Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из ключевых проблем современной биологии является проблема пространственной организации белковых молекул. Структурное многообразие белков, образующих частицу бактериофага Т4, позволяет надеяться, что некоторые из них могут оказаться удобными моделями для изучения механизмов свертывания белков и развития методов белковой инженерии.
Фибриллярный белок фибритин бактериофага Т4 (продукт гена vac - whisker antigen control) образует комплекс воротничок/бакенбарды, расположенный в месте объединения головки и хвоста фага (Coombs, Eiserling, 1977; Николаева и соавт., 1987). Комплекс воротничок/бакенбарды необходим для эффективной сборки длинных хвостовых фибрилл на частице фага (Terzaghl et al., 1979; Wood, Conley, 1979). Нуклеотидная последовательность гена #ас определена (Prilipov et al., 1988). В аминокислотной последовательности продукта гена vac была обнаружена периодичность в распределении остатков, характерная для супе рспиральных фибриллярных белков (Scbolev, Mesyanzhinov, 1991). Суперспирали из нескольких а-спиралей содержатся в миозине, тропомиозине, промежуточных филаментах, ламининах, фибриногене и многих других белках (Cohen, Parry, 1990). Экспериментальное исследование а-епирадьных фибриллярных белков осложняется их плохой растворимостью, трудностью очистки, большими размерами и сложной организацией. В результате, несмотря на длительную историю изучения, сведения об их строении и механизмах сборки далеко не полны.
Научение механизмов пространственной самоорганизации белков тесно связано с развитием белковой инженерии. В последние годы было опубликовано большое количество работ, посвященных использованию в белковой инженерии химерных вирусных частиц, получивших название векторов экспонирования. Векторы экспонирования отличаются от обычных клонирующих векторов на основе вирусов тем, что клонированные гены при размножении вируса зкспрессируются в виде гибрида с каким-либо структурным белком, и гибридный белок встраивается в частицы вируса. Единичные вирусные частицы, специфически связывающиеся с исследуемым белком, могут быть выделены из смеси, содержащей около 107 вариантов химерных вирусов, с помощью аффинной селекции (Parmley, Smith, 1988). Таким образом, векторы экспонирования
- 2 -могут быть использованы для изучения белковых взаимодействий и получения полипептидов с заданными свойствами (Cwirla et al., 1990; Marks et al., 1991; Gram, et al., 1992; Swimmer et al., 1992). Одно из трудно выполнимых условий, связанных с развитием этого направление, состоит в том, что встраивание в белок-носитель . чужеродных последовательностей не должно нарушать его связывание с вирусом и биологические функции. В настоящее время подавляющая часть работ по экспонированию клонированных антигенов выполнена на белках III и VIII-нитевидных бактериофагов Е. coll. Разработка аналогичных систем на основе других белков-носителей и других вирусов может увеличить возможности и гибкость метода.
Цель и задачи работы. Данная работа направлена в первую очередь на изучение структурно-функциональной организации фиб-ритина бактериофага Т4. Конечной целью является создание системы экспонирования антигенов на поверхности бактериофага Т4, используя фибритин в качестве белка-носителя. Для характеристики белка и проведения белковой инженерии необходимо было создать эффективную систему его экспрессии. Основная часть работы посвящена решению следующих задач:
1). Конструирование векторов экспрессии, позволяющих получать белок фибритин в нативной и мутантных формах.
2). Проверка гипотезы о суперспиральной организации фибри-тина и выяснение роли различных участков белка в сборке з оли-гомер и проявлении биологической активности.
3). Поиск способов встраивания в фибритин чужеродных последовательностей с сохранением его структуры и биологической активности.
4). Создание системы клонирования генов в геноме бактериофага Т4 в виде гибрида с геном vac. Доказательство того, что клонированные гены экепрессируются при размножении фага Т4, и образующийся-химерный фибритин встраивается в фаговые частицы. Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые подучены экспериментальные данные, свидетельствующие, что фибритин бактериофага Т4 является тримером, образованным тремя параллельными а-спиралями. Показано, что воротничок фага образован N-концевыми участками фибритина, а С-концы локализованы в дистальних участках бакенбард комплекса воротничок/бакенбарды. Сделан вывод о том, что тримеризация фибри-
тина при сборке в клетке инициируется С-концевым участком полипептидной цепи. Полученные данные важны для понимания принципов организации обширного класса фибриллярных белков, имеющих в своем составе суперспиральные участки.
.Продемонстрировано, что фибритин может быть использован для экспонирования разнообразных антигенов на поверхности бактериофага Т4. Найден способ встраивания чужеродных последовательностей в фибритин, без нарушения его сборки и биологической активности. Создана система клонирования генов в геноме бактериофага Т4, позволявшая получать химерные частицы фагов, несущие на дистальних концах воротничковых нитей разнообразные чужеродные антигены. Бактериофаги, экспонирующие соответствующие лиганды, могут быть использованы для эффективного обнаружения определенных антител или других молекул по снижению титра инфекционных частиц в смеси химерных фагов. Основные положения, выносимые на защиту:
-
Фибритин бактериофага Т4 в растворе является тримерным суперспиральным белком.
-
С-концы полипептидных цепей фибритина в комплексе воротничок/бакенбарды расположены в дистальной части бакенбард. Последовательность на N-конце необходима для связывания с частицами фага при образовании комплекса воротничок/бакенбарды. С-концевые аминокислотные остатки существенны для эффективной сборки фибритина в клетке.
-
Фибритин может быть использован в качестве белка-носителя для экспонирования различных антигенов на поверхности фага Г4.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из' введения, обзора литературы по of-спиральным фибриллярным белкам, экспериментальной части, результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (156 наименований). Диссертация изложена на 164 страницах машинописного ^екста и содержит 26 рисунков.
