С) ОГДК довольно длительное время, за редким исключением, сохраняет свою первоначальную активность. Хранение же препаратов в условиях сильного охлаждения (-196С) способствует хорошему сохранению полной активности комплекса в течение 2 лет и более.
Выяснение общего кинетического механизма ОГДК
В отличие от данных, полученных нами для комплекса из надпочечников, Hamada, Koike, Nakaula И др. (1975) ДЛЯ ОГДК из сердца свиньи наблюдали бесконкурентное ингибирование НАДН в отношении КоА, так же как и сукцинил-КоА в отношении НАД+. Отклонение от такого типа ингибирования, вероятно, является результатом тесного физического взаимодействия между ЛОТ и ЛДГ , при котором связывание субстрата или продукта ингибитора с одним из ферментов препятствует присоединению субстрата к активному центру другого фермента. В целях проверки возможности такого взаимодействия в комплексе из надпочечников мы исследовали зависимость начальной скорости реакции, которая катализируется липоамидцегидрогеназой, от концентрации НДЩі с использованием липоамида в отсутствие и в присутствии КоА, т.е. реакция проводилась в направлении, обратном тому, которое наблюдается при функционировании комплекса. Оказалось, что КоА ингиби-рует входящую в состав ОГДК липоашддегидрогеназу в отношении НДОВ по смешанному типу (рис.18). Это подтверждает близость активных центров липоатсукцинилтрансферазы и липоаммддегидрогена-зы, так как КоА не оказывал вообще ингибирующего действия на липоамиддегидрогеназу,отделенную от комплекса (рис.186).
Вместе с тем 2-оксоглутарат совершенно не оказывает ин-гибирующего действия даже на связанную с комплексом липоамидде-гидрогеназу (рис.18а). Поэтому, смешанный (вместо бесконкурентного) тип ингибирования НДДН против 2-оксоглутарата нельзя объяснить сближением активных центров оксоглутарат- и липоамидде-гидрогеназ. Наиболее вероятным является прямое ингибирующее влияние НДДН на оксоглутаратдегидрогеназный компонент комплекса из надпочечников. Следует отметить, что прямое влияние НДДН на ОГД обнаружено и для фермента из грудной мышцы голубя (Гомазкова , Красовская, 1979).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что присоединение субстратов и освобождение продуктов осуществляется в ОГДК из надпочечников по "пинг-понг" механизму. Исследование автономии субстрат-евязывающих центров путем ингибитор-ного анализа показало, что мишенью ингибирующего влияния НДДН является не только третий, но и первый компонент ОГДК .
При более детальном изучении зависимости уу от концентрации НДД+ в присутствии НДДН наблюдалось ингибирование ОГДК не по конкурентному, а по смешанному типу в отношении НДД+ (рис.19), хотя в автономной липоамиддегидрогеназной реакции с использованием:, дигидролипоамида и варьирующих концентраций НДД+ отмечен чисто конкурентный характер ингибирования. Отметим, что в данной зависимости ДДФ несколько противодействует ингибиро-ванию НДДН, хотя, при насыщении 2-оксоглутаратом, не влияет на количественные параметры зависимости V от [НДД+] . Возможно, ДДФ обладает некоторой конкурентоспособностью, блокируя центр связывания НДДН, благодаря наличию у них одинаковой адено-: -зиновой группировки.
Наиболее прямым подтверждением действия НДДН на первый компонент комплекса явились результаты по декарбоксилирова-нию 1,2- С -оксоглутарата. Скорость декарбоксилирования без функционирования ЛОТ и ЛДГ значительно ниже, чем скорость полной реакции комплекса. И даже в такой искусственной ситуации проявилось ингибирующее действие НДЦН. Добавление в реакционную среду 0,2 мМ НДЦН статистически достоверно понижает относительную скорость декарбоксилирования с 844 - 44 до 641 - 52 имп/мин (/г=5, р :0,02). НДЦ+ , в такой же концентрации, инги-бирующим действием не обладал (891 ± 46 имп/мин, р О ) .
Десенсибилизация ОГД к НДЦН при помощи I мМ ацетил-ацетона при защите активного центра 4 мМ 2-оксоглутаратом свидетельствует о потере чувствительности ОГД к НДЦН, так как снижение скорости реакции при внесении после этого в реакционную 0,2 мМ НДЦН не является достоверным.
После расщепления комплекса и получения ОГД, не обладающей диафоразной активностью, мы смогли наблюдать влияние НДЦН непосредственно на первый компонент (рис.20). С увеличением концентрации НДЦН происходило ингибирование активности ОГД , которое зависело от концентрации 2-ОГ. Коэффициент Хилла при низких концентрациях НДЦН (меньше 0,05 мМ) значительно превышает І в условиях ненасыщения субстратом, что свидетельствует о положительной кооперативности связывания НДЦН первым компонентом. Такое же проявление кооперативности в более развернутом виде было обнаружено и для зависимости 2 отНДЦН1, которое зависело как от концентрации субстрата, так и от присутствия ДЦФ.
Применив широкий диапазон концентраций 2-оксоглутарата, мы заметили, что при низком уровне субстрата скорость реакций в трис-НСІ буфере гораздо ниже, чем в калий-фосфатном с аналогичным значением рН (рис.21). При 20 мМ концентрации субстрата скорость оксоглутаратдегидрогеназной реакции не зависит от применяющегося буфера, т.е. можно полагать, что не зависит от присутствия ионов фосфата.
Протеолитическое действие папаина на оксоглутаратде-гидрогеназный комплекс из коры надпочечников быка
Как видно из рис.31А полного разделения комплекса протеа-зой с последующей гель-фильтрацией не произошло. Часть активности липоамиддегидрогеназы выходила за пиком остаточной полной активности комплекса, а часть все же оставалась комплекси-рованной. Оставалось предположить, что для полного отделения первого и третьего компонентов от ЛСТ было недостаточно внесено протеолитического белка. В другой раз, для более полной инактивации и, соответственно, расщепления комплекса увеличили количество вносимой протеазы ( 500 мкг ОГДК преинкубировали с 30 мкг препарата протеазы). Разделение на колонке с сефарозой 6В, обработанного таким образом фермента, показано на рис.ЗІБ . Во фракциях была обнаружена только активность ЛДГ, причем она определялась почти на всем протяжении белкового пика . Возможно, небольшое количество первого компонента во фракциях не позволило определить его активность в реакции с ДХФИФ. Полной активности комплекса также не обнаружили. После объединения фракций по группам и высаливания белка сульфатом аммония активность ОГД определялась в препарате из 18-25 фракций, т.е. она предшествовала выходу пика с ЛДГ-активностью . Вероятно, самый первый белковый пик мог соответствовать ЛСТ-компоненту, активность которого мы не определяли, но по данным Linn (1971) он выходил впереди ОГД и ЛДГ. А так как в любом случае ЛДГ-активность определялась во всех фракциях, мы решили искать другой путь разделения надпочечникового ОГДК.
В 1980 году появилось сообщение Kresze и Ronft , которые под действием папаина (КФ 3.4.22.2) наблюдали ограниченный протеолиз липоатацетилтрансферазного компонента и распад пиру-ватдегидрогеназного комплекса на составляющие его ферменты. Таким же действием обладала и эластаза (КФ 3.4.21.II). Другие протеиназы, например трипсин (КФ 3.4.21.4) , клострипаин (КФ 3. 4.22.8) и химотрипсин (КФ 3.4.21.II) инактивируют ПДК, расщепляя пируватдегидрогеназный компонент (Kresze, Ronft, 1980).
Исходя из появившихся данных,мы решили проверить возможность использования папаина для разделения надпочечникового ОГДК . Для того, чтобы измерять активность собственно оксоглутаратде-гидрогеназы в модельной реакции с 2,6-ДХФИФ в процессе разделения комплекса , использовали ферментный препарат, растворенный в 0,05 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0) без дитиотреитола. На I мг белка ОГДК в среду преинкубации вносили 0,02 мг папаина. Через 5 мин преинкубации при 30С активность комплекса полностью исчезает, а активность 0ГД и ДДГ в индивидуальных реакциях остается на прежнем уровне. Обработанный комплекс охлаждали во льду и наносили для гель-фильтрации на колонку с сефаро-зой 6В (1,5х50 см), уравновешенной калий-фосфатным буфером 0,05 М (рН 7,0) в присутствии 0,1 мМ ЭДТА. После гель-фильтрации оказалось (рис.32), что белковый пик сильно растянут и определить активность 0ГД не удалось. Липоамиддегидрогеназа элюи-ровалась в конечных фракциях пика белка . Так как использование сефарозы 6В не обеспечивает надежного разделения компонентов комплекса, разделенного и при помощи папаина, то для этой цели стали использовать сульфатаммонийное фракционирование обработанного препарата . После обработки папаином раствор с ферментом разбавляли 0,02 М калий-фосфатным буфером (рН 7,0) с 0,1 мМ ЭДТА. Центрифугирование при фракционировании сульфатом аммония проводили при 20000g на ЦВР-І. Процесс фракционироваконцентрации осавдался ЛАТ-компонент при разделении ПДК (Кге-sze , Ronft , 1980). Предлагаемая ими концентрация сульфата аммония (59%) для осаждения Ej-компонента ПДК в наших условиях являлась завышенной. В осадке оказывались не только оксоглутаратдегидрогеназа, но и значительное количество липоа-миддегидрогеназы. Поэтому для осаждения ОГД-компонента комплекса мы применили 45%-ную концентрацию (KH.)2SO4 . Осадок растворяли в небольшом объеме 0,05 М калий-фосфатного буфера с 0,1 мМ ЭДТА. ЛДГ получали добавлением в ферментный раствор сульфата аммония до 80-90%-ной концентрации.
В таблице 6 в сокращенном виде представлены результаты одного из разделений оксоглутаратдегидрогеназного комплекса с использованием для этой цели папаина . Они говорят о том, что сам папаин неплохо отделяет компоненты комплекса друг от друга, но в то же время фракционирование сульфатом аммония не дает полного разделения их. Поэтому была предпринята попытка использовать гель-фильтрацию через акрилекс П-300 и сефарозу 6В на колонках 1,5 50 см как дополнительный этап разделения ОГД и ЛДГ после фракционирования (рис.33, 34, 35). Нам удалось получить липоамиддегидрогеназу, свободную от примеси ОГД и ЛОТ. Однако, в получаемых таким образом препаратах ОГД, всегда определялось присутствие активности липоамиддегидрогеназы. Поэтому мы решили использовать хроматографию на геле фосфата кальция на целлюлозе с тем расчетом, чтобы уже в самом начале отделить ЛДТ от ОГД .
Похожие диссертации на Очистка, характеристика, расщепление оксоглута-ратдегидрогеназного комплекса из надпочечников быка и свойства его периферических ферментов
