Содержание к диссертации
Введение
I. СТРУКТУРА БАКТЕРИОФАГА Т4 И ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЕГО СБОРКИ
1. Структурная организация и функции компонентов частицы фага Т4 8
2. Основные принципы и закономерности морфогенеза бактериофага Т4 12
II. МОРФОГЕНЕЗ ХВОСТОВОГО ОТРОСТКА БАКТЕРИОФАГА Т4
1. Морфогенез базальной пластинки 18
2. Сборка хвостового стержня и чехла 24
III. СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СТЕРЛОШ БАКТЕ РИОФАГА Т4 30
ІV. ХВОСТОВОЙ ЧЕХОЛ БАКТЕРИОФАГА Т4 КАК ПРОСТЕЙШАЯ СОКРАТИТЕЛЬНАЯ СИСТЕМА
1. Физико-химические и агрегациоиные свойства белка хвостовых чехлов 33
2. Молекулярная организация хвостового чехла 38
3. Молекулярный механизм сокращения хвостового чехла 44
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 53
I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛІЩОВАНИЙ
1. Штаммы бактериальных культур и бактериофагов ... 53
2. Среды для культивирования бактерий и бактериофагов 53
3. Выращивание и очистка бактериофагов 55
4. Определение титра фага 56
5. Выделение хвостов бактериофага Т4 56
6. Получение чехольного белка бактериофага Т4 в мономерном состоянии 57
7. Очистка "вил" 59
8. Комплементация in vitro 59
9. Выделение и очистка сокращенных чехлов 60
10. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 61
11. Аминокислотный анализ 63
12. Аналитическое ультрацентрифугирование 63
13. Аналитическое изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле 64
14. Экстракция связанных с белком нуклеозидтрифосфатов 66
15. Тонкослойная хроматография 66
16. Метод кругового дихроизма 67
17. Оптическая дифракция электронномикроскопических изображений 67
18. Спектрофотометрические измерения 68
19. Метод электронной микроскопии 68
20. Определение концентрации белка 69
21. Определение общего фосфора 69
П. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Выделение и очистка продукта гена 18. 70
A. Получение и очистка хвостов фага Т4 70
Б. Получение и очистка мономера пг18 75
B. Проверка биологической активности препарата чехольного белка 78
2. Физико-химические характеристики чехольного белка
A. Определение молекулярной массы пг18 78
Б. Изучение аминокислотного состава пг18 82
B. Определение изоэлектрической точки пг18 .... 82
Г. Агрегационные свойства чехольного белка фага Т4 84
3. Определение нуклеозидтрифосфата, связанного с чехоль
ным белком 93
А. Идентификация связанного нуклеотида 93
Б. Определение количественного соотношения между
пг18 и нуклеотидом 94
4. Изучение молекулярной организадии изомерных форм чехольного белка методом оптической дифракции ... 98
5. Сравнительное изучение спектральных характеристик мономера пг18 и его полимеризационных форм .... 105
А. Измерение поглощения изомерных форм чехольного белка в ультрафиолетовой области 105
Б. Изучение структурных перестроек чехольного белка при полимеризации и в процессе сокращения . . 109
ОБСУЖДЕНИЕ 123
ВЫВОДЫ 132
Принятые сокращения 134
Список литературы 135
- Структурная организация и функции компонентов частицы фага Т4
- Морфогенез базальной пластинки
- СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СТЕРЛОШ БАКТЕ РИОФАГА Т4
- Физико-химические и агрегациоиные свойства белка хвостовых чехлов
- Штаммы бактериальных культур и бактериофагов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение механизмов генетического детерминирования формы и размеров сложных надмолекулярных биологических структур, процессов их сборки и структурной организации представляет собой один из самых привлекательных разделов современной молекулярной биологии. Классической моделью для исследования на молекулярном уровне процессов морфогенеза является бактериофаг Т4. Этот сложноустроенный вирус состоит из трех основных структурных компонентов: головки, в которой хранится двухцепочечная молекула ДНК; длинных хвостовых фибрилл, ответственных за специфическое узнавание клетки-хозяина, и хвостового отростка, обеспечивающего введение генетической информации фага в бактерию. Сборка этих компонентов частицы фага Т4 осуществляется независимо и находится под контролем дополнительных регуляторних факторов как вирусной, так и клеточной природы (II, 161).
Особый интерес для решения фундаментальных проблем морфогенеза и функционирования надмолекулярных структур представляет хвост бактериофага Т4. Хвостовой отросток состоит из гексагональной базальной пластинки, к вершинам которой прикрепляются длинные хвостовые фибриллы; стержня и сократительного чехла. В формировании хвоста принимает участие 21 ген фага (109). Хвостовой отросток обладает метастабильной структурой, которая в процессе инфекции подвергается ряду последовательных перестроек (75, 137, 138). Взаимодействие длинных хвостовых фибрилл с липополисахаридными рецепторами приводит к разворачиванию коротких хвостовых фибрилл и необратимому связыванию их с другим бактериальным рецептором. После этого происходит трансформация базальной пластинки из гексагональной формы в шестилучевую звезду, сокращается чехол и ДНК фага вводится в клетку.
Сократительный чехол фага Т4 представляет собой простейшую однокомпонентную двигательную систему, состоящую из белковых молекул одного типа. Чехол построен из 144 субъединиц продукта гена 18 с молекулярной массой 70 000 (115, 150). В процессе сокращения чехла его длина уменьшается от 950 А до 380 А, а диаметр увеличивается на 30$ (35). Сокращение чехла характеризуется необратимостью и отсутствием экзогенного источника энергии.
Детальное изучение молекулярного механизма сокращения хвостового чехла имеет фундаментальный характер и очень важно для понимания функционирования других более сложноорганизованных двигательных систем.
Цель и задачи работы. Настоящая работа была направлена на изучение структуры чехольного белка и молекулярного механизма процесса сокращения хвостового чехла бактериофага Т4.
Основными задачами исследования были:
Выделить в мономерном и биологически активном состоянии продукт гена 18, изучить его физико-химические и агрегационные свойства.
Определить характер упаковки субъединиц чехольного белка в аберрантных формах чехла и в сокращенном чехле.
Изучить возможность конформационных перестроек чехольного белка в процессе его полимеризации и при сокращении чехла.
Научная новизна и практическая ценность -работы. Впервые установлено, что в интактном состоянии каждая субъединица чехольного белка связана с одной молекулой гуанозинтрифосфата. Показано, что при полимеризации продукта гена 18 в условиях in vitro с образованием спиралей вторичная структура белка остается практически без изменения. Обнаружено уменьшение с-спиральной структуры в белке при сокращении чехла, что обусловлено переходом части <*-спиральных участков в ^-форму и неупорядоченную структуру. Впервые показано, что чехольный белок может находиться в трех различных конформационных состояниях, которые характерны для мономера, поличехлов и сокращенных чехлов. Методом оптической дифракции изучен характер упаковки субъединиц чехольного белка в аберрантных формах чехла и в сокращенном чехле.
Полученные важные результаты о структурных перестройках в сократительном белке в процессе его функционирования расширяют наши представления о молекулярных механизмах движения. Результаты данного исследования могут найти применение в фундаменталь -ных разработках научно-исследовательских институтов АН СССР и АМН СССР.
Стштстущ и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (169 источников). Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 36 рисунков и 5 таблиц.
Апробация шботы. Результаты исследований доложены на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на Московской конференции молодых ученых "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии" (Москва, 1983); на Всесоюзном симпозиуме "Актуальные вопросы бактериофагии и прикладной иммунологии" (Тбилиси, 1984).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в четырех печатных работах.
Структурная организация и функции компонентов частицы фага Т4
В первых электронномикроскопических исследованиях было установлено, что частица бактериофага Т4 состоит из трех основных структурных компонентов: головки, хвостового отростка и длинных хвостовых фибрилл (35, 109). Использование разнообразных физических и химических дезинтегрирующих воздействий на вирион фага, а также применение условно-летальных мутантов по генам, ответственным за синтез структурных белков частицы фага, позволило выявить его тонкое строение и установить функциональную роль каждого компонента (32, 55, 148). В настоящее время различают десять субструктурных компонентов фаговой частицы: оболочка головки, муфта, шейка, воротничок, воротничковые нити, хвостовой стержень, хвостовой чехол, базальная пластинка, короткие и длинные хвостовые фибриллы (рис. I).
В головке фага хранится его линейная двухцепочечная молекула ДНК, содержащая 1,66-105 пар нуклеотидов (130, 149).
Головка фага Т4 представляет собой неправильный икосаэдр с числом триангуляции, равным 13, и константой решетки - 130 А (33). Длина головки составляет 1100 А, а ширина - 745 А. Сборка головки фага осуществляется под контролем, по крайней мере, 25 различных генов. Продукты семи генов (20, 21, 22, 23, 24, 31 и 40) вместе с генами, ответственными за синтез внутренних белков, необходимы для сборки компетентной преголовки (104). Остальные гены (2, 4, 13, 14, 16, 17, 44, 50, 64 и 65) участвуют в завершении сборки капсида и упаковке ДНК (72).
Длинные хвостовые фибриллы, ответственные за специфическую адсорбцию фага на клетке, состоят из двух функционально и генетически различных, сильно асимметричных половинок - дистальной и проксимальной. Общая их длина составляет 1500 А при диаметре о 45 А (51, 146). Их морфогенез находится под контролем геновфага (34, 35, 36, 37, 38, 57, 63 и wac) (86). Причем обе половинки фибрилл формируются независимо, а их объединение происходит преимущественно на вирусной частице (147, 163).
Структуру и морфогенез хвостового отростка мы подробно рассмотрим в последующих главах, а здесь лишь укажем, что хвост фага представляет собой сложноорганизованный метастабильный белковый комплекс, единственной функцией которого является эффективная доставка в хозяйскую клетку генетической информации вируса. Он включает в себя сенсорную систему - короткие фибриллы, сократительную систему - хвостовой чехол и проводящую систему - хвостовой стержень.
Морфогенез базальной пластинки
С формирования базальной пластинки начинается сборка хвостовой части Т-четных бактериофагов (87, 88). В составе интакт-ной фаговой частицы базальная пластинка представлена в виде гексагональной пластинки диаметром 350 А. В центре базальной пластинки имеется отверстие диаметром 80 А. Это отверстие закрыто пробкой. При сокращении хвостового чехла отверстие открывается. Вокруг отверстия на проксимальной стороне базальной о пластинки расположен шестиугольный диск диаметром 180 А (82).
Этот диск служит платформой, на которой полимеризуется белок хвостового стержня. От дистальной поверхности базальной пластинки отходят 6 шиповидных зубцов, так называемые "пины", поэтому в боковой проекции базальная пластинка имеет вид трезубца (76, 123). При взаимодействии фага с поверхностью бактериальной клетки происходит структурная реорганизация базальной пластинки, и она принимает форму 6-лучевой звезды диаметром 550 А. Лучи звездчатой формы несколько загнуты в одном направлении (20), и на их концах имеются утолщения, необходимые, очевидно, для присоединения хвостовых фибрилл к базальной пластинке.
Использование комплементационного теста in vitro в сочетании со структурным и седиментационным анализом позволило выявить ряд структурных предшественников базальной пластинки и определить основные этапы ее сборки в инфицированных клетках (78-80, 90, 124). В морфогенезе базальной пластинки участвуют продукты 19 генов, из которых 18 являются структурными белками базальной пластинки (92).
Формирование базальной пластинки идет по двум независимым путям - формирование каркаса базальной пластинки и образование центральной пробки (рис. 3). Экспериментально установлено, что главный структурный предшественник базальной пластинки - комплекс с константой седиментации 15 s (78). Он образуется в результате последовательного взаимодействия продуктов генов (пг) 10, II, 7, 8, 6, 53 и 25. Нужно отметить, что за исключением пг II все эти белки могут взаимодействовать только в данной последовательности. Если нарушен синтез какого-либо из этих белков, последующие стадии морфогенеза блокируются.
Структура и физико-химические свойства стерлош бакте риофага Т4
Первые данные по строению хвостовых стержней были получены Бреннером и сотрудниками в 1959 г. (34, 35). Хотя авторам не удалось выделить препарат стержней в отдельную фракцию, при электронномикроскопических исследованиях выяснилось, что стержень представляет собой полый цилиндр длиной 800 А и диаметром 70 А с внутренним каналом 25 А. Позднее был разработан метод изолирования стержней в отдельную фракцию после фрагментации частицы на отдельные структурные элементы подщелачиванием среды до рН 12,0-12,2 (14).
Хвостовые стержни являются относительно ригидной структурой (35, 41, 122, 148). Исследование стержней с помощью метода скоростного центрифугирования показало, что целые стержни имеют константу седиментации 30,5 S (14). Был определен аминокислотный состав стержневого белка фага Т2, особенностью которого являются следовые количества пролина (5). Аналогичные данные получили Каммингс с соавторами при изучении хвостовых стержней бактериофагов Т2 L, Т2Н, Т4В, Т4Д и Т6 (41). Исследование белка хвостовых стержней с помощью методов седиментационного равновесия и электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии доде-цилсульфата натрия показало, что стержни состоят из субъединиц одного типа с молекулярной массой 18700 дальтон (103). Кинг и Миколаевич (88), используя амбер-мутанты фага Т4, дефектные по генам, контролирующим морфогенез фагового хвоста, доказали, что стержневой белок является продуктом гена 19 с молекулярной массой 21000 дальтон. По данным Диксона (46) молекулярная масса пг19 составляет 20 000.
Анализ электронномикроскопических изображений стержней с помощью оптической дифракции позволил построить модель стержня (8), согласно которой основу структуры стержней составляют шесть параллельно расположенных спиральных тяжей. Так как субъединицы на всех шести тяжах лежат в плоскостях, перпендикулярных оси стержня, его структуру можно трактовать как стопку дисков, слегка повернутых по отношению друг к другу. Благодаря такому повороту, субъединицы всех соседних дисков образуют единую систему пологих спиральных тяжей. При внешнем диаметре стержней равном А, шаг спирали при девяти субъединицах на виток соответст о вует приблизительно 280 А. Из полученных дифракционных картин следует, что форма субъединиц близка к сферической. Диаметр субъединицы равен 21-26 А. Стержень имеет канал диаметром 28-30 А. Исходя из электронномикроскопических данных и построенной модели, авторы пришли к выводу, что стержень должен состоять из 145-150 субъединиц пгі9. Эта величина совпадает с количеством субъединиц в хвостовом чехле (ИЗ), который формируется вокруг стержня, и свидетельствует о том, что стержень, как и чехол, построен из 24 дисков, по шесть субъединиц в каждом, и имеет молеку-лярную массу 2,7»10 -2,8 10 . Вывод об эквимолярных количествах пг18 и пгІ9 в составе фагового хвоста согласуется с результатами биохимических исследований (87, 88).
Физико-химические и агрегациоиные свойства белка хвостовых чехлов
Изучение свойств белка хвостовых чехлов стало возможным, благодаря разработке методов выделения в достаточно чистом виде целых хвостовых чехлов и чехольного белка в мономерном состоянии.
Впервые хвостовые чехлы были выделены в 1959 г. Бреннером и- сотрудниками (35) методом закислення фаговой суспензии до рН 2,0 с последующей нейтрализацией и обработкой осадка белковых элементов ДНК-азой, трипсином или химотрипсином. После очистки препарата чехлов дифференциальным центрифугированием и центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы получали элек-трофоретически гомогенный препарат чехлов, который при аналитическом ультрацентрифугировании давал пик с константой седимен - 34 тации s0 « 114 s . Так как в растянутой конформации чехол существует только в составе интактного хвоста, воздействия, приводящие к отделению чехла от стержня, неизбежно вызывают его сокращение. Поэтому очищенная фракция чехлов содержит лишь сокращенную структуру. У других авторов величина константы седиментации варьировала от 94-99 s до II8-II9 s (14, 121,131). Саркар с соавторами показали, что на скорость осаждения хвостовых чехлов бактериофага Т2 влияет рН среды и присутствие различных нук-леотидов (131). В частности при добавлении АТФ до концентрации 0,02 М константа седиментации снижается от 118 s до 97 s . Аналогичное действие оказывает повышение рН среды. По мнению авторов, этот эффект связан с частичным растяжением чехла и увеличением его асимметрии в результате ионных перераспределений. При определении константы седиментации хвостовых чехлов нужно учитывать их высокую способность к агрегации (2, 4, 12-14). Агрегация, как правило, начинается с образования димеров, в которых два чехла соединены конец к конпу, далее образуются цепочки чехлов различной длины. Потом эти цепочки объединяются бок о бок, и заканчивается агрегация формированием трехмерных кристаллических структур. При хранении растворов величина белковых агрегатов чехла изменяется и они перераспределяются в растворе по размерам. Добавление ионов Са и в меньшей мере Mg + приводит к сильной агрегации чехлов. При этом образуются мелкие шестиугольные кристаллы, которые группируются и образуют большие пластинчатые кристаллы. В некоторых случаях происходит объединение крупных кристаллов в составе "розетки". Закисление среды ниже рН 5,8-5,9 также приводит к увеличению агрегации чехлов. Молекулярная масса чехлов, определенная с помощью светорассеяния, составляет 7 800 000 (131).
Штаммы бактериальных культур и бактериофагов
Для получения концентрированных суспензий бактериофагов то титром 2-4 10 б.о.е./мл мы пользовались стандартным методом Келленбергера (72), который основан на эффекте задержки лизиса клеток при высокой множественности заражения.
Бактериальную культуру выращивали в 2,5-литровом ферментере при температуре 37С с умеренной аэрацией в среде М 9А. Нарастание бактериальной массы контролировали измеряя оптическую плотность культуральной жидкости на спектрофотометре СФ-4 при 600 нм. Когда концентрация клеток, согласно калибровочной кривой, достигала значения 4-6 10 кл/мл (Aggg = 0,6-0,8 о.е.), проводили заражение фагом с множественностью 5, и через 8 минут суперин-фицировали клетки с той же множественностью. Температуру культивирования снижали до 30-32С, и через 90 минут инфицированные бактерии собирали центрифугированием на холоду при 5 000 g за 15 минут (ротор JA-I0). Осадок суспендировали в 0,01 М На -фосфатном буфере рН 7,0, содержащем 10 мМ MgCl2 , или физиологическом растворе (0,14 М NaCi, 10 мМ MgCi2 ). Клетки лизиро-вали 8-Ю часов на магнитной мешалке при 4С в присутствии хлороформа (0,5$) и ДНК-азы (40 мкг/мл). Клеточные обломки удаляли центрифугированием при 10 000 g в течение 20 минут (ротор JA -14). Осадок промывали 2-3 раза и супернатант объединяли. Для концентрирования бактериофаг осаждали при 20 000 g за 40 минут (ротор Ti-30). При необходимости цикл дифференциального центрифугирования проводили 2-3 раза. В результате мы получали 300-400 мл концентрированной суспензии бактериофага Т4 или его амбер-мутан то тов с титром около 2 10 б.о.е./мл.
Определение титра фага
Концентрацию инфекционных частиц в суспензии бактериофагов определяли по методу агаровых слоев (I, 61), используя нижний и верхний агары Херши. Стерильный верхний агар расплавляли и разливали по 2,5 мл в пробирки, помещенные в термостат на 46С. В пробирку добавляли по 0,05-0,1 мл ночной индикаторной культуры E.coli и по 0,1 мл из соответствующего разведения фага. Смесь тщательно перемешивали и равномерно распределяли по поверхности 1,2$ нижнего агара в чашке Петри. Через 8-12 часов инкубации при 37С подсчитывали количество негативных колоний.
Выделение хвостов бактериофага Т4
А. Выращивание амбе -мутанта одага_Т4 в неперщссивных_условиях Для получения хвостов бактериофага Т4 мы использовали его амбер-мутант am Н11 , у которого в непермиссивных условиях заблокировано образование головки.
В ферментер с 10 литрами среды М9А вносили 200 мл ночной культуры E.coli ВеД при температуре 37С. Когда концентрация клеток достигала значения 4-6 1.0 кл/мл, температуру культивирования снижали до 30С и инфицировали бактерии фагом с множественностью 5. Далее с интервалом 15 минут дважды проводили суперинфекцию с той же множественностью и выращивание продолжали еще в течение 90 минут. Инфицированные бактерии осаждали при 4С на центрифуге "Beckman" (ротор JA-10 ) в течение 15 минут при 5 000 об./мин. Осадки суспендировали в 150 мл 0,1 м Na -фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 0,2 М сахарозы, 0,01 М MgCl2 и 10"% дитиотрейтола (ДТТ).
