Введение к работе
Актуальность проблемы
Для гетерологической продукции рекомбинантных белков в научных, медицинских и промышленных целях применяется отработанная система экспрессии в энтеробактерии Escherichia coli. При этом исследователи зачастую сталкиваются с проблемой образования нерастворимых белковых агрегатов – тел включения. Эта проблема особенно актуальна в случае фибриллярных белков, так как помимо принятия белками правильной третичной структуры они должны иметь и нативную четвертичную структуру. Такие белки, кроме того, обычно склонны к агрегации в силу периодичности последовательности полипептида. Разработка эффективной стратегии получения олигомерных фибриллярных белков в рекомбинантном виде является важной практической задачей.
Чтобы избежать образования тел включения при гетерологической экспрессии, применяют различные стратегии: рефолдинг белка из тел включения, подбор штаммов E. coli и условий экспрессии, улучшающих фолдинг, делеционный мутагенез, совместную экспрессию с шаперонами и разные другие белково-инженерные подходы.
Одним из современных методов преодоления образования тел включения и агрегации рекомбинантных белков, синтезируемых E.coli, является технология создания химерных белков (fusion technology). В основе метода лежит конструирование плазмиды, экcпрессирующей в непрерывной рамке считывания ген, состоящий из двух частей. Одна часть химерного гена кодирует целевой белок, а другая – ”белок-ассистент”, который способствует укладке целевого белка, увеличивает его растворимость и повышает уровень экспрессии.
Интерес исследователей к фибриллярным белкам, механизмам их сворачивания и олигомеризации обусловлен рядом причин. Так, например, в медицине актуальную проблему представляют собой нейродегенеративные болезни, вызванные накоплением в нейронах агрегатов белка - амилоидных фибрилл. Изучение данных фибрилл in vitro, посредством получения их в рекомбинантном виде, несомненно позволит приблизиться к пониманию процессов их образования. Также при решении пространственных структур фибриллярных белков исследователями зачастую обнаруживаются ранее не описанные структурные домены – фолды, тем самым вносится вклад в структурную биологию.
Цель и задачи исследования
Целью нашей работы являлась разработка новых технологий рекомбинантного синтеза фибриллярных белков в корректном олигомерном состоянии, использующих белковые факторы фолдинга.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- Создание плазмидных конструкций, содержащих фрагменты гена белка-адгезина g37 бактериофага Т4 и ген белка-ассистента в объединенной рамке считывания под общим индуцируемым промотором
- Экспрессия и очистка химерных рекомбинантных фаговых белков
- Исследование физико-химических и биологических свойств полученных белковых продуктов
Научная новизна и практическая значимость работы
В рамках данной работы нами впервые была показана возможность использования тримерного бета-спирального С-концевого домена белка базальной пластинки бактериофага Т4 – gp5 для управления сворачиванием и олигомеризацией фибриллярных белков, то есть нами был обнаружен и описан новый эффективный белковый домен – ассистент фолдинга.
Впервые описана способность пептидил-пролил-изомеразы SLyD E.coli эффективно направлять фолдинг фибриллярных белков, что значительно расширяет существующие границы использования SLyD в качестве белка-ассистента фолдинга.
Опыт использования данных белков-ассистентов фолдинга будет несомненно востребован в биотехнологии, равно как и разработанная нами методика экспрессии и очистки получаемых на их базе химерных белков.
В качестве целевого белка – модели нами был выбран фибриллярный адгезин бактериофага Т4 – белок gp37, играющий ключевую роль на начальной стадии инфекции. Он узнает специфические рецепторы на поверхности E. coli. Исследование функционально важного участка gp37, определение его структуры и механизма взаимодействия с рецепторами E. coli представляет несомненный интерес как с фундаментальной точки зрения - для более глубокого понимания процесса фаговой инфекции, так и с практической – например, для разработки тест-систем для типирования и детекции бактерий и биосенсоров.
Для контроля получаемых продуктов экспрессии нами была разработана новая методика оценки нативности рекомбинантных адгезинов бактериофагов in vivo, на примере белка-адгезина фага Т4 gp37.
Апробация работы и публикации
Основные материалы диссертации были представлены на международной конференции «Protein folds in infectious and neurodegenerative diseases» (Aussois, Франция, 2009), на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), на международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), на международной конференции «Phages in interaction III» (Leuven, Бельгия, 2009).
По теме диссертации опубликовано 4 работы, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы
