Содержание к диссертации
1. ВВЕДЕНИЕ б
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
2.1. Структура и основные физико-химические свойства трихотеценовых МИКОТОКСИНОВ
2.2. Биосинтез трихотеценовых микотоксинов 25
2.3. Метаболизм трихотеценовых микотоксинов 48
2.4. Характеристика методических подходов к изучению трихотеценовых МИКОТОКСИНОВ
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 67
3.1. Обоснование цели и выбора методов исследования 67
3.2. Материалы и методы исследования 69
3.2.1. Микологические методы исследования 69
3.2.1.1. Характеристика субстратов и штаммов грибов, выбранных для исследования
3.2.1.2. Культивирование грибов на субстрате 70
3.2.1.3. Экстракция токсичных фракций из биоматериала
3.2.2. Хроматографические методы исследования 74
3.2.2.1. Методы выделения и очистки трихотеценовых микотоксинов с помощью колоночной хроматографии
3.2.2.2. Препаративное выделение трихотеценовых микотоксинов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии
3.2.2.3. Анализ трихотеценовых микотоксинов методом тонкослойной хроматографии
3.2.2.3.1. Выбор адсорбента и систем раствори телей для разделения трихотеценовых микотоксинов в многокомпонентной смеси
3.2.2.3.2. Проявляющие реагенты, использовав шиеся при анализе трихотеценовых микотоксинов методом тонкослойной хроматографии
3.2.2.4. Анализ многокомпонентной смеси, содержащей трихотеценовые микотоксины, с помощью газожидкостной хроматографии
3.2.2.4.1. Определение индексов удерживания (Ковача) производных трихотецено-
вых микотоксинов
3.2.2.4.2. Определение калибровочного коэффициента для некоторых трихотеценовых микотоксинов группы А по н-трикозану
3.2.2.4.3. Расчет содержания трихотеценовых микотоксинов в анализируемом экстракте
3.2.2.4.4. Получение летучих производных трихотеценовых микотоксинов
3.2.3. Физико-химические методы исследования 92
3.2.3.1. Спектрометрия протонного магнитного резонанса (ПИР)
3.2.3.2. Масс- и хромато-масс-слектрометрия 92
3.2.3.3. Инфракрасная спектрометрия (ИК) 92
3.2.3.4. Флуороденситометрия 95
3.2.4. Реагенты, растворители и стандарты трихоте- дз ценовых микотоксинов
3.3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 94
3.3.1. Разработка метода идентификации и количест венного определения трихотеценовых микотоксинов с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии
3.3.1.1. Принципы подхода к разработке метода анализа многокомпонентной смеси, содержащей трихотеценовые микотоксины
3.3.1.2. Выбор типа летучих производных трихотеценовых микотоксинов
3.3.1.3. Разработка простого метода получениятрифторацетильных производных трихотеценовых шнсотоксинов
3.3.1.4. Выбор внутреннего стандарта при анализе трихотеценовых микотоксинов
3.3.1.5. Идентификация трихотеценовых микоток- іоо синов по параметрам удеркивания
3.3.1.6. Определение содержания трихотеценовых микотоксинов в анализируемых экстрактах
3.3.2. Разработка "Методических указаний по обнаруже- m пию, идетификации и определению содержания
Т-2 токсина б пищевых продуктах и продовольственном сырье"
3.3.3. Изучение токоинообразования s.sporotriohieiia цг
3.3.3.1. Изучение компонентного состава-трихоте- ц2 ценовых микотоксинов, продуцируемых
19-ю различными штаммами p. sporo--tricbieiia с помощью капиллярной газокидкостной хроматографии
3.3.3.2. Изучение токсинообразования f. sporo- п7 trichiella
Выбор токсигенного штамма 53
315 и изу- ц7 чение компонентного состава трихотеценовых микотоксинов, продуцируемых ИМ Б условиях максимального токсинообразо-вания
3.3.3.2.2. Выделение токсичного экстракта из суб- цэ страта, зараженного штаммом 53315, и
его фракционирование на компоненты методом жидкость-жидкостной экстракции
3.3.3.2.3. Изучение токсических свойств фракций,выделенных из зараженного субстрата
3.3.3.2.4. Изучение состава токсичной хлороформной фракции методом капиллярной газожидкостной хроматографии
3.3.5.3. Выделение из зараженного штаммом 124
533Г5 зернового субстрата в чиоюн виде, идентифицированных трихоте-ценовюс микотоксинов: Т-2, НТ-2, ит -І, неосоланиола, а такке двух неидентифицированных токсиновх и х
3.3.3.3.1. Установление структуры неиден тифицированного токсинах, про
дуцируемого F. sporotricbi-
єііа , штамм 53
315 и оценка его токсических свойств
3.3.3.3.2. Установление структуры неиден тифицированного токсина х ,
ПрОДуЦИруеМОГО F. sporo-fcri- cliiella , штамм 53315 и оценка его токсических свойств
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 141
5. В Ы В О Д Ы 149
6. ПРИЛОЖЕНИЕ 151
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ
"Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания Т-2 токсина в пищевых продуктах и продовольственном сырье" (Минздрав СССР, № 3184-84).
7. ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА 164
Введение к работе
Среди наиболее опасных загрязнителей пищевых продуктов особое место занимают микотоксины - вторичные метаболиты микроскопических грибов. В настоящее время известно свыше 100 микотоксинов, продуцируемых более 250-тью видами грибов и обладающие высокими токсическими свойствами, а некоторые из них - канцерогенными, мутагенными, тератогенными, эстрогенными своЁствами. К особо опасным микотоксинам относят группу трихотеценовых микотоксинов (ЇТМТ),
ВКЛЮЧаЮЩуЮ В Себя бОЛее 60-ТИ Представителей ( Bamburg J.R., 1983; иепо у., 1983). Внимание к этой группе микотоксинов привлечено ввиду повсеместной распространенности грибов-продуцентов ТТМІ, низкого температурного оптимума образования этих токсинов (климатические условия СССР), высоких токсических свойств и доказательства реальной опасности для здоровья человека (БилаЙ В.И., 1977; Тутельян В.А. , Кравченко JI.B., 1985 й).
Продуцентами ТТМТ ЯВЛЯЮТСЯ МИКрОСКОПИЧеСКИе ГрИбЫ рОДОВ tfusa-rium, Myrothecium, Stacliybotris, Trichoderma, Cephalosporin и др., среди которых особенно широко распространены грибы рода
Fusarium . НаибОЛЬШИЙ ИНТЄреС првДСТаВЛЯЮТ Грибы Fusarium зрого trichieiia , явившиеся этиологическим фактором алименгарной токсической алейкии (АТА) - тяжелого заболевания людей, а также алиментарных токсикозов животных (Саркисов АЛ., 1945, 1950, 1954; БилаЙ В.И., 1977; Мишустин Е.Н. и соавт., 1946; Олифсон Л.Е., 1965; Рубинштейн Ю.И., Лясс Л.С., 1948). До настоящего времени токсическое начало, вызывавшее АТА, не установлено; в литературе имеются лишь противоречивые данные. Олифсоном I.E., 1965) показано, ЧТО ТОКСИЧеСКИе СВОЙСТВа ЗаражеННОГО F. aporotricliiella зерна связаны с токсинами стероидной природы. Котик А.Н. и соавт., н Тутельян В.А.Кравченко Л.В. Микотоксины. М., Медицина, 1985.
1979) и мгосиа G.J. and Pathre s. і (1973) считают, что за развитие симптомокоыплекса ATA. ответственны ТТМТ.
Б основе строения ТТМТ лежит трициклический скелет - трихо-текан, содержащий 12,13-эпокси-группу. По химической структуре ТТМТ делят на четыре группы (иепо у., 198?).
Биосинтез ТТМТ осуществляется терпеноидным путем посредством конденсации трех молекул мевалоната через фарнезил-пирофосфат (Godtfredsen W.O. and Vangedal S.,1965; Achilladelis Б.А. et al., 1968, 1972). Следует подчеркнуть, что далеко не все этапы биосинтеза ТТМТ изучены в достаточной степени. В отношении метаболизма ТТМТ также нет полной ясности. Имеющиеся в настоящее время сведения касаются лишь отдельных ТТМТ, главным образом, Т-2 токсина. (Toshizawa і. et al. , 1980). Показано, что в организме животных Т-2 токсин деацилируется (при участии микросоиных ферментов) и может окисляться по боновой цепи с образованием более полярных метаболитов ( Yosbizawa т. et al., 1980, 1984; Chi M.S. et al., 1978a). Получены также доказательства участия реакции конъюгации в детоксикации Т-2 токсина (Кравченко Л.В. и соавт., 1983, 1984). Важно отметить, что прямое изучение как биосинтеза, так и метаболизма ТТМТ возможно лишь путем идентификации отдельных метаболитов в животных тканях, грибах и других биоматериалах. Для решения этой задачи необходимы высокочувствительные, точные, надежные и хорошо воспроизводимые методы анализа ТТИТ и их метаболитов.
Учитывая, что продуценты ТТМТ могут поражать пищевые продукты, продовольственное сырье и корма на любом этапе их производства и хранения, важной мерой профилактики микотоксикозов является организация контроля за их загрязнением ТТМТ. При этом центральным звеном является разработка высокочувствительных, доступных и нетрудоемких методов их идентификации и количественного определения. В настоящее время в большинстве методик анализа ТТМТ на ко печном этапе используются методы тонкослойной хроматографии (ТСХ), газожидкостной хроматографии (ГЖХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Наиболее чувствительным и селективным методом определения ТТМТ является ГЖХ, однако, большинство работ проведено с использованием наполненных колонок, что снижает эффективность и надежность метода; более перспективным представляется использование капиллярных КОЛОНОК ( Scott P.M. et al., 1981; Swan-son S.P. et ai. , 1983), Основной недостаток ТСХ и ВЭЮС методов - высокий предел обнаружения, ограничивающий в настоящее время их широкое применение.
Разработка методов анализа, ТТМТ, отвечающих современным требованиям, продолжает оставаться одной из наиболее актуальных проблем в химии ТТМТ,
В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось:
1. Разработка надежного и чувствительного метода обнаружения, идентификации и количественного определения ТТМТ в пищевых продуктах, продовольственном сырье и кормах с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГІХ).
2. Изучение с помощью разработанного метода токсигенного потенциала некоторых видов грибов рода pusarium , выделенных на территории СССР, Канады и Великобритании, и установление состава продуцируемых ими токсинов.
3. Изучение токсинообразования высокотоксигенного штамма 53315 Fusarium spororiciiieiia при культивировании на природном субстра-те и выделение в чистом виде продуцируемых им микотоксинов.
ПОИСК И Выделение НОВЫХ ТТМТ, Продуцируемых Б1, sporotri- chieiia и установление их структуры.
5. Разработка и внедрение в практику органов Госсакнадзора "Методических указаний по обнаружению,идентификации и определению содержания Т-2 токсина в пищевых продуктах и продовольственном сырье".
