Содержание к диссертации
Введение
1. Аналитический обзор 10
1.1. Характеристика исследуемых ферментов рыб и других позвоночных животных 10
1.1.1. Пепсины 11
1.1.2. Трипсины 25
1.1.3. Химотрипсины 39
1.1.4. Эластазы 47
1.1.5. Аминопептидазы 53
2. Материал и методы 59
2.1. Материал и реактивы 59
2.2. Очистка ферментов 59
2.2.1. Приготовление водных экстрактов, определение инактивации исследуемого материала при обработке ацетоном 60
2.2.2. Осаждение белков сульфатом аммония, диализ, концентрирование растворов 61
2.2.3. Гель-хроматография, обессоливание препаратов 63
2.2.4. Ионообменная хроматография 64
2.2.5. Изоэлектрофокусирование, определение изоэлектрических точек ферментов 65
2.3. Определение активности ферментов 66
2.3.1. Определение активности протеиназ по природным субстратам 66
2.3.2. Определение активности протеиназ по синтетическим субстратам 69
2.4. Определение количества белка 71
2.5. Изучение физико-химических свойств ферментов 71
2.5.1. Определение диапазонов рН стабильности и активности 72
2.5.2. Определение температурного оптимума действия 73
2.5.3. Определение влияния ионов металлов и ингибиторов 73
2.5.4. Определение молекулярных масс 74
2.6. Статистическая обработка результатов 75
3. Результаты исследования и их обсуждение 76
3.1 Анатомо-гистологические особенности пищеварительного тракта сома 76
3.2. Выделение и очистка протеолитических ферментов сома европейского 81
3.2.1. Определение содержания протеиназ в желудочно-кишечном тракте и влияние обработки ацетоном на их активность 81
3.2.2. Осаждение исследуемых ферментов сульфатом аммония 84
3.2.3. Разделение и обессоливание водорастворимых белков слизистой оболочки желудка гель-хроматографией ...87
3.2.4. Определение изоэлектрических точек протеиназ слизистой оболочки желудка 91
3.2.5. Разделение ферментов слизистой оболочки желудка ионообменной хроматографией 94
3.2.6. Разделение и обессоливание водорастворимых белков поджелудочной железы гель-хроматографией 99
3.2.7. Определение изоэлектрических точек протеиназ поджелудочной железы 101
3.2.8. Разделение ферментов поджелудочной железы ионообменной хроматографией 105
3.3. Свойства протеолитических ферментов сома европейского 115
3.3.1. Пепсины 115
3.3.2. Трипсины 122
3.3.3. Химотрипсины 129
3.3.4. Эластазы 134
3.3.5. Аминопептидазы 138
Заключение 142
Выводы 146
Список литературы 148
- Пепсины
- Осаждение белков сульфатом аммония, диализ, концентрирование растворов
- Анатомо-гистологические особенности пищеварительного тракта сома
- Определение изоэлектрических точек протеиназ слизистой оболочки желудка
Введение к работе
Актуальность исследования. Протеолитические ферменты давно используются в пищевой промышленности [Ратушный Л.С., 1976; Журавская Н.К., Изотов О.В., 2002] и сельском хозяйстве [Сницарь А. и соавт., 1989; Цыперович А.С., 1971]. Важнейшей областью применения протеиназ является медицина. Препараты на их основе, наружно или в виде инъекций, назначают при лечении различных гастро-энтерологических заболеваний [Яковенко Э.П., 1998], гнойно-некротических процессов [Березов Т.Т, 1996; Стручков В.И. и соавт., 1970], офтальмологии, стоматологии и гинекологии [Боровский Е.В., 2003; Кузнецова Т.А. и соавт., 1997]. Несмотря на высокую эффективность применения, существующих препаратов протеиназ, они имеют ряд существенных недостатков: не стабильность при используемых значениях рН и индуцирование аллергических реакций. В фундаментальных исследованиях белковой химии протеиназы широко используются в качестве рабочего инструмента для изучения первичной структуры белков и пептидов. В молекулярной биотехнологии высокоочищен-ные препараты протеиназ используют для модификации белков путем частичного протеолиза [Глик Б., Пастернак Д., 2002]. В связи с этим в настоящее время остается актуальным поиск новых источников протеиназ с более высокой удельной активностью. Кроме этого, изучение свойств протеолитических ферментов рыб и их сравнение с соответствующими ферментами животных других классов позволяет получить дополнительные сведения об их происхождении и эволюции.
Многочисленные исследования протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта показали наличие у многих видов рыб протеиназ с высокой молярной активностью. Jonas Е. et al. в 1983 г. обнаружили в желудочно-кишечном тракте сома европейского Silurus glanis L. высокоактивные протеи назы, но исследование этих ферментов было не достаточно подробным. Кроме этого, сом европейский является ценным объектом прудового рыбоводства [Петрушин А.Б. и соавт., 1999]. В настоящее время, промысловый вылов этого вида в крупных масштабах ведется в дельте р. Волги в районе г. Астрахани. По требованиям санэпиднадзора выловленная рыба перед замораживанием потрошится, а большое количество потенциального сырья используется малоэффективно: только в качестве добавок в рационы птиц в сыром виде и частично перерабатывается на рыбную муку. Поэтому протеиназы пищеварительного тракта сома являются интересным и перспективным объектом исследования.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось определение спектра протеиназ желудочно-кишечного тракта сома с высокой удельной активностью и установление особенностей их физико-химических свойств.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Выделение и очистка протеолитических ферментов из слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы сома европейского (пепсина, трипсина, химотрипсина, эластазы и аминопептидазы).
2. Исследование физико-химических свойств этих протеиназ (молекулярная масса, значения изоэлектрических точек, оптимумы рН стабильности и активности, ингибиторный анализ).
3. Сравнение свойств протеиназ сома европейского с аналогичными ферментами других рыб и позвоночных животных других классов.
Научная новизна. При изучении протеолитических ферментов слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы сома европейского впервые установлено, что исследуемые протеиназы представлены несколькими изоформами, определены значения изоэлектрических точек этих протеиназ. Впервые определены молекулярные массы исследуемых протеиназ. Выяснены диапазоны рН стабильности и активности протеолитических ферментов с использованием природных и синтетических субстратов, с определением рН оптимумов.
Впервые у сома выделена и исследована аминопептидаза, обладающая свойствами сближающими ее с трипептид аминопептидазами больше, чем с лейцил аминопептидазами.
Впервые исследовано влияние синтетических ингибиторов на протеиназы слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы. Проведено сравнение молярной активности протеиназ пищеварительного тракта сома европейского и пищеварительных протеиназ млекопитающих. На основании ингибиторного анализа сделан вывод о строении активных центров исследуемых протеиназ.
Проведено сравнение протеолитических ферментов сома европейского с аналогичными ферментами других видов рыб и позвоночных животных других классов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты дополняют сведения о физико-химических свойствах протеолитических ферментов рыб и выявляют особенности в свойствах протеиназ сома европейского. В работе показано, что одна из трех изоформ пепсинов слизистой оболочки желудка сома европейского по свойствам и молярной активности ближе к пепсинам млекопитающих, чем рыб. Протеолитические ферменты сома европейского, также как и других видов рыб, в сравнении с аналогичными протеиназами других позвоночных животных имеют как сходство, так и отличия.
Благодаря высокой удельной активности протеолитических ферментов сома европейского слизистая оболочка желудка и поджелудочная железа могут служить недорогим источником ферментных препаратов с широким спектром применения.
Основные полоэюения, выносимые на защиту: 1. Распределение протеолитических ферментов в желудочно-кишечном тракте сома неравномерно. Большая часть протеиназ секретируется в слизистой оболочке желудка и поджелудочной железе.
2. В слизистой оболочке желудка обнаружено три изоформы пепсина, из которых две являлись пепсинами типа II, характерными для многих хищных рыб, а одна обладала свойствами близкими к пепсинам млекопитающих.
3. В поджелудочной железе сома обнаружено по три изоформы трипсина и хи-мотрипсина, а также эластазы I и II типа.
4. Одна изоформа пепсина и две изоформы трипсина сома имеют молярную активность выше, чем соответствующие ферменты млекопитающих.
5. Протеолитические ферменты поджелудочной железы сома и соответствующие ферменты позвоночных животных других классов обладают, как общими свойствами, так и отличительными особенностями.
Пепсины
Пепсины представители аспартильных протеиназ, являются эндопептида-зами и относятся к классу гидролаз. Впервые пепсин (ЕС 3.4.23.1) [Webb E.S., 1992] был получен в кристаллическом виде Д. Нортропом и М. Кунитцем в 1929 - 1930 гг., a Tang et al. в 1973 г. первыми расшифровали его полную аминокислотную последовательность.
Пепсины в своем составе не имеют простетической группы небелковой природы и состоят из одной полипептидной цепи, так как молекула содержит одну С- и одну N-концевую группы. J. Tang и R. Wong в 1987 г., сравнивая структуру и функции аспартильных протеиназ различного происхождения, пришли к выводу, что пепсины различных животных схожи молекулярной протяженностью (имеют около 330 аминокислотных остатков). Канадские, британские и российские ученые [Abad-Zapatero С. et al., 1990; Andreeva N.S. et al., 1984; Bateman K.S. et al., 1998; Kageyama T. et al., 1990; Sanchez-Chiang L. et al., 1987] своими исследованиями показали, что молекулы пепсинов различного происхождения имеют одинаковые формы и упаковки цепи, тождественную структуру активного центра. Молекула пепсина состоит в основном из Р-слоев. В двумерной симметрии пепсинов принимают участие остатки с 1 по 175, образующие N-конец и остатки от 176 до 326, принадлежащие С-концу [Kageyama Т., Takahashi К., 1986; Kageyama Т. et al. 2002]. Аминокислотная последовательность С-конца пепсина и пепсиногена одинакова, то есть разрыв связей происходит в N-концевом сегменте пепсиногена. Структура молекулы пепсиногена стабилизируется электростатическими, водородными и гидрофобными взаимодействиями между Туг 37, Lys 36, Туг 9 и двумя каталитическими аспар-татами [Kageyama Т., 2002; Richter С. et al. 1999]. Активация пепсиногена происходит или одностадийно, или в несколько этапов. Одностадийная активация заключается в отщеплении N-концевого сегмента из 47 аминокислотных остат-ков, в положении Leu 47-Val 48. Активация в несколько стадий идет с образованием промежуточных продуктов расщепления (псевдопепсина и пептидов различной величины). Псевдопепсин образуется при разрыве связей на участке между 16-м и 26-м аминокислотными остатками. Эти два вида активации, как правило, идут одновременно и происходят в результате внутримолекулярных изменений и межмолекулярного взаимодействия. При значениях рН 3,0 и ниже активация преимущественно идет за счет внутримолекулярных изменений, а при слабокислых значениях рН (около рН 4,0) - преимущественно за счет межмолекулярного взаимодействия [Kageyama Т., 2002]. Активный центр пепсина содержит два остатка аспарагиновой кислоты в положениях 32 и 215 [Мосолов В.В., 1971; Tang J. et al., 1973; Kageyama Т., 2000]. Аминокислотный остаток Lys 36 имеет важное значение для правильной укладки активного центра, так как при его замещении на один из аминокислотных остатков Arg, Glu или Met происходило существенное изменение положения Asp 215, что значительно снижало каталитическую активность пепсинов-мутантов [Richter С. et al., 1998; 1999]. Важный вклад в подвижность петли активного центра вносит Gly 76 [Okoniewska М. et al., 2000]. Пепсин гидролизует только пептидные связи, не действуя на сложноэфирные связи коротких пептидов. Для действия пепсина на пептидные связи характерна строгая стереоспецифичность аминокислотных остатков по обе стороны от гидролизуемой связи. Особенно чувствительны к действию пепсина пептидные связи образованные аминокислотными остатками с гидрофобными боковыми цепями, такие как фенилаланин, лейцин и тирозин [Мосолов В.В., 1971; Попов Е.М. и соавт., 1996]. Оптимум рН каталитического действия пепсина в желудке находится около рН 2, при слабощелочных и щелочных значениях рН молекула пепсина денатурируется. При исследовании механизма денатурации было обнаружено, что очевидно важное значение для стабильности укладки молекулы пепсина имеет Gis 53 [Konno Т. et al., 2000; Campos L., Sancho J., 2003].
Пепсины обнаружены в слизистой желудка всех исследованных в этом плане позвоночных животных. Несмотря на различную видовую принадлеж ность, они имеют сходное строение, катализируют реакции одного типа, но отличаются друг от друга по некоторым свойствам.
Пепсины рыб. У большинства видов рыб классов костистые (Osteichthyes) и хрящевые (Chondrichthyes) в желудках обнаружена высокая протеолитическая активность ферментов. Для желудочных протеиназ рыб, также как и других позвоночных животных характерна максимальная активность при кислых значениях рН и в этой же среде рН они являются наиболее стабильными, но в отличии от пепсинов высших животных они проявляют более высокую активность и стабильность при сравнительно низких температурах.
Пепсин II, выделенный из слизистой оболочки желудка акулы Scyliorhinus canicula был максимально активен при переваривании гемоглобина при рН 2,5. Интересной особенностью этого фермента являлась способность створаживать молоко при рН 6,8 и выше. Активность акульего пепсина полностью подавлялась пепстатином до концентрации 6 10 7 М. Исследователи Guerard F. и Le Gal Y. (1987) отнесли этот фермент к химозинам, так как свойства акульего пепсина были близки к свойствам химозина теленка, в параллельных опытах. Температурный оптимум действия этих двух ферментов совпадал в диапазоне температур от 35 до 55С, пепсин акулы был более стабилен при температурах 30-40С, а химозин теленка оставался стабильным до температуры 50С.
Осаждение белков сульфатом аммония, диализ, концентрирование растворов
В работе были использованы сефадексы G-75 и G-75 "superfine", учитывали рекомендации фирмы-изготовителя [SephadexR, 1974]. Для проведения гель-хроматографии рассчитанное количество сухого порошка сефадекса засыпали тонкой струйкой в 1 М раствор NaCl, объемом в 2-3 раза большим от рассчитанного, постоянно помешивая стеклянной палочкой. Затем помещали в кипящую водяную баню на 3 часа, для полного набухания и дегазации. После охлаждения суспензии до комнатной температуры сефадекс декантацией переводили в необходимый буфер, что позволяло одновременно избавиться от мелких частиц, которые могли забить колонку [Остерман Л.А., 1985; Попечителев Е.П., Старцева О.Н., 2003]. К верхнему краю колонки, закрепленной строго вертикально и наполненной соответствующим буфером, герметично монтировали воронку. Подготовленную суспензию сефадекса наливали в воронку и открывали нижний клапан колонки. После того как граница осевшего сефадекса поднималась на необходимую высоту, нижний клапан колонки закрывали. Заполненную колонку переносили в холодильную камеру. Воронку демонтировали и герметично закрепляли адаптер, капилляр которого погружали в слой буфера, оставляемый над уровнем сефадекса примерно 2 см. Другой конец адаптера был соединен с герметичной полиэтиленовой трубкой диаметром 2 мм. Перистальтический насос тип - 315 («ZALIMP», Польша) подключали сверху колонки. Трубку нижнего адаптера подключали к коллектору фракций («LKB», Швеция). Пред нанесением образца качество набивки колонки проверяли, пропуская раствор голубого декстрана. Для аналитической хроматографии использовали колонки размером 1,8 х 75 см (объем мл), скорость элюции от 15 до 20 мл/ч, образец наносили в 5 мл, собирали фракции объемом по 2,5 мл. Для препаративной хроматографии применяли колонку размером 2,6 х 80 см (объем мл), скорость элюции 20-22 мл/ч, образец наносили в 10 мл, объем собираемых фракций по 5 мл.
Во фракциях, после гель-хроматографии, определяли концентрацию белка и активность исследуемых ферментов.
Ионообменную хроматографию проводили, применяя то же оборудование, что и для гель-хроматографии, но используя колонки других размеров (1,4 х 10 см, 1,4 х 20 см). В качестве ионообменника использовали ДЭАЭ-целлюлозу. Перед заполнением колонки анионообменник замачивали и пре-формировывали. Сухой порошок ДЭАЭ-целлюлозы засыпали тонкой струйкой в сосуд с дистиллированной водой и оставляли на 1 час для полного набухания. Для преформирования набухший анионообменник переводили в 15 объемов 0,5 М НС1. Через 30 минут обменник декантацией промывали дистиллированной водой до рН 4. Затем отмытый анионообменник помещали в 15 объемов 0,5 М NaOH, также на 30 минут, после чего промывали до рН 7. Преформированную ДЭАЭ-целлюлозу переводили в необходимый буфер и заполняли колонку, также как при гель-хроматографии. Анионообменник в колонке уплотняли, создавая избыточное давление перистальтическим насосом. Колонку уравновешивали соответствующим буфером, контролируя значения рН на входе и выходе колонки. Для обеспечения оптимальных условий разделения ферментов использовали буферные системы, которые удовлетворяли следующим требованиям: - ионы буфера не должны были взаимодействовать с анионообменником; - буферная система должна была обладать достаточно высокой буферной емкостью, при минимальной ионной силе; - значение рН буферов должно было отличаться от изоэлектрических точек белков примерно на 1 ед. в ту сторону, которая обеспечивала знак суммарного заряда белков, противоположный знаку заряда сорбента (pi ±1). Учитывая вышеизложенное применялись следующие буферы: 1) 0,01 М 0-аланин-формиатный рН 3,3; 2) 0,01 М Р-аланин-ацетатный рН 4,2; 3) 0,01 М трис-HCl рН 8,0. В ионообменной хроматографии применяли элюцию непрерывным градиентом за счет изменения концентрации соли в буфере неизменного состава. Скорость элюции составляла 20-22 мл/ч. Во фракциях по 4-5 мл, определяли концентрацию белка и активность исследуемых ферментов. После проведения хроматографии ионообменник извлекали из колонки и промывали 2 М раствором NaCl. После проведения 4-5 хроматографии анионообменник подвергали циклизации [Остерман Л.А., 1985; Скоупс Р., 1985; Попечителев Е.П., Старцева О.Н., 2003].
Для определения значения изоточек ферментов применяли изоэлектрофокусирование в градиенте плотности сахарозы от 0 до 50%. Изоэлектрофокусирование проводили с использованием колонки тип - 8101 («LKB», Швеция) объемом 110 мл изготовителя [ЛКБ - приборы: общий каталог, 1980], применяя амфолины («LKB - Pharmacia», Швеция) диапазоном рН 2,5-4,0; рН 3,5-5,0; рН 5,0-7,0; рН 7,0-9,0; рН 3,0-10,0. Принцип этого метода заключается в том, что в создаваемой системе с градиентом рН белки, передвигаясь в электрическом поле, занимают те области, где значение рН соответствует значению их изоточек [Остерман Л.А., 1983; Ригетти П., 1986]. При работе на колонке учитывали рекомендации фирмы изготовителя [Haglund Н., 1971]. В нижнюю часть, вертикально укрепленной колонки, при опущенном катодном электроде, свободным током заливали 15 мл анодного раствора, содержащего 8 г сахарозы и 0,2 мл ортофосфорной кислоты. В смеситель LKB-8121, состоящем из двух стаканов соединенных между собой, вносили «легкий» и «тяжелый» растворы. «Легкий» раствор содержал 0,5 мл амфолинов, необходимого диапазона рН и отдиализованный раствор исследуемого образца. Конечный объем «легкого» раствора - 55 мл. В состав «тяжелого» раствора, находившегося в противоположном стакане смесителя, входили: отдиализованный исследуемый образец, 200 мг глицина, 28 г сахарозы, 2 мл амфолинов, того же диапазона рН, что и в «легком» растворе. Конечный объем «тяжелого» раствора - 55 мл. При помощи перистальтического насоса, подсоединенного к стакану с «тяжелым» раствором, при постоянном перемешивании, заполняли колонку. Растворы вносили в колонку со скоростью не более 80 мл/ч. После заполнения колонки вносили катодный раствор (20 мл 0,05 М NaOH). Полностью заполненную колонку подключали к системе охлаждения и электроды подключали к источнику постоянного напряжения. Начальное напряжение составляло 300 вольт, сила тока при этом не должна была превышать 10 мА. Через 2-3 ч, после некоторого падения силы тока, напряжение поднимали до 800 вольт. Изоэлектрофокусирование продолжали до тех пор, пока сила тока не становилась равной 1 мА. После завершения опыта колонку отключали, поднимали катодный электрод и ее содержимое фракционировали по 2,2 мл при помощи перистальтического насоса со скоростью элюирования примерно 30 мл/ч. В полученных фракциях определяли: значения рН, концентрацию белка и активность исследуемых ферментов. Для определения значений рН использовали рН-метр - милливольтметр рН-150М («Гомельский завод измерительных приборов», Беларусь).
Анатомо-гистологические особенности пищеварительного тракта сома
Желудок сома по форме похож на мускулистый округлый мешок, способный сильно растягиваться. Кардинальная часть желудка длиннее пилориче-ской части, также как и у других хищных рыб, например, щуки [Гуртовой Н.Н. и соавт., 1976;Сорвачев К.Ф., 1982] и лососевых рыб [Воронина Е.П., 1997 (1); 1997 (2)]. Это связано с тем, что в желудок сома поступают крупные пищевые объекты, что вызывает необходимость, с одной стороны, большей емкости для приема пищи и, следовательно, увеличение кардинальной части желудка, а с другой - скорейшую эвакуацию из желудка переваренной части пищевого комка. Более сильное развитие пилорической части желудка и ее мышечного сфинктера препятствовало бы этому. В стенках желудка различают слизистую, подслизистую и мышечные оболочки. Слизистая оболочка желудка, когда он не растянут пищей, имеет сложный рельеф, но вторичная складчатость здесь менее развита (рис. 3). Полость желудка сома выстилает многослойный эпителий (рис. 3, 7), кроме этого здесь имеются многочисленные трубчатые желудочные железы (рис. 3, 2). Под многослойным эпителием, основная функция которого секреция муцина, находится собственная пластинка слизистой оболочки tunica propria (рис. 3, 3), составляющая почти половину толщины стенки желудка. Бокаловидные клетки в фундальной части желудка не обнаружены. Простые трубчатые желудочные железы с разветвленными концевыми отделами не образуют сплошного слоя, как у рыб семейства Channichthyidae [Воронина Е.П., Неелов А.В., 2001]. Желудочные железы большинства рыб имеют общее строение и представлены одним типом клеток, основная функция которых - секре ция пепсиногена и выделение соляной кислоты. Далее, непосредственно к tunica propria прилегает тонкий слой подслизистой оболочки, обеспечивающий растяжимость желудка (рис. 3, 4). Широкая мышечная оболочка (рис. 3, 5) состоит из продольного кольцевого слоя гладких мышечных волокон. Кольцевой слой мышечных волокон в 4-5 раза превышает толщину продольного слоя. Снаружи желудок окружен тонкой серозной оболочкой.
Кишечник (рис.1, 5) отделен от желудка сфинктером и представляет собой трубку, которую визуально трудно дифференцировать на отделы, так как она не имеет сколько-нибудь заметных утолщений, ширина ее просвета постепенно убывает спереди назад. Однако, по аналогии с высшими позвоночными небольшой участок, лежащий сразу за желудком, в который впадают протоки желчного пузыря и поджелудочной железы, называют двенадцатиперстной кишкой (рис. 1, 4). Весь кишечник подвешен на брыжейках, которыми соединены его части [Иванов А.А., 2003]. Стенка кишечника состоит из слизистого, подслизистого и мышечного слоев. Слизистый слой кишечника образует серию асимметричных складок. Мышечный слой гораздо тоньше, чем у желудка. Основные функции кишечника - секреторная, гидролитическая и всасывание питательных веществ. Секреторная и гидролитическая функции осуществляются в двенадцатиперстной кишке, куда впадает крупный панкреатический проток соединенный с желчным протоком.
Поджелудочная железа сома (рис. 4) является вполне компактным органом состоящим из нескольких лопастей. В литературных источниках имеются сведения, что у большинства видов рыб поджелудочная железа не представляет собой компактного органа, а разбросана в виде маленьких долек между кишечными петлями или располагается вдоль кровеносных сосудов, облегая их, как футляр, проникает с ними в печень, образуя орган - гепатопанкреас [Суворов Е.К., 1948]. У сома европейского таких особенностей строения поджелудочной железы отмечено не было.
Поджелудочная железа в гистологическом и функциональном отношении неоднородна. Различают эндокринную и экзокринную часть железы. Эндок-ринная часть поджелудочной железы, выполняющая внутрисекреторную функцию, у рыб и наземных позвоночных животных представляет собой систему неравномерно разбросанных в массе экзокринной ткани скоплений клеток, называемых островками Лангерганса. Экзокринная часть представляет собой группу клеток, называемых ацинусами, которые имеют форму альвеол или трубочек конической формы. Между соседними ацинарными клетками находятся межклеточные канальцы, куда изливается часть секрета. Ацинусы переходят в выводные протоки. Основная функция поджелудочной железы - секреторная. Местом биосинтеза всех секреторных веществ являются рибосомы, находящиеся на мембранах гранулярного эндоплазматического ретикулома ацинарных клеток поджелудочной железы. Протеолитические ферменты в неактивной форме содержатся в зимогенных гранулах ацинусов [Сорвачев К.Ф., 1982; Уго-лев A.M., Кузьмина В.В., 1993; Кузьмина В.В., Гельман А.Г., 1998].
Пищеварительные процессы взаимосвязаны между собой и зависят от температуры среды. При охлаждении температуры воды до 7-5С сом переста ет питаться, в связи с чем ослабляется ферментативная и моторная активность пищеварительного тракта. Активный период питания начинается весной, когда вода прогревается до температуры 20С [Мовчан Ю.В., 1988].
Определение изоэлектрических точек протеиназ слизистой оболочки желудка
В результате проведенной работы из слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы сома европейского были выделены и охарактеризованы протеолитические ферменты. Пепсины (аспартильные протеиназы слизистой оболочки желудка), а также сериновые протеиназы поджелудочной железы (трипсин, химотрипсин и эластаза) сома - ферменты встречающиеся у всех позвоночных животных. Выделенные ферменты обнаружили много сходных свойств с протеиназами других позвоночных животных, но имелись и отличительные особенности. Впервые было установлено, что исследуемые протеиназы сома представлены несколькими изоформами, значения изоточек которых нами были определены. Также впервые были определены молекулярные массы большинства исследуемых ферментов, установлены диапазоны рН стабильности и активности, по различным субстратам, с указанием оптимумов. Впервые исследовано взаимодействие этих протеиназ с ингибиторами.
Для разделения протеолитических ферментов слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы сома по молекулярным массам был использован сефадекс G-75. Изоэлектрические точки исследуемых протеиназ определяли изоэлектрофокусированием в градиенте плотности сахарозы. Ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе удалось разделить изоформы пепсинов, трипсинов, химотрипсинов и эластаз. У аминопептидазы сома изоформ обнаружено не было.
Отличительной особенностью слизистой оболочки желудка сома являлось наличие многослойного эпителия, как у лососевых рыб [Воронина Е.П., 1997 (1)], тогда как у других видов рыб и амфибий эпителий однослойный [Воронина Е.П., Неелов А.В., 2001; Фиц И.В., 2001]. Из трех выделенных пепсинов, две изоформы с pi 3,20 и pi 4,75 обладали свойствами типичными для пепсинов типа II рыб, а изоформа с pi 1,90 по некоторым свойствам (оптимумы рН стабильности и активности, температурный оптимум действия) имела больше сходства с пепсинами млекопитающих, чем рыб. Пепсин с pi 3,20 в слизистой оболочке желудка сома был представлен в большем количестве, чем другие изоформы. Эта же изоформа пепсина обладала молярной активностью в 1,5 раза выше, чем пепсин свиньи.
Поджелудочная железа сома является вполне компактным органом, состоящим из нескольких лопастей, общий проток которой перед впадением в двенадцатиперстную кишку соединяется с желчным. Протеолитические ферменты, выделенные из поджелудочной железы сома, и соответствующие про-теиназы позвоночных животных других классов имеют как общие черты, так и отличия. Общие свойства трипсинов: примерно одинаковые молекулярные массы, оптимумы рН активности находятся в щелочном диапазоне, протеиназы стабилизируются ионами Са , обладают единой субстратной специфичностью, их активность угнетается ингибиторами сериновых протеиназ. Отличительные особенности трипсинов сома, как и других видов рыб: все изоформы трипсинов - анионные, тогда как большинство трипсинов млекопитающих являются кати-онными [Kleine R., 1969; Walsh К., 1970]; трипсины не стабильны в кислой среде, а соответствующие ферменты млекопитающих стабильны около рН 3,0-4,0 [Voytek P., Gjessing Е., 1971; Проскуряков М.Т., 1973; Нортроп Д. и соавт., 1950]; оптимум рН действия ферментов сома и других видов рыб находится при более щелочных значениях рН, чем у млекопитающих [Smillie L. et al., 1968; Проскуряков М.Т., 1973]; широкие диапазоны рН стабильности и активности, в отличие от трипсинов млекопитающих; трипсины сома и некоторых других видов рыб [Хаблюк В.В., 1983; Зозуля Л.В., 1996] угнетаются ингибиторами сильнее, чем трипсины млекопитающих.
Особенности свойств, присущие трипсинам сома, можно применить и к химотрипсинам его поджелудочной железы, исключая высокую молярную активность. Кроме перечисленных отличий, нами были выделены особенности химотрипсинов сома, как вида имеющего желудок. Количество изоформ хи-мотрипсинов видов рыб обладающих желудком не превышает трех, в отличие от них у безжелудочных видов было обнаружено около шести изоформ [Хаб 143 люк В.В., 1983; Зозуля Л.В., 1996]. Все изоформы химотрипсина сома — анионные, а у соответствующих ферментов безжелудочных видов (карпа и толстолобика) имеются и катионные изоформы. Химотрипсины сома, в отличие от аналогичных ферментов карпа и толстолобика, не обладают высокой молярной активностью. Вероятно, это связано с наличием желудочного пищеварения.
Эластазы сома, выделенные из поджелудочной железы, по субстратной специфичности и некоторым другим свойствам (значения изоточек, оптимумы рН действия, молекулярные массы) были отнесены нами к эластазам I (эластаза сома с pi 6,17) и II (эластаза сома с pi 8,48). Наличие в поджелудочной железе двух типов эластаз характерно для многих видов рыб [Asgeirsson В. et al., 1998; Reeck G. et al., 1970; Gildberg A., Overbo K., 1990] и большинства позвоночных животных других классов [Фиц И.В., 2001; Нечепуренко В.В., 1998; Pubols М., 1991; Lewis U. et al. 1956; Tiegelkamp S., Quandt J., 1997; Szilagyi C. et al., 1995; Largman С et al., 1976]. Катионная эластаза II сома была представлена в значительно большем количестве, чем анионная эластаза I. Подобное соотношение эластаз наблюдалось и у других видов рыб [Хаблюк В.В., 1983; Reeck G. et al., 1970], земноводных [Фиц И.В., 2001] и птиц [Нечепуренко В.В., 1998]. Имеется ли такое соотношение эластаз I и II у млекопитающих утверждать трудно, так как в доступной нам литературе не оказалось данных по сравнительному содержанию 2-х форм эластазы.
Аминопептидаза сома, очищенная из экстракта поджелудочной железы, не проявляла свойств типичных для лейцил аминопептидаз, так как не активи-ровалась ионами Mg и Мп , слабо ингибировалась ЭДТА и проявляла субстратную специфичность не совсем характерную для лейцил аминопептидаз. По этим свойствам аминопептидаза сома ближе к трипептид аминопептидазам, чем к другим аминопептидазам.
Благодаря высокой удельной активности протеолитических ферментов сома европейского слизистая оболочка желудка и поджелудочная железа могут служить недорогим источником ферментных препаратов с широким спектром применения.
Таким образом, на основании полученных данных и сравнительного анализа протеолитических ферментов сома европейского и позвоночных животных других классов можно сделать вывод, что сходство распределения и свойств протеиназ в желудочно-кишечных трактах различных видов свидетельствует о единых молекулярных механизмах приспособления к быстрому и более полному перевариванию белковой пищи, а отличия являются адаптивными приспособлениями, характерными для представителей различных классов.
