Содержание к диссертации
Введение
Глава 2. Материалы и методы исследования 24
2.1. Постановка эксперимента 24
2.2 Получение биологического материала 25
2.3. Определение количества белка в плодовых телах вешенки обыкновенной 25
2.4 Методы исследования протеолитической активности ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по природным субстратам 28
2.4.1 Определение протеолитической активности ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по молочно-ацетатной смеси 28
2.4.2 Определение протеолитической активности ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по денатурированному гемоглобину 29
2.4.3 Определение активности щелочных протеиназ экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по казеину 30
2.5 Методы определения физико-химических свойств 31
2.5.2 Определение рН стабильности молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной 31
2.5.3 Определение термостабильности молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной 32
2.5.4 Определения температурного оптимума активности молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной 32
2.5.5 Методика изучения действия ингибиторов на молокосвертывающие ферменты экстракта вешенки обыкновенной 33
2.6 Определение оптимальных условий экстрагирования молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной 33
2.7 Ступенчатое фракционирование белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной сульфатом аммония 34
2.8 Осаждение белков, обладающих молокосвертывающей активностью, из экстракта плодовых тел вешенки обыкнолвенной с помощью хлорида натрия 35
2.9 Гель-хроматографичекое разделение белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной 35
2.10 Изоэлектрическое фокусирование белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной 36
2.11 Ионообменная хроматография белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной
2.12 Метод получения сырного сгустка
2.13 Статистическая обработка
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Сравнительная оценка методов определения концентрации белка в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной
3.3 Определение оптимальных условий экстрагирования белков из плодовых тел вешенки обыкновенной
3.4 Осаждение белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенно-сульфатом аммония
3.5 Осаждение белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенно хлоридом натрия
3.7 Изоэлектрическое фокусирование белковой фракции плодовых тел вешенки обыкновенной, обладающей молокосвертывающей активностью
3.8 Ионообменная хроматография молокосвертывающих белков
плодовых тел вешенки обыкновенной
3.9 Изучение физико-химических свойств молокосвертывающих белко плодовых тел вешенки обыкновенной
3.10. Сравнительный анализ физико-химических свойств молокосвертывающих протеиназ вешенки обыкновенной с протеиназам из грибов, животных и растений
3.11 Получение сырного сгустка
3.12 Способ получения ферментного препарата из плодовых тел обыкновенной
Заключение
Выводы
Список литературы
Перечень использованных сокращений
Приложение А
Приложение Б
Приложение В
- Определение количества белка в плодовых телах вешенки обыкновенной
- Изоэлектрическое фокусирование белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной
- Определение оптимальных условий экстрагирования белков из плодовых тел вешенки обыкновенной
- Изучение физико-химических свойств молокосвертывающих белко плодовых тел вешенки обыкновенной
Введение к работе
Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности. Основным источником их получения является поджелудочная железа и слизистая желудка крупного рогатого скота и свиней. Данный ресурс является ограниченным. Поэтому остается актуальным поиск новых продуцентов гидролаз, а также расширение знаний о свойствах таких ферментов. Особого внимания этот вопрос заслуживает в связи с возрастающим дефицитом в пищевой промышленности протеиназ сычужного действия. Одной из перспективных групп являются базидиальные грибы. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что среди базидиальных дереворазрушающих грибов имеются активные продуценты молокосвертывающих протеиназ (Бойко, Стадничук, 2001). По сравнению с широко используемыми продуцентами молокосвертывающих протеиназ родов Endothia и Aspergyllus базидиомицеты имеют ряд преимуществ. Например, отсутствие плодоношения в культуре, что позволяет снизить риск развития аллергических заболеваний, а также отсутствие загрязнения ферментных препаратов бактериальными культурами. Установлено, что гриб Irpex lacteus Fr. способен образовывать протеиназы, которые могут стать заменителями сычужного фермента (Kikuchi, Kobayashi, Kusakabe, 1985). Способы получения соответствующего ферментного препарата и молочных продуктов с использованием данного ферментного препарата защищены международными патентами (United States Patent 3607655, 3212905, 3275453). Скрининговые исследования показали наличие молокосвертывающей активности у многих видов базидиальных грибов (Федорова, 1973), в том числе и для некоторых, культивируемых в промышленных масштабах. Например, в культуральном фильтрате вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.) обнаружены протеиназы, способные створаживать молоко. Данный вид гриба выращивается по всему миру, не токсичен, а его плодовые тела перспективны для всестороннего исследования, так как могут являться относительно дешевым и удобным сырьем для получения ферментных препаратов.
Целью нашей работы являлось выделение, очистка и исследование физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm.), а также изучение возможности использования ферментного препарата сычужного действия из плодовых тел вешенки обыкновенной в промышленности.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Выделение и очистка молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной.
2. Исследование физико-химических свойств ферментов (оптимумы активности и стабильности, изоэлектрическая точка, взаимодействие с ингибиторами).
3. Изучение возможности применения ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной для получения сырного сгустка.
Научная новизна работы. Установлено, что молокосвертывающая активность экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной связана с наличием трех белков-ферментов с близкими молекулярными массами 35 – 40 кДа, которые находятся в состоянии проферментов и имеют точки изоэлектрофокусирования 4,2, 6,7 и 8,8. Ферменты с изоточками 4,2 и 6,7 являлись металлопротеиназами, а с изоточкой 8,8 относился к классу сериновых протеиназ. Показано, что молокосвертывающие ферменты сохраняют активность при их высаливании 100% насыщенным раствором NaCl. Условия, при которых из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной в стабильном состоянии хлоридом натрия осаждаются молокосвертывающие ферменты, установлены впервые.
Разработаны научные основы применения плодовых тел вешенки обыкновенной в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. В плодовых телах Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm обнаружена высокая молокосвертывающая активность, принадлежащая трем протеолитическим ферментам, два из которых являются металлопротеиназами, а один относится к классу сериновых протеиназ.
2. Молокосвертывающие ферменты гриба находятся в состоянии проферментов, автоактивация которых происходит в течение двух часов при 35 С и рН 6,01.
3. Молокосвертывающие ферменты вешенки обыкновенной при осаждении из экстракта 100 % раствором, насыщенным хлоридом натрия и рН 3,6 сохраняются в стабильном состоянии.
4. Молокосвертывающие ферменты из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной могут использоваться для получения сырного сгустка.
Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящая работа выполнена в области фундаментальных исследований биохимии грибов порядка Agaricales. Установлен тип строения активных центров молокосвертывающих ферментов плодовых тел вешенки обыкновенной. Полученные результаты расширяют данные о физико-химических свойствах протеолитических ферментов грибов.
Разработаны способы получения ферментных препаратов и методы выделения молокосвертывающих протеиназ. Для промышленного использования разработана линия производства молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной. Показана возможность использования такого препарата в сыроделии на стадии образования сгустка.
Апробация работы. Материалы работы докладывались на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы научных исследований-2007» и международной научно-практической конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании 2007».
Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ (0,34 п.л., личный вклад 80 %), в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ – 2 статьи и 2 патента.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 90 страницах и состоит из введения, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографии (55 отечественных и 63 зарубежных источника). Диссертация содержит 7 таблиц и 18 рисунков.
Определение количества белка в плодовых телах вешенки обыкновенной
Ферменты широко применяются в ряде промышленных производств. Протеазы составляют около 60 % всего рынка ферментов вследствие своего широкого применения в пищевой и фармацевтической промышленности (Ikasari, Mitchell, 1996). Например, аспергиллопепсин I (Ф.К. 3.4.23.18), дей-теролизин (Ф.К. 3.4.24.39) и кислая карбоксипептидаза из представителей рода Aspergillus используются в процессах ферментации для приготовления традиционных японских пищевых продуктов (Ichishima, 2000).
С увеличением выработки сыров возрос интерес к замене химозина (Ф.К. 3.4.23.4) ферментами растительного и животного происхождения. Проведен ряд исследований по выделению молокосвертывающих ферментов - заменителей химозина из высших грибов. В Японии в 70-е годы 20 века были изучены 44 штамма базидиомицетов на способность синтезировать мо-локосвертывающие ферменты. Установлено, что два вида грибов — Irpex laceus Fr. и Fomitopsis pinicola (Fr.) Karst. — образуют протеазы, являющиеся хорошими заменителями сычуга (Денисова, 1984). В статье Л.Н. Федоровой и А.Н. Шивриной (1974) исследован ряд протеолитических ферментов, обладающих молокосвертывающими свойствами и образуемых культурами высших базидиальных грибов. Изучено 79 штаммов (51 вид). Исследованию подвергалась культуральная жидкость, отфильтрованная от мицелия. О степени активности судили по времени створаживания молока. Среди изученных 79 штаммов 46 синтезировали протеазы, обладающие способностью створаживать молоко. Перспективными для дальнейшего изучения видами признаны Antrodia mollis и все штаммы Flammulina velutipes. Исследованию подвергалась и вешенка обыкновенная, но, по сравнению с другими штаммами, обладала относительно низкой активностью.
В работе F. Nerud, Z. Mizurkova и V. Musilek (1988) из ряда культур -продуцентов внеклеточных молокосвертывающих ферментов были отобраны Phellinus chrysoloma, Kuchneromyces mutabilis и Ganoderma aplanatum. В paботе установлено, что обнаруженные ферменты принадлежат к кислым про-теиназам и стабильны при 40 С в диапазоне рН от 3,0 и 5,5. По значению отношения молокосвертывающей активности к общей протеолитической активности из изученных штаммов авторами выбран P. chrysoloma, как сравнимый по данному признаку с химозином.
В работе Н.В. Псурцевой и А.Я Мнухиной (1997) изучался ряд биохимических, морфологических и физиологических характеристик культур нескольких штаммов Flammulina P.Karst У всех исследованных штаммов отметили наличие молокосвертывающей активности.
В диссертационной работе Н.П. Денисовой (1991) предложены схемы распределения в плодовых телах и мицелиальных культурах базидиомицетов протеиназ с молокосвертывающей активностью (МСА), позволяющие прогнозировать поиск видов с заданными биохимическими характеристиками и уточнять систематическое положение некоторых видов. Разработаны способы получения ферментных препаратов и методы выделения протеиназ в гомогенном состоянии. Среди агарикоидных базидиомицетов исследовано на предмет МСА 237 видов, из них количество активных видов составило 7 % (17 видов). Они принадлежат к семействам Pleurotaceae, Tricholomataceae, Cortinariaceae и Russulaceae. Биосинтез протеиназ различной субстратной специфичности более выражен у макромицетов с сапротрофным типом питания, тяготеющих к древесным и богатым органикой (лигно-целлюлозными компонентами) субстратам.
В работе Т.А. Дмитриевой, А.В. Корчмаревой и М.М. Шамцян (2007) из ряда культур базидиомицетов выбран вид Coprinus lagopides как обладающий наиболее высокой молокосвертывающей и низкой общей протеолитической активностью. Авторами получен сухой ферментный препарат с удельной активностью 76000 ед./г и отмечено, что его использование в качестве коагулянта приводило к образованию плотного эластичного сгустка без привкуса горечи. Таким образом, в качестве продуцентов ферментов заменителей животного химозина предложено использовать следующие виды базидиальных грибов: Antrodia mollis, Flammulina velutipes, Phellinus chrysoloma, Coprinus lagopides. Установлено также, что среди базидиомицетов перспективной для изучения с целью поиска источников протеолитических ферментов является группа дереворазрушающих грибов. В фармацевтической промышленности широко используются фибринолитические ферменты. В связи с дефицитом животного сырья поиск фибриназ проводился и среди микологических объектов. Фибринолитическая активность описана для Flammulina velutipes, Pleurotus ostreatus, Grifola frondosa и Tricholoma saponaceum (Lee et al., 2005). Выделенный из культуры Almillaria mellea фибринолитический фермент является металлопротеиназой с молекулярной массой 21 кДа (Lee et al., 2005). Авторами было обнаружено, что фермент проявлял высокую степень специфичности по отношению к субстрату S-2586 для химотрипсина, что позволило сделать заключение, что выделенная протеиназа является химотрипсино-подобной. В результате полученных данных авторы пришли к выводу, что протеиназа из культуры A. mellea может быть потенциальным источником лекарственных средств в терапии тромбозов.
Кроме применения молокосвертывающих препаратов в пищевой промышленности и фибринолитических в медицине, предложено применение изучения активности протеолитических ферментов для определения таксономической принадлежности обнаруженных видов грибов (Гзогян и др., 2005). Так, в работе J.B. Taylor (1977) культуры базидиомицетов, изолированные из корневой системы плодовых деревьев, исследовались с помощью 26 биохимических анализов, в том числе изучалась желатиназная активность штаммов. Три группы были идентифицированы до вида путем сравнения их биохимических реакций с реакциями изолятов плодовых тел данных видов. Однако, при изучении широкого спектра ферментативной активности культур базидиомицетов экспресс методом при помощи качественных энзимати ческих реакций в работе N.V. Psurtseva, A.Y. Mnukhina (1998) была показана невозможность использования этого метода как дополнительного критерия при таксономической идентификации культур рода Flammulina. Таким образом, новые данные о физико-химических свойствах протеиназ грибов могут быть полезными для установления филогенетических связей различных представителей, а также облегчить поиск новых продуцентов биологически активных веществ с заданными характеристиками.
Изоэлектрическое фокусирование белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной
Для проведения ингибиторного анализа готовили серию растворов различных концентраций следующих ингибиторов: фенилметилсульфонилфто-рида (ФМСФ) (Досон и др., 1991), моноиодацетата (Methods in enzymology, 1970), пепстатина (Workmann et al., 1979) и этилендиаминтетраацетата (ЭДТА). Затем смешивали с раствором исследуемого фермента в соотношении 1:1. Раствор фермента готовили такой концентрации, чтобы он сворачивал 2.5 мл МАС не быстрее, чем за 7 минут (что соответствует 0,25 мг/мл химот-рипсина быка). В эксперименте с пепстатином инкубировали 10 минут при температуре 35 С, в остальных случаях инкубацию смеси проводили при комнатной температуре. Через 10 минут оценивали молокосвертывающую активность по методу Пятницкого. Активность оценивали в трех повторно-стях. В качестве контроля в смесь вместо ингибитора добавляли дистиллированную воду. В эксперименте с моноиодацетатом применяли активирующую смесь для тиоловых ферментов (Methods in enzymology, 1970). В данном эксперименте также ставился дополнительный контроль, в котором к ферменту приливали активирующую смесь и воду в соотношениях 3:2:1 соответственно. 2.6 Определение оптимальных условий экстрагирования молокосвертываю-щих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной После получения грубого экстракта путем гомогенизации, замораживания-размораживания и фильтрования, оставшуюся грибную массу заливали раствором кислоты или щелочи определенного рН в количестве 1: 1 по объему, выдерживали в течение двух часов при комнатной температуре; затем, после повторного экстрагирования, оценивали молокосвертывающую активность по методу Пятницкого. Активность оценивали в трех повторностях. рН доводили с помощью 1н раствора НС1 и 1 н раствора NaOH. 2.7 Ступенчатое фракционирование белков из экстракта плодовых тел ве-шенки обыкновенной сульфатом аммония Принцип метода заключается в том, что различные белки осаждаются из раствора при различной концентрации соли. Постепенно повышая концентрацию соли, можно получить ряд отдельных фракций с преимущественным содержанием выделяемого фермента в одной из них. Степень насыщения экстракта сульфатом аммония, при которой в осадок выпадут молокосвертывающие ферменты, определяли ступенчатым фракционированием. Количество сульфата аммония, необходимое для получения нужной степени насыщения вычисляли по формуле: где Х- количество сульфата аммония (г), добавляемое для получения необходимой степени насыщения; V - исходный объем экстракта (мл) с концентрацией Сь равной первой степени насыщения; Сг - требуемая степень насыщения (Кочетов, 1980). Эксперимент проводили следующим образом. К необходимому объему экстракта добавляли рассчитанное количество сульфата аммония до 0,1 степени насыщения. Оставляли экстракт при температуре 4 С на 30 минут, затем фильтровали. После этого измеряли объем экстракта, рассчитывали необходимое количество соли для степени насыщения 0,2 и повторяли описанную процедуру. Таким образом, постепенно доводя экстракт до полного на- сыщения сульфатом аммония, получали серию осадков, которые растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды. В растворе определяли количество белка, протеолитическую активность по методам Пятницкого и Кунитца. 2.8 Осаждение белков, обладающих молокосвертывающей активностью, из экстракта плодовых тел вешенки обыкнолвенной с помощью хлорида натрия Осаждение фермента хлоридом натрия проводили при полном насыщении. Необходимое количество соли рассчитывали, исходя из данных о растворимости хлорида натрия при 20 С. Для выяснения оптимальных условий осаждения, экстракт доводили до различных значений рН в диапазоне от рН 2,5 до рН 9,0. Затем насыщенный солью раствор центрифугировали в течение 15 минут при 6000, осадок отделяли, растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды и оценивали МСА в осадке и супернатанте. 2.9 Гель-хроматографичекое разделение белков экстракта плодовых тел ве шенки обыкновенной Молекулярные массы молокосвертывающих ферментов из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной определяли с помощью гель-хроматографии. Для гель-хроматографического разделения использовали колонку 1,9x75 см, заполненную сефадексом G-75 Superfine фирмы «Pharmacia» (Швеция) и уравновешенную 0,01 М ацетатным буфером, рН 5,0. Подготовку и регенерацию сорбента проводили способом, описанным в работе Л.А.Остермана (1985). Белки элюировали 0,01 М ацетатным буфером рН 5,0 со скоростью 12 мл/час. Объем фракций 4 мл. Для сбора фракций использовали коллектор «UltroRak» LKB (Швеция). Во фракциях определяли количество белка (оптическая плотность при D280) и молокосвертывающую активность по методу Пятницкого. Активность оценивали в трех повторностях.
Принцип метода заключается в том, что амфотерная макромолекула, попадая в антиконвекционную среду с градиентом рН, увеличивающимся в направлении от анода к катоду, начинает мигрировать в электрическом поле в соответствии со своим поверхностным зарядом. При этом заряд будет постепенно уменьшаться. Движение продолжается до тех пор, пока молекула не достигнет зоны, где ее заряд окажется равным нулю, т.е. зоны с рН, равным pi этой молекулы. Таким образом, амфотерные макромолекулы достигают своего равновесного состояния и формируют узкие зоны (Ригетти, 1986)..
Изоэлектрическое фокусирование белков экстракта плодовых тел ве-шенки обыкновенной проводили на колонке LKB объемом 110 мл в течение 24 ч. Использовали амфолины рН 3,5-10 фирмы «Pharmacia» (Швеция). В качестве антиконвекционной среды применяли градиент плотности сахарозы («Лаверна», Россия). Заполнение колонки проводилось в соответствии с методикой, описанной в работе П. Ригетти (1986). После разделения собирали фракции объемом 2,5 мл. Для этого использовали коллектор «UltroRak» LKB (Швеция). В каждой фракции определяли значение рН, количество белка и протеолитическую активность по методу Пятницкого. Активность оценивали в трех повторностях.
Изоэлектрическое фокусирование белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной
Плодовые тела вешенки обыкновенной являются доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов.
Известен способ получения ренниноруссулина спиртовым осаждением культуральной жидкости базидиального гриба Russula decolorans Fr.0456, выращенного на кукурузном экстракте (Руденская и др. 1980). Однако применение в качестве осадителя этилового спирта вызывает значительную инактивацию протеолитических ферментов и не способствует стабильности препарата.
Наиболее близким к предложенному нами способу по технической сущности является способ получения ферментного препарата из штаммов Fomitopsis pinicola (Fr.) Karst (АТСС 20036) и Irpex lacteus Fr (IFO 5367), предусматривающий культивирование продуцентов на жидкой питательной среде при рН от 2 до 7, температуре от 20 С до 38 С в условиях аэрации, и последующее отделение ферментов из культуральной жидкости фильтрацией или центрифугированием, осаждением спиртом (этанолом, метанолом), который может быть заменен ацетоном или изопропанолом, либо сульфатом аммония (50 — 75 % насыщения экстракта). Полученные осадки высушивают-. ся под вакуумом или в морозильной камере (патент US 3858492).
Способ прост в исполнении, непродолжителен по времени, не требует токсичных реагентов. Однако более предпочтительным для пищевой промышленности осадителем является хлорид натрия. А применяемые продуценты не относятся к широко культивируемым съедобным грибам. Кроме того, получаемый таким образом ферментный препарат обладает недостаточно высокой молокосвертывающеи активностью и высокой протеолитической активностью, что затрудняет применение такого препарата для ускорения коагуляции молока в сыроделии.
Перед нами стояла задача создать ферментный препарат, который бы обладал высокой молокосвертывающеи и низкой общей протеолитической активностью. Задача решалась предложенным способом получения молокосверты-вающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной. Способ характеризовался тем, что плодовые тела вешенки обыкновенной гомогенизировали без жидкости, замораживали полученный гомогенат с последующим размораживанием и разделением на экстракт и осадок. Осадок соединяли с дистиллированной водой в соотношении 1:1, выдерживали при температуре +4 - +8 С, отделяли вторичный экстракт и соединяли его с ранее полученным экстрактом. В смесь экстрактов добавляли 1н соляную кислоту до достижения рН 3,8 и осуществляли осаждение насыщением раствора хлоридом натрия при температуре +4 - +8 С. Отделяли полученный осадок и высушивали вымораживанием при температуре -18 —20С. Высушенный осадок хранили в холодильнике. Перед применением растворяли в минимальном количестве воды и центрифугировали. Осаждение проводили при концентрации хлорида натрия в растворе 35,9%. Цифра получена исходя из данных о растворимости хлорида натрия в воде при температуре 20 С. Совокупность существенных признаков предложенного способа обеспечивает получение технического результата, который заключается в увеличении выхода молокосвертывающего фермента за счет частичной очистки его от других протеаз плодовых тел вешенки обыкновенной, а также в увеличении соотношения молокосвертывающей и общей протеолитической активности по сравнению с аналогом. При дальнейшем исследовании сравнили полученный ферментный препарат с известным (табл. 8). Как видно из результатов, приведенных в таблице 8, полученный фермент обладает высокой молокосвертывающей активностью, а так же значительно большим, чем у аналога, соотношением молокосвертывающей и общей протеолитической активности. В ходе проведенных исследований нами была также разработана линия производства молокосвертывающего ферментного препарата. Известна линия производства молокосвертывающего ферментного препарата, включающая гомогенизатор сырья, экстрактор, колонку, заполненную гидрофобным сорбентом, сушилку и измельчитель (RU 48 710). Известна также линия производства молокосвертывающего ферментного препарата из микроскопических грибов, включающая ферментер, чан для отделения культуральнои жидкости и промывки культуры, резервуар для осаждения, фритту для отделения осадка, центрифугу и вакуумную сушилку (температура 30 С) (Теплы и др., 1980). Так же как и описанные выше технические решения, предлагаемая линия производства молокосвертывающего ферментного препарата содержит центрифугу и сушилку, что позволяет производить сычужный препарат в более удобной для хранения и транспортировки форме - в виде порошка. Однако известные линии предполагают удаление клеток культуры продуцента в отход или на утилизацию. Вместе с тем клетки грибов содержат некоторое количество молокосвертывающего фермента, которое утрачивается при утилизации. Кроме того, известные линии требуют наличия ферментера для культивирования продуцента и не позволяет использовать в качестве сырья плодовые тела базидиальных грибов. Для решения поставленной задачи линия производства молокосвертывающего ферментного препарата, включающая гомогенизатор сырья, емкость для сбора экстракта, осадительную камеру, соединенную с дозатором кристаллической соли, центрифугу, дополнительно содержит морозильную камеру для более полного разрушения клеток продуцента фермента, а так же экстрактор с мешалкой для дополнительной экстракции фермента, позволяющий выделить из гомогената сырья дополнительное количество молокосвертывающего фермента и тем самым повысить процент его выхода. Схема предложенной линии производства приведена на рисунке 19.
Изучение физико-химических свойств молокосвертывающих белко плодовых тел вешенки обыкновенной
Совокупность существенных признаков предложенного способа обеспечивает получение технического результата, который заключается в увеличении выхода молокосвертывающего фермента за счет частичной очистки его от других протеаз плодовых тел вешенки обыкновенной, а также в увеличении соотношения молокосвертывающей и общей протеолитической активности по сравнению с аналогом.
При дальнейшем исследовании сравнили полученный ферментный препарат с известным (табл. 8). Как видно из результатов, приведенных в таблице 8, полученный фермент обладает высокой молокосвертывающей активностью, а так же значительно большим, чем у аналога, соотношением молокосвертывающей и общей протеолитической активности. В ходе проведенных исследований нами была также разработана линия производства молокосвертывающего ферментного препарата. Известна линия производства молокосвертывающего ферментного препарата, включающая гомогенизатор сырья, экстрактор, колонку, заполненную гидрофобным сорбентом, сушилку и измельчитель (RU 48 710). Известна также линия производства молокосвертывающего ферментного препарата из микроскопических грибов, включающая ферментер, чан для отделения культуральнои жидкости и промывки культуры, резервуар для осаждения, фритту для отделения осадка, центрифугу и вакуумную сушилку (температура 30 С) (Теплы и др., 1980). Так же как и описанные выше технические решения, предлагаемая линия производства молокосвертывающего ферментного препарата содержит центрифугу и сушилку, что позволяет производить сычужный препарат в более удобной для хранения и транспортировки форме - в виде порошка. Однако известные линии предполагают удаление клеток культуры продуцента в отход или на утилизацию. Вместе с тем клетки грибов содержат некоторое количество молокосвертывающего фермента, которое утрачивается при утилизации. Кроме того, известные линии требуют наличия ферментера для культивирования продуцента и не позволяет использовать в качестве сырья плодовые тела базидиальных грибов. Для решения поставленной задачи линия производства молокосвертывающего ферментного препарата, включающая гомогенизатор сырья, емкость для сбора экстракта, осадительную камеру, соединенную с дозатором кристаллической соли, центрифугу, дополнительно содержит морозильную камеру для более полного разрушения клеток продуцента фермента, а так же экстрактор с мешалкой для дополнительной экстракции фермента, позволяющий выделить из гомогената сырья дополнительное количество молокосвертывающего фермента и тем самым повысить процент его выхода. Линия производства молокосвертывающего ферментного препарата работает следующим образом. Подготовленное сырье подают в гомогенизатор 1 для измельчения. Измельченное сырье загружают в морозильную камеру 2 для окончательного разрушения клеток. Заем размораживают в камере 3 и в устройстве для разделения 4 с помощью вакуумного насоса отделяют экстракт, который перекачивают в камеру 6. Оставшийся гомогенат загружают в экстрактор 5 с мешалкой и заливают экстрагирующей жидкостью. Дополнительная экстракция гомогената позволяет повысить выход фермента. По окончании этого процесса отработанное сырье удаляют, а полученный экстракт перекачивают в камеру 6. В камере 6 происходит осаждение экстрагированного фермента солью. Смесь из камеры 6 передают на центрифугу 7 для отделения осажденного фермента. Затем осадок направляют на сушку, а надосадочную жидкость на утилизацию. Причем в отличие от известных способов, фермент высушивают при низкой температуре (- 4 - -18С). Что позволяет значительно снизить потерю активности. Таким образом, предлагаемая линия производства молокосвертывающего ферментного препарата позволяет повысить процент выхода готового продукта. С помощью методов хроматографии, изоэлектрического фокусирования, ингибиторного анализа и определения активности протеолитических ферментов нами изучены молокосвертывающие протеиназы из плодовых тел вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Китт). В ходе выполнения работы были подобранны условия для выделения и очистки молокосвертывающих протеиназ из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной. Показано, что автоактивация протеиназ в экстракте наблюдается после 2 часов инкубации при 35 С и рН от 6,01 до 6,84. Следовательно, дальнейшее исследование протеиназ требует их полной активации. Выяснено, что в плодовых телах вешенки обыкновенной находятся молокосвертывающие протеиназы, относящиеся к классам сериновых и метал-лозависимых протеиназ, с изоточками 4,2, 6,7 и 8,8 . Они стабильны в диапазоне от 3,5 до 7,5 единиц рН и до 50С, с температурным оптимумом при 35С.
В ходе исследований установлен диапазон степеней насыщения экстракта сульфатом аммония, в котором из него осаждаются молокосвертывающие протеиназы. Он составляет от 0,3 до 0,7 степеней насыщения раствора. При исследовании осаждения молокосвертывающих ферментов хлоридом натрия выявлено значение рН, при котором получается наибольший выход фермента- 18 %. Удельная молокосвертывающая активность данного препарата в 18 раз меньше активности сычужного фермента. Следовательно, для получения смеси, способной сворачивать молоко с такой же скоростью, как стандартный препарат сычужного действия с активностью 100000 ЕД/г, требуется в 18 раз больше фермента.
Похожие диссертации на Исследование некоторых физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной
