Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
I; ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1;1; Классификация и свойства протеина у низших эукариот 9
І;2; Протеолитические системы дрожжей и некоторых грибов 21
1;3; Биосинтез протеина и ert регуляция 34
1;4; Роль протеина в метаболизме микробной клетки - 41
1; 5? Практическое значение протеолитических ферментов 53
2. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 56
2.1 Условия культивирования гриба 56
2 2 Получение бесклеточных экстрактов 56
2?3. Определение активности ферментов 57
2; 4. Обработка и фракционирование бесклеточных экстрактов 60
2 -5. Аналитические методы 62
2;6. Приборы и материалы 64
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ В КУЛЬТУРАХ E.ASHBTII И ЕЕ ИЗМЕНЕНИЕ В ПРОЦЕССЕ РОСТА И ПОД ВЛИЯНИЕМ ИСТОЧНИКОВ АЗОТНОГО ПИТАНИЯ 66
3.1. Исследование протеолитической активности культуры гриба
3.2. Влияние ингибиторов на активность протеина гриба Б.
3.3; Изучение - изменения активности протеина гриба Е. в процессе роста
3.:4. Обнаружение внутриклеточных ингибиторов протеины с оптимумом рН 7,5
3.5. Регуляция биосинтеза протеина гриба E..ashbyii с оптимумами рН 4,0 и 7,5
4. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТЕИНАЗ ФЛ&ВЙНОГЕННОГО ГРИБА E.ASHBTCI С ОПТИМУМОМ рН 7,5
4.2. Температурная обработка 92
4.3; Хроматография
4.4. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 94
4.5. Влияние ингибиторов на активность, протеина Е, F и G полученных после ионообменной хроматографии на, ДЭАЭ-целлюлозе 96
4.6. Рехроматография фракции А ( протеина Е ) на ДЭАЭ-целлгалозе 97
4;7.: Обсуждение 97
5. СВОЙСТВА ПРОТЕИНАЗЫ Е ГРИБА E.ASHBTII 102
5;1. Влияние рН и температуры на активность протеина Е 102
5 2; Зависимость устойчивости протеиназы Е от рН 105
5J3. Действие in vitro протеины Е на различные белковые и синтетические субстраты 105
5 4. Определение молекулярной массы протеины Е 108
53. Влияние ингибиторов на активность протеины Е 108
5.6 Влияние ионов металлов на активность протеины Е ПО
5.7. Инактивации фермента термостабильным внутриклеточным ингибитором Ш
5;8. Действие протеины дрожжей
5 10. Обсуждение И7
6. В Ы В 0 Д Ы 119
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Традиционно протеины рассматривались как деградативные ферменты, способные расщеплять белки на пептиды и аминокислоты, роль которых заключается в переваривании питательного белка или участии в обмене клеточного белка.. Недавно, однако было: показано; что ограниченный.протеолиз играет ключевую роль в широком круге клеточных процессов С I, 2 )J что привело к интенсивному изучению протеолитических систем многих организмов. В последнее время возрастает интерес исследователей к протеолитичеоким системам эукариотичееких микроорганизмов-дрожжей и грибов. Протеиназы этих организмов важны по ряду причин. Ряд видов, например, SaccBaromyces cerevisIae Uettrospora crassa, Aspergillus nldu -lans,Physarium polycephaltm,nictiostelim ddLscoidetmi ,Tetrahy mena широко.применяются, для изучения молекулярных.оонов физиологических, процессов. Изучение, протеолитических ферментов этих видов помогает понять роль, которую выполняют протеиназы.и пептидазы во многих клеточных,событиях- ( )• Знание свойств.этих ферментов.также, важно, для.разработки методов; с помощью .которых можно: было.бы предотвратить артефакты;.вызванные протеолизом во время приготовления клеточных.-материалов ( h ) , - Поскольку протеолиз. может.играть, роль, в патогенезе, например, в проникновении, инфекционного агента в.организм хозяина и. в обмене веществ, во время инфекции, анализ.протеолитических.ферментов является,существенным фактором для понимания патогенеза некоторых болезней .Протеиназы из ряда.источников как микробной, так и немикробной природы,„широко, применяются в пищевой промышленности /хлебопечении, пивоварении производстве снраі.мягчении мяса/, в кожевенной промышленности и в производстве биологических детергентов С.
В литературе отсутствуют данные о протеолитичеоких ферментах флавиногенного гриба Erenrothecium aahbyii являющегося в СССР промышленным продуцентом витамина В2.
Дрожжеподобный гриб E.ashbyii хорошо усваивает в качестве источников азота растительные и животные белки и, следовательно, должен обладать способностью к образованию протеиназ; кроме того, при старении культуры наблюдаетоя активный лизис мицелия С. 7 ) - процесс J в котором!5 по-видимому,1 должны принимать, участие протеолитичеокие ферменты Однако до настоящего времени/ исследования протеолитической системы этого гриба не проводились.
В связи с указанным выше целью данной работы было выявить наличие протеолитической активности в бесклеточном экстракте и фильтрате культуральной жидкости гриба при различных значениях; изучить, изменение, уровня активности обнаруженных протеиназ в процессе, роста, гриба исследовать. ряд,аспектов регуляции биосинтеза некоторых из обнаруженных протеиназ; провести: очистку и исследовать свойства отдельных протеолитичеоких ферментов.. - - - .В результате проведенных исследований впервые изучена протео-литичеекая оиотема гриба E.ashbyii Показано наличие четырех оптимумов протеолитической активности в. мицелии гриба при рН 4,0. 7 5.; 9;5 ;.Д5,. В часовой культуре,, в .фильтратах ку» льтуральной жидкости обнаружена протеолитичеокая активность, при pft 4 0 и 7,г5.. Исследовано изменение, уровня, активности указанных протеиназ в процессе роста гриба. Изучена регуляция биосинтеза кислой и нейтральной протеиназ. Для протеиназ с оптимумом рН 7J5 обнаружена наличие термостабильного /ых/ внутриклеточного /ых/ ин -8-. гибитора (ов). Проведена очистка протеиназ с оптимумом рН 7,5. Изучено ряд свойств одного из этих ферментов ( протеиназы Е ).
