Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Структура растворимой АТФазы и функции ее субъединиц 9
1. Субъединичный состав растворимой АТФазы - 9
2. Нуклеотидсвязывающие центры АТШазы и их функции 13
3. Функциональные группы нуклеотидсвязывающих центров митохондриальной АТФазы 17
4. Конформационные изменения АТФазы 20
Глава II. Структура и функции АТФазного комплекса митохондрий 24
1. Мембранные компоненты АТФазного комплекса митохондрий и их функции 25
2. Локализация фактора Fj в митохондриальной мембране 27
Глава III. Методы измерения мембранного потенциала 31
I. Методы измерения электрического потенциала 31
1. Прямые методы измерения электрического потенциала 31
2. Методы определения ДУ , основанные на измерении равновесного распределения пробных зарядов 34
3. Метод липидорастворимых проникающих ионов 37
4. Измерение трансмембранного электрического потенциала с помощью флуоресцентных зондов 38
2. Методы измерения градиента рН на сопрягающих мембранах . 42
1. Титрометрический метод 42
2. Распределение проникающих кислот 42
3. Измерение ДрН с помощью флуоресцентных и спиновых зондов 43
Глава ІV. Материалы и методы 47
Препаративные методы.
1. Вьщеление митохондрий из сердца быка 47
2. Выделение субмитохондриальных частиц /СМЧ/ 48
3. Выделение марганцевых субмитохондриальных частиц 49
4. Вьщеление субмитохондриальных частиц, лишенных фактора Fj 49
5. Выделение водорастворимой АТФазы /фактор Fj/ . 50
6. Реконструкция фактора FT с мембраной СМЧ 52
7. Модификация фактора Fj с профлавином 52
8. Модификация фактора Fj спиновыми метками 53
Аналитические методы
1. Определение концентрации белка 54
2. Определение АТШазной активности фактора Fj и субмитохондриальных частиц 54
3. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих реагентов 55
4. Измерение спектров флуоресценции профлавина . 55
5. Измерение электрического потенциала ДЧ с помощью проникающих анионов 55
6. Измерение спектров Электронного Парамагнитного Резонанса'/ЭПР/ 56
Глава V. Модификация митохондриального фактора спиновыми метками и разделение модифицированного фермента на субъединицы 58
Глава VІ. Локализация фактора Fj В митохондриальнои мембране 72
Глава VII. Измерение градиента рН на мембране субмитохондриальных частиц 85
Выводы III
Литература 112
- Нуклеотидсвязывающие центры АТШазы и их функции
- Локализация фактора Fj в митохондриальной мембране
- Измерение трансмембранного электрического потенциала с помощью флуоресцентных зондов
- Локализация фактора Fj В митохондриальнои мембране
Введение к работе
К настоящему времени установлено, что трансформация энергии основных энергетических ресурсов биосферы - солнечного света и органических веществ в биологических системах осуществляется по хемио-
СМОТИЧЄСКОЙ Схеме ЭНергеТИЧеСКОГО СОПрЯЖеНИЯ /MitcKell, 1961 ; Mitchell,
1966/. Согласно этой схеме, перенос электронов по дыхательным и фотосинтетическим ферментам приводит к генерации трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода /Д^ц+Л
Важнейшим постулатом гипотезы Митчела является принцип хеми-осмотического сопряжения окисления и фосфорилирования, согласно которому трансмембранное электрическое поле /ДЧ/ / и градиент рН используются АТФ-синтетазой для образования АТФ. Этот процесс обратим, гидролиз АТФ приводит к генерации Af*u+-
Таким образом, обратимая протонная АТФаза /Н+-АТФаза/ в биологических системах осуществляет взаимопревращение двух унифицированных форм энергии: АТФ и ДІЛ* Фермент функционируя, как протонная помпа, осуществляет трансмембранный перенос протонов по электрохимическому градиенту /синтез АТФ/ или против электрохимического градиента /генерация Д|*и+ /.
Исследование механизма функционирования АТФазного комплекса требует создания новых методов, позволяющих регистрировать протоно-форную функцию фермента. Важное значение для решения этой проблемы имеет также определение топографии функциональных групп и других реакционноспособных группировок в факторе Fj.
Первая часть настоящей работы посвящена выяснению локализации фактора Ft в митохондриальной мембране. Разработан простой метод
Нуклеотидсвязывающие центры АТШазы и их функции
Будкер с соавт. и Козлов с соавт. /Budker et ai., 1977; Козлов и др., 1977/ с целью выяснения локализации нуклеотидсвязывающих центров фактора FT использовали аналоги субстрата: алкилирующее производное АТФ, а также смешанные ангидриды нуклеозидтрифосфатов и мезитиленкарбоновой кислоты. Авторы показали, что б -4-/м-2-хлорэтил-м-метиламино/-бензиламид АТФ ковалентно модифицирует фермент. Инги-бирование АТФазы при этом коррелировало с включением одного моля ингибитора на моль фермента. Ингибирующее действие этого аналога субстрата ослабевалось, если в среде инкубации присутствовал АТФ. В дальнейших опытах было показано, что при модификации фактора Fj меченым #-4-/м-2-хлорэтилметиламино/-бензиламидом /- Р/-АТФ радиоактивность обнаруживается только на В субъединице фермента. На основе этих результатов, а также аналогичных данных, полученных при изучении взаимодействия фактора Fj со смешанными ангидридами /- ЧР/-АТФ или /8- Н/-АТФ и мезитиленкарбоновой кислоты, авторы сделали заключение о том, что активный центр митохондриальной АТФазы локализован на 6 субъединице фермента. Аналогичные результаты бЫЛИ ПОЛучеНЫ ВагеНВурДОМ С СОаВТ. /Wagenvoord et al., 1979/, которые исследовали связывание 8-азидо-АТФ с фактором Fj. Таким образом, как участок связывания аденина, так и место связывания три-фосфатного остатка в активном центре АТФазы локализованы на 6 субъединице. Лунарди с соавт. /Lunardi et al., 1977/ показали, что аналог АТФ, реакционноспособная группа которого расположена на расстоя о нии менее 10 А от аденинового ядра, связывается как d , так и с В субъединицами. Этот результат указывает на то, что активный центр митохондриальной АТФазы локализован вблизи области контакта с{ и в субъединиц. Эксперименты, Проведенные В лаборатории КагаВЫ /Yoshida et a 1., 1977/ показали, что активный центр АТФазы термофильных бактерий также локализован на ft субъединице фермента. Авторам удалось получить очищенные субъединицы фактора Fj. Реконструкция субъединиц в разных комбинациях показала, что необходимым условием сохранения АТФазной активности является присутствие в этой комбинации R субъединиц. С другой стороны, возможно, активный центр фактора Fj из некоторых бактерий локализован на о( субъединице. Так, для фактора Fj ИЗ бактерии E.coli /Verheijen et al., 1978/, а также ИЗ Micobacte rium phlei /Kumar et a 1., 1979/ показано, что аналоги АТФ" И АДФ включаются в с субъединицу фермента и ингибируют его АТФазную активность. На митохондриальной АТФазе, выделенной из различных объектов, был обнаружен центр, который обратимо с высоким сродством связывает АДФ /CatteralJ,Pedersen, 1972; Hilborn, Hammes, 1973/. Оказа лось, что ингибиторы АТШазной активности фактора Fj практически не действуют на способность этого центра связывать АДФ /Pedersen, 1975/. Включение АДФ в этот центр, который впоследствии был назван "некаталитическим центром", не приводит к ингибированию АТФазНОЙ аКТИВНОСТИ фактора Fj /Tondre,. Hammes, 1973/. С ЦеЛЬЮ ВЫЯСНе ния места локализации "некаталитического центра" /центров/, в нашей лаборатории была проведена серия экспериментов по изучению действия различных аналогов нуклеотидов на фактор Fj. Мильгром с соавт. /Koziov, Miigrom, 1э8о/ показали, что связывание одного моля меченного 2,3-диальдегидного производного АДФ на моль фермента не приводит к изменению АТФазной активности фактора Fj. Величина Код для АТФ" также не зависит от степени модификации фермента аналогом АДФ. Методом электрофореза в полиакриламидном геле было ПОКа-зано, что модификация фактора Fj посредством / Н/-ох-АДФ приводит к включению аналога АДФ в d субъединицу фермента. На основе полученных результатов авторы заключили, что некаталитический центр фактора Fj локализован на ol субъединице и он не принимает участия в гидролизе АТФ. Аналогичные результаты были получены при модификации фактора Fj флуоресцирующим аналогом АДФ OX-S-АДФ" /Koziov et al., 1979/. Помимо центров обратимого связывания нуклеотидов, растворимая АТФаза из различных объектов содержит центры прочного связывания /Harris, 1978; Slater, Kemp, 1979/. ПроЧНО связанными называют НЄ ковалентно связанные с ферментом нуклеотиды, которые не отделяются от белка при диализе и гель-фильтрации. Количество прочно связанных нуклеотидов составляет около четырех молекул на молекулу фермента И Меняется В ЗаВИСИМОСТИ ОТ Метода ВЫДелеНИЯ /Chernyak et al., 1981/. Фактор Fj является единственным местом локализации прочно связанных НуКЛеОТИДОВ В МИТОХОНДриалЬНОЙ Мембране /Harris et a 1., 1977/. Исследования, проведенные с активированными аналогами нуклеотидов, показали, что центры прочного связывания локализованы на с и {5 субъединицах. Можно полагать, что эти центры идентичны центрам обратимого связывания /активному или некаталитическому/ и служат центрами прочного связывания благодаря тому, что нуклеотиды в них экранированы от водной фазы белковыми глобулами. Это предположение подтверждают опыты с флуоресцентными аналогами нуклеотидов. Новикова с соавт. /Koziov et ai., 1979/ показали, что такие аналоги, находясь в центрах прочного связывания, только частично доступны для иодид-ионов, которые являются эффективными тушителями флуоресценции в растворе.
Локализация фактора Fj в митохондриальной мембране
Противоречивость экспериментальных данных по изучению расположения фактора Fj в мембране привели к созданию различных схем локализации фермента в митохондриальной мембране. На микрофотографиях мембран субмитохондриальных частиц, полученных методом негативного
Контрастирования, бЫЛИ Обнаружены грибОВИДНЫе ВЫРОСТЫ /Fernandez Moran, 1962/. Позже аналогичные структуры были найдены также на Мембранах бактерий И ТИЛаКОИДОВ ХЛОрОПЛаСТОВ /Abram, 1965, Lien, Racker,"1971/. В дальнейшем Рэкер идентифицировал эти грибовидные ВЫРОСТЫ Как АТФаЗНЫЙ КОМПЛеКС МИТОХОНДРИЙ /Racker et a 1., 1969/. На основании этих данных была предложена схема локализации АТФаз-ного комплекса в мембране, согласно которой фактор Fj - окруженная водой "шляпка гриба", основанием служат мембранные компоненты АТФаз-ного комплекса, а роль "ножки", связывающего звена "шляпки" с "основанием", играет фактор OSCP. Экспериментальные данные, подтверждающие возможность описанной выше локализации фактора Fj В мембране митохондрий, были получены В работе ШнеЙдера С COaBT. /Schneider et a 1., 1972/. Авторы ПОКа зали, что гидрофильный реагент диазобензосульфонат в одинаковой степени модифицирует фермент в растворе и в мембране субмитохондриальных частиц. Однако в этой работе наблюдалась.модификация лишь нескольких аминокислотных остатков в молекуле фактора Fj. По-видимому, эти результаты не могут служить доказательством модели "гриба". Возможно, диазобензосульфонат на изолированном ферменте модифицирует именно те аминокислотные остатки, которые доступны и на мембрансвязанном факторе Fj. С другой стороны, в литературе накопилось большое количество экспериментального материала, который противоречит расположению фактора FT в мембране по модели "гриба". На микрофотографиях,полученных методом замораживания-скалывания, глобулы фактора Fj удается обнаруживать на поверхности скола, прошедшего внутри мембраны Между МОНОСЛОЯМИ ЛИПИДОВ /Wrіgglesworth et al., 1970/. РаССТОЯНИв между одним из нуклеотидсвязывающих центров фактора Fj И местом связывания ДЦКД в мембране,измеренное методом двойных спиновых меток, составляет около 20 A /Azzi et al., 1973/, тогда как длина "ножки", которая связывает фермент с мембраной, по данным электронной микроскопии, равна 45 A /Femandez-Moran, 1962/. Расстояние между плотно упакованными в хлоропластах мембранами гран тилакоидов, которые в большом количестве содержат АТФазу, также значительно меньше размеров глобул фактора Fj / Tiefert, ногіїск, 1979/. Козлов и Цыбовский /Козлов, Цыбовский, 1979/ исследовали доступность аминогрупп изолированного и мембрансвязанного фактора Fj к водорастворимому тринитробензосульфонату. Оказалось, что число модифицированных аминогрупп на изолированном ферменте существенно больше, чем на факторе Fj, из обработанных этим реагентом субмитохондриальных частиц. Полученные результаты позволили авторам предположить, что значительная часть фермента погружена в мембрану. Аналогичные результаты были получены при модификации фактора Fj динитрофторбензолом, гидрофобным реагентом на аминогруппы, хорошо растворимым в липидной фазе мембраны. По-видимому, фактор Fj в мембране экранирован от липидного окружения белковым чехлом, который образует мембранные компоненты АТФазного комплекса. Этот вывод позволяет понять также, почему фактор Fj, будучи мембранным белком, содержит на поверхности большое количество полярных аминокислотных остатков и хорошо растворим в воде. Некоторые препараты митохондри-альной мембраны без грибовидных выростов, обладают высокой АТФазной аКТИВНОСТЬЮ /Fleischer et al., 1967/ Приведенные выше данные о локализации фактора FT В мембране указывают на то, что грибовидная локализация фактора Fj, возможно является артефактом, возникающим при негативном контрастировании мембран. Не исключено, однако, что такое строение фермент имеет в одном из конформационных состояний /см. результаты и обсуждение/. Большой интерес представляет вопрос о локализации отдельных субъединиц и функциональных центров фактора Fj в мембране. В работе Козлова и Черняка /Козлов, Черняк, 1976/ были получены экспериментальные данные, указывающие на то, что активный центр фермента расположен в глубине митохондриальной мембраны, вблизи от ее внешней поверхности. Авторы исследовали доступность активного центра фактора Fj ДЛЯ гидрофильных реагентов в мембранах митохондрий и субмитохондриальных частиц, обработанных бутанолом. Оказалось, что бутанол, нарушая белок-липидные взаимодействия, обнажает активный центр фермента в митохондриях и субмитохондриальных частицах. При этом, модификация активного центра фактора FT гидрофильными реагентами наблюдалась лишь в митохондриях. На основе этого результата авторы предположили, что в субмитохондриальных частицах, имеющих противоположную митохондриям ориентацию мембраны, активный центр фермента отделен от внешней водной фазы гидрофобным барьером, непроницаемым для гидрофильных реагентов. Действительно, разрушение гидрофобного барьера мембраны осмотическим шоком приводило к тому, что гидрофильные ингибиторы блокировали АТФазную активность субмитохондриальных частиц, обработанных бутанолом. Из полученных данных авторы сделали вывод о том, что. активный центр АТШазы отделен от митохондриального матрикса гидрофобным барьером мембраны. Дальнейшие исследования показали, что важную роль в создании окружения активного центра, расположенного на ft субъединице фактора показали, что обработка субмитохондриальных частиц хаотропной солью псі приводит к отделению d субъединиц фактора Fj ОТ мембраны. Добавление очищенных с{ субъединиц к обработанным псі субмитохондриаль-ным частицам приводило к восстановлению в них АТФазной активности, чувствительной к олигомицину. Помимо этого, авторами была продемонстрирована доступность активного центра АТФазы в субмитохондриальных частицах, обработанных псі, для гидрофильного ингибитора - смешанного ангидрида АТФ и мезитиленкарбоновой кислоты. Эти результаты указывают на то, что с субъединицы отделяют активный центр фактора Fj от митохондриального матрикса. Из приведенных выше данных о недоступности активного центра фактора Fj ДЛЯ гидрофильных реагентов следует, что субстраты АТФазной /АТФ-синтетазной/ реакции, крупные заряженные молекулы, не могут непосредственно за счет диффузии попасть из митохондриального матрикса в активный центр фермента. По-видимому, должен существовать специальный механизм, обеспечивающий перенос субстратов из матрикса в активный центр фермента. Этот механизм должен включать крупномасштабные конформационные перестройки фермента, так как перемещение субстра о тов происходит на расстояние до 20-30 А /Козлов, 1975/. Центральную роль в предполагаемом механизме должны играть Х субъединицы фактора Fj, которые, как уже отмечалось, экранируют активный центр фермента со. стороны митохондриального матрикса.
Измерение трансмембранного электрического потенциала с помощью флуоресцентных зондов
Широкое применение нашли различные флуоресцирующие красители в разработке новых методов измерения мембранного потенциала на сопрягающих мембранах.
Принцип использования флуоресцентных зондов для измерения электрического потенциала AHf основан на их способности проникать в заряженной форме через мембрану исследуемого объекта по электрическому полю, а также на изменение квантового выхода флуоресценции красителя в зависимости от микроокружения.
В ряде работ было исследовано энергозависимое изменение интенсивности флуоресценции анионов 8-анилинонафталин-1-сульфоната /АНС 7 в сопрягающих мембранах митохондрий, хлоропластов и бактерий /Azzi, Santato, 1970; Azzi et-al, 1971а; Jasai tis et at ,197-1 ;КулЄНЄ.И ДО., 1971/. Характерной особенностью параметров флуоресценции АНС" является то, что этот краситель плохо флуоресцирует в воде, а в присутствии мембранных структур интенсивность флуоресценции красителя многократно возрастает. По данным Ясайтиса с соавт. /jasai АНС" резко возрастает при энергизации мембран субмитохондриальных частиц. Ингибиторы дыхания и разобщители окислительного фосфорили-рования предотвращали эффект энергозависимого увеличения интенсивности флуоресценции красителя. Аналогичные данные были получены при энергизации субмитохондриальных частиц с помощью АТФазного генератора трансмембранного потенциала. В этом случае к тушению интенсивности флуоресценции АНС" приводило добавление в среду инкубации олигомицина, ингибитора Н+-АТФазы.
АНС" является удобным флуоресцентным индикатором для регистрации энергозависимых процессов в сопрягающих мембранах. Однако, этот краситель не дает возможности количественной оценки величины мембранного потенциала. Это связано с высокой чувствительностью красителя помимо трансмембранного, также и к поверхностному потенциалу. Существенным недостатком метода измерения мембранного потенциала с применением АНС" является его сравнительно большая инерционность. Интенсивность флуоресценции АНС" меняется как от действия трансмембранного электрического потенциала, так и от поверхностного потенциала.
Более удобными зондами для количественного определения электрического потенциала на сопрягающих мембранах являются цианиновые красители /waggoner, 1976; Печатников и др., 1979/. Линейная зависимость флуоресцентных ответов на энергизацию мембраны, а также малоинерционность этих ответов, позволяют успешно применять циановые красители для измерения Д . Так, Ларис с соавт. /Laris et al, 1975/ показали, что интенсивность флуоресценции цианинового красителя dis-Cc/5/ линейно зависит от логарифма концентрации К+ в суспензии митохондрий печени хомяка. Используя калибровочную кривую, полученную с различными концентрациями ионов К+ в присутствии валино-мицина, авторы определили величину мембранного потенциала митохондрий -150, -180 мв. Субстраты дыхания и АТФазной реакции приводили к тушению флуоресцентных ответов положительно заряженного красителя, а динитрофенол /ДНФ/ и ингибиторы генераторов мембранного потенциала восстанавливали исходную интенсивность флуоресценции зонда. Аналогичные результаты были получены в работах по измерению электрического потенциала с помощью цианиновых красителей на клеточных Мембранах бактерий разЛИЧНЫХ ВИДОВ /Laris, Pershadsingh, 197і»/. Полученные авторами значения мембранного потенциала также находятся в хорошем соответствии с хемиосмотической концепцией Мит-чела. Основной недостаток цианиновых красителей, как индикаторов на мембранный потенциал заключается в том, что эти флуоресцентные зонды могут оказывать влияние на функциальное состояние сопрягающих мембран. Так, в работе Печатникова с соавт. /Печатников и др., 1979/ было показано, что некоторые цианиновые красители являются ингибиторами первого пункта энергетического сопряжения дыхательной цепи. В таблице I приведены значения электрических потенциалов некоторых систем в различных метаболических состояниях. Самый простой метод определенияг ДрН на мембране митохондрий был применен в лаборатории Ленинджера /Gear et ai., 1967/. Метод состоит из центрифугирования митохондрий, в растворении осадка в неионном детергенте луброле и в измерении рН в растворе. Это очень грубый метод, который может быть использован только для приблизительной оценки трансмембранного градиента рН на митохондриальной мембране. Митчел и Мойл /Mitchell, Moyle, 1969/ разработали более сложный метод определения ДрН на митохондриальной мембране. Метод заключается в определении буферной емкости митохондриального матрик-са и внешнего раствора титрованием в присутствии и в отсутствии неионного детергента Тритона Х-100. Слабым местом этого метода является предположение о том, что детергент не меняет буферной емкости матрикса. Нарушение липид-белковых взаимодействий в мембране в результате обработки детергентом должно, по-видимому, существенно менять буферную емкость. 2. Распределение проникающих кислот Впервые в качестве проникающей кислоты для измерения ДрН на Мембране КЛеТОК была ИСПОЛЬЗОВана 5,5-Dimethyl-2, -oxazolidinedione /Addanki et ai., 1968/. ДМО быстро достигает равновесия и не связывается с мембранами. Кроме этого, ДІЮ не влияет на процессы метаболизма и сама не метаболизируется. Величина ДрН на мембране митохондрий, измеренная с помощью меченного С-ДМО, варьирует в интервале от 0 до 1,8 в зависимости от метаболического состояния митохондрий /см. таблицу 2/. Кроме ДМО, для измерения трансмембранной разности ДрН применяется также С-ацетат. Однако, применение ацетата ограничивается митохондриями печени и бактериальными везикулами, где он не метаболизируется / Mitchel1, Moyle, 1969/. Проникающие кислоты используются для определения ДрН при щелочных значениях рН внутри мембраны. При кислых значениях рН внутри исследуемых объектов применяются проникающие амины. Некоторые амины способны проникать через биологические мембраны в нейтральной форме / Crofts, 1967/. Для измеренияДрН в хлоропластах, субмитохондриальных частицах и хромофильных гранулах, т.е. в системах с кислым рН во внутреннем Объеме, Наиболее ЧаСТО ИСПОЛЬЗуеТСЯ С-МЄТИЛаМИН /Rotten-berg et ai., 1971, 1972/. Метиламин распределяется достаточно быстро, не связывается с мембраной и не метаболизируется. Применение более липофильных аминов, этиламина и гексиламина /Gaenssien, Mccarty, 1971/, для измерения трансмембранного гради-ента, рН затруднено тем, что с увеличением липофильности увеличивается способность аминов проникать через мембраны в заряженной форме.
Локализация фактора Fj В митохондриальнои мембране
Выяснение локализации фактора Fj в мембране имеет важное значение для понимания механизма функционирования АТФазного комплекса митохондрий. На основе экспериментальных данных были предложены различные схемы локализации фактора Fj В сопрягающих мембранах. Однако, противоречивость имеющихся в литературе данных не позволяет делать однозначные выводы о правомочности той или иной модели. Так, ПО МОДеЛИ "гриба", Предложенной РэКерОМ /Racker et al., 19б9/, фактор Fj выпячивается в водную фазу и контактирует с поверхностью мембраны с помощью "ножки", роль которой играет фактор OSCP /подробно схема локализации фактора FT ПО модели "гриба" рассмотрена в обзоре литературы/.
С другой стороны, в литературе накопилось большое количество экспериментального материала, который противоречит схеме расположения фактора Fj В мембране по модели "гриба" /см. обзор литературы/. Схема строения АТШазного комплекса митохондрий, предложенная Козловым /Козлов, 1975/, предполагает значительное погружение фактора Fj в толщу мембраны. Ряд экспериментальных данных, полученних при исследовании локализации и механизма функционирования мембрансвя-занного фактора Fj, хорошо объясняются в рамках этой схемы.
"Компромиссная" схема локализации фактора Fj в митохондриаль-ной мембране была предложена Скулачевым /Скулачев, Козлов, 1977/. Согласно этой схеме, фермент в зависимости от функционального состояния может находиться в двух основных состояниях. В одной из основных конформаций фактор Fj погружен в гидрофобную фазу мембраны, а в другой - связан с мембраной по модели "гриба". Переход фермента из одной конформаций в другую определяется величинами компонентов разности электрохимических потенциалов ионов Н+ на митохондриальной мембране, а также концентрациями субстратов окислительного фосфори-лирования: АТФ, АДФ и неорганического фосфата.
Важность решения вопроса о локализации фактора FT на сопрягающей мембране определяется тем обстоятельством, что оно может дать ценную информацию о протонтранслоцирующей функции фермента при работе АТФазного генератора трансмембранной разности электрохимических потенциалов Н+. Модель "гриба" исключает возможность непосредственного участия фактора FT в генерации ДМ ,+путем трансмембранного переноса протонов. В этом случае транспорт протонов через всю толщину сопрягающей мембраны будут обеспечивать протео-липиды, а роль фактора Fj будет ограничена переносом зарядов из водной фазы до мембраны. Если фактор FT В значительной степени погружен в гидрофобную фазу сопрягающей мембраны, как это предполагается по модели Козлова /Козлов, 1975/, то сам фактор Fj мог бы работать как протонная помпа, осуществляя перенос протонов через весь гидрофобный барьер мембраны. Роль протеолипидов в случае локализации фактора Fj по модели "погружения в мембрану" будет заключаться в транслокации протонов из активного центра фермента, локализованного вблизи от внешней стороны митохондриальной мембраны, во внемембранное пространство. Кроме этих двух крайних точек зрения возможен и промежуточный вариант, при котором фактор Fj пересекает часть гидрофобного барьера мембраны, а оставшуюся часть мембраны пересекают протеолипиды.
Вопрос о локализации фактора FT в митохондриальной мембране мы исследовали методом спиновых меток, используя три различных типа модификации фермента спиновыми метками /см. предыдущий раздел/. Модифицированный различными спиновыми метками митохондриальный фактор FT реконструировали в мембрану субмитохондриальных частиц и исследовали изменение микроокружекия спиновых меток, а также действие водорастворимого уширяющего реагента феррицианида и восстанавливающее действие дыхательной цепи на интенсивность и форму сигнала ЭПР спиновых меток.
На рис. 6 показано, как изменяется форма сигнала ЭПР связанного с митохондривльным фактором FT спинмеченного амина в результате реконструкции модифицированного этой меткой фермента с мембраной субмитохондриальных частиц. Как было показано в предыдущем разделе, спинмеченный амин модифицирует карбоксильные группы и, главным образом, включается в ft субъединицы фактора FT в стехиометрии две молекулы метки на молекулу фермента. При этом параметры сигнала ЭПР изолированного фактора Fj, спинмеченного по карбоксильным группам лишь незначительно отличаются от параметров сигнала ЭПР свободной метки в водном растворе. Реконструкция модифицированного фактора Fj с мембраной субмитохондриэльных частиц приводит к резкому изменению формы сигнала ЭПР /рис. 6/. Сильная иммобилизация спиновой метки, наблюдаемая в результате реконструкции с мембраной частиц фактора Fj обусловлено, по-видимому, погружением ft субъединицы фермента в глубину мембраны субмитохондриальных частиц. В результате этого парамагнитный фрагмент связанного с фактором Fj спинмеченного амина оказывается в гидрофобном микроокружении мембраны, где скорость вращения метки ограничивается. При низких скоростях вращения спиновых меток /в данном случае скорость вращения спинмеченного амина соизмерима со скоростью вращения субмитохондриэльных частиц/ анизотропные взаимодействия не усредняются до нуля, что приводит к уши-рению сигнала ЭПР.
