Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время приоритетным для биотехнологии является конструирование бесплазмидных, безмаркерных бактериальных штаммов-продуцентов. Интеграция в хромосому генов, кодирующих целевые рекомбинантные белки или ферменты, катализирующие необходимые метаболические превращения, коренным образом решает проблемы, связанные со стабильным наследованием целевых плазмид [Friehs, 2004] и их отрицательным влиянием на жизнеспособность клеток [Sauer, 2001; Brownlie и др., 1990], а также удовлетворяет законодательному запрету на использование в промышленности плазмидных штаммов-продуцентов в ряде стран. Смещение приоритета метаболической инженерии на бесплазмидные системы экспрессии целевых генов привело к необходимости адаптации классических и разработки новых молекулярно-биологических подходов конструирования на основе современного инструментария модификации хромосомы.
Escherichia coli является удобным микроорганизмом для разработки таких подходов. В настоящее время создан разнообразный генно-инженерный инструментарий для модификации хромосомы Е. coli. Например, метод Red/RecET-зависимой рекомбинационной инженерии (Recombination mediated genetic engb neering = Recombineering) позволяет инактивировать целевые гены путем деле-ции «с сохранением открытой рамки считывания» гена-мишени, заменять регу-ляторные области и проводить сайт-специфический мутагенез кодирующих участков [Sawitzke и др., 2007]. Разработаны методы интеграции протяженных фрагментов ДНК в случайные [Ахвердян и др., 2007] и в строго определенные участки генома Е. coli [Minaeva и др., 2008]. В тоже время штаммы Е. coli традиционно используют в биотехнологическом производстве в качестве промышленных продуцентов рекомбинантных белков, органических кислот, витаминов, этанола и аминокислот, а также относительно новых продуктов - бутанола, 1-3-пропандиола, лейкопина, полифенолов и растительных флаваноидов [Wendisch и др., 2006; Patnaik, 2008; Demain и др., 2008]. Поэтому все разработанные на данном виде бактерий подходы конструирования приобретают практическую значимость. Необходимо также отметить, что многие из перечисленных методов, исходно разработанных для Е. coli, постепенно адаптируются для работы с другими микроорганизмами, такими как Salmonella [Husseiny и Hensel, 2005; Karlinsey, 2007], Shigella [Shi и др., 2003; Ranallo и др., 2006], Yersinia [Derbise и др., 2003; Lesic и др., 2004], Pseudomonas [Lesic и Rahme, 2008], Pantoea [Katashkina и dp, 2009]. Следовательно, разработка новых подходов оптимизации экспрессии генов в Е. coli позволяет надеяться на их будущую универсальность.
Цель и задачи работы. Диссертационная работа посвящена разработке новых молекулярно-биологических подходов прецизионного изменения структуры, уровня экспрессии и механизмов регуляции генов в хромосоме Escherichia coli на основе рекомбинационной инженерии.
В ходе работы решались следующие задачи:
прецизионная модификация локусов хромосомы Escherichia coli посредством применения Red-зависимой интеграции «вырезаемого» маркера;
оптимизация экспрессии генов биосинтетических путей на поздних стадиях культивирования бактериальных штаммов путем использования метаболически регулируемых промоторов Pho регулона;
разработка метода оптимизации экспрессии дистально расположенных цистронов в искусственных оперонах на основе TGATG-оверлаппонов;
исследование возможности применения конвергентной транскрипции для эффективного подавления экспрессии целевых генов.
Научная новизна и практическая значимость работы. Показано, что рекомбинационная инженерия позволяет прецизионно маркировать целевые генетические локусы, для удобства их переноса в другие штаммы, с последующим удалением маркера, тем самым, осуществлять конструирование штаммов, не содержащих генов устойчивости к антибиотикам.
Показано, что промоторы Pho регулона Е. coli, ?ри0а и ?psts, могут быть использованы для повышения уровня экспрессии целевого биосинтетического гена на поздних стадиях роста бактерий на комплексной среде с глюкозой, если растворимый неорганический фосфат является фактором ограничения роста биомассы.
Разработан метод оптимизации экспрессии дистально расположенных цистронов в искусственных оперонах посредством создания трансляционного сопряжения между цистронами.
Разработана модификация метода регулируемого подавления экспрессии генов путем организации встречной транскрипции, повышающая его эффективность за счет Rho-зависимой антитерминации.
Разработанные в ходе выполнения диссертации методы и подходы апробированы на модельных системах и успешно использованы в экспериментах по метаболической инженерии продуцентов аминокислот, имеющих значение для индустриальной биотехнологии.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в ведущих рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ, 2 сообщения в материалах международных научных конференций (Prague, Czech Republic, 2006; Lisbon, Portugal, 2009), оформлена заявка на патент РФ №2008105793. Материалы диссертации докладывались автором на конкурсе работ молодых сотрудников ЗАО «АГРИ» (Москва, 2009). Апробация диссертации состоялась на совместном семинаре ЗАО «АГРИ» и секций «молекулярная биология» и «генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП ГосНИИ-генетика (Москва, 2010).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на IIS~ страницах, включая 2S~Phcvhkob и 'J- таблицы. Список цитируемой литературы содержит 2,05~ источника, в том числе 8 на русском языке.
