Введение к работе
Актуальность исследования.
Настоящая работа посвящена изучению субстратной специфичности важной группы ферментов -нуклеозидфосфорилаз, которые осуществляют обратимый фосфоролиз нуклеозидов с образованием соответствующего гетероциклического основания и 1-фосфата моносахарида. К этим ферментам относятся тимидинфосфорилаза (ТФ) (КФ 2.4.2.4), уридинфосфорилаза (УФ) (КФ 2.4.2.3) и пуриннуклеозидфосфорилаза (ПНФ) (КФ 2.4.2.1). Нуклеозидфосфорилазы играют важную роль в метаболизме нуклеозидов. В опухолевых клетках наблюдается повышенный уровень активности этих ферментов, которые могут быть использованы в качестве маркеров онкологических заболеваний. Эти ферменты применяются в промышленности для синтеза лекарственных препаратов и практически важных нуклеозидов. В качестве примера можно привести известные ферментативные превращения нуклеозидов под действием УФ и ПНФ: Р-/)-арабинофуранозилурацил + УФ + неорганический фосфат —» урацил + а-/)-арабинофуранозил-1-фосфат + ПНФ + аденин —» Р-/)-арабинофуранозиладенин. Также эти ферменты используются для количественного определения неорганического фосфата.
Следует отметить, что субстратная специфичность этих ферментов исследована недостаточно полно. Это связано с отсутствием удобных методов определения кинетических параметров фосфоролиза нуклеозидов. Несмотря на большое количество работ, посвященное этим ферментам, не определена роль функциональных групп нуклеозидов при формировании продуктивного фермент-субстратного комплекса. Практически отсутствуют данные о влиянии структуры нуклеозида и гетероциклического основания на положение равновесия реакции фосфоролиза, что важно для практического применение этих ферментов. Вышесказанное и определяет актуальность и большой интерес к изучению субстратной специфичности и архитектуры активного центра этих ферментов.
Целью работы являлось изучение субстратной специфичности рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз E.coli. В ходе исследования решались следующие задачи:
разработка удобных методов определения констант равновесия, констант Михаэлиса и констант ингибирования для этих ферментов;
изучение фосфоролиза большой группы нуклеозидов, модифицированных как по углеводному остатку, так и гетероциклическому основанию;
- изучение роли гидроксильных групп нуклеозидов в связывании с ферментами;
- расширение возможностей использования ферментов для получения модифицированных
нуклеозидов и гетероциклических оснований.
Научная новизна и практическая значимость работы
Для изучения пиримидиннуклеозидфосфорилаз предложены новые субстраты - 4-тиотимидин и 4-тиоуридин. Разработан удобный хроматографический метод определения констант равновесия
ферментативной реакции. Изучена реакция фосфоролиза более 50 производных нуклеозидов, катализируемого нуклеозидфосфорилазами, определены константы Михаэлиса, константы ингибирования, а также константы равновесия. Полученные данные сопоставлены с данными рентгеноструктурного анализа и сделаны выводы об организации фермент-субстратного комплекса. Результаты работы важны для оптимизации ферментативных методов создания N-гликозидной связи и расширения возможностей использования ферментов для получения биологически важных нуклеозидов, гетероциклических оснований и их производных.
Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы были представлены на XII Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Гурзуф, Украина, 2004); International conference Biocatalysis-2005: fundamentals & applications. (St.Petersburg, RF, 2005); XIX International Round Table "Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids" (Lyon, France, 2010); XV Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Components (Czech Republic, Cesky Krumlov. 2011).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисов докладов.
Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора
литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой
литературы ( наименований). Работа изложена на страницах, включает рисунков,
схем и таблиц.
