Введение к работе
Актуальность проблемы. Значительные успехи последних десятилетий в производстве аминокислот связаны, прежде всего, с конструированием микроорганизмов-продуцентов методами метаболической инженерии. Такой способ конструирования включает в себя последовательное целенаправленное изменение метаболизма клетки для раскрытия ее возможностей к сверхсиитезу конкретной аминокислоты и должен быть основан на молекулярно-генетической характеристике участвующих в нем элементов.
Escherichia coli, в силу ее генетической и биохимической изученности и из-за разработанности методов манипулирования с ее геномом, является удобным микрорганизмом для рационального конструирования на ее основе штаммов-продуцентов различных биологически активных соединений и, прежде всего, аминокислот. Для последних можно не изобретать новый путь биосинтеза: клетка Е. coli синтезирует для своих нужд все 20 аминокислот. Для получения суперпродукции конкретной аминокислоты ликвидируют контролирующие элементы ее синтеза и перестраивают общий метаболизм клетки для увеличения синтеза ее предшественников. При достижении определенного уровня продукции аминокислоты актуальной проблемой становится ее транспорт из клетки. Усиление активного экспорта аминокислоты из клетки в настоящее время достигается за счет увеличения экспрессии гена аминокислотного экспортера. Несмотря на то, что в последние два десятилетия идентифицированы десятки генов, кодирующих экспортеры аминокислот у промышленно значимых бактерий Е. coli и Corynebacteriam glutamicum, их детальное исследование только начинается.
В частности, объектом исследования данной работы является экспортер ароматических аминокислот YddG Е. coli. На момент начала исследования было показано, что амплификация гена yddG придает клеткам Е. coli устойчивость к ароматическим аминокислотам и их аналогам, а также увеличивает накопление ароматических аминокислот в культуралыюй жидкости продуцирующих их штаммов {Doroshenko et ai, 2007).
Идентификация регуляторных элементов гена yddG и возможных факторов, влияющих на его экспрессию, представляла интерес и могла иметь практическое применение для оптимизации экспрессии гена yddG в штаммах-продуцентах ароматических аминокислот.
Экспортеры аминокислот относятся к интегральным мембранным белкам. Они высокогидрофобны, состоят из нескольких а-спиральных структур, которые образуют трансмембранные (ТМ) сегменты. Такие особенности мембранных белков затрудняют экспериментальный анализ их трехмерных структур, поэтому построение топологических моделей, т.е. определение количества ТМ сегментов и их ориентации в мембране является важным этапом исследования интегральных мембранных белков. К началу данной работы отсутствовали экспериментально подтвержденные топологические модели известных экспортеров аминокислот Е. coli. Таким образом, несомненный интерес представляло экспериментальное определение топологии экспортера ароматических аминокислот YddG. Полученные результаты могли быть
использованы для разработки новых стратегий оптимизации аминокислотных экспортеров в цитоплазматическои мембране штаммов-продуцентов аминокислот.
Цели и задачи исследования. Таким образом, целью настоящей диссертационной работы было изучение регуляции гена yddG и характеристика YddG как интегрального мембранного белка.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
-
Провести идентификацию промотора reuayddG;
-
Разработать систему и исследовать регуляцию reuayddG in vivo;
-
Исследовать локализацию YddG в клетке;
-
Построить топологическую модель YddG.
Научная новизна и практическая ценность работы. Картирован промотор гена yddG, исследована экспрессия этого гена in vivo в различных условиях культивирования. Ген yddG экспрессируется в клетках Е. coli MG1655 на низком уровне, что следует как из анализа его регуляторной области, так и из тестирования активности LacZ для гибридного гена yddC-lacZ. Увеличение экспрессии гена yddG наблюдалось в условиях, приводящих к замедлению роста клеток Е. coli. Неблагоприятные или стрессовые условия, замедляющие рост культуры, индуцировались такими факторами, как ингибирующие концентрации фенилаланина, NaCl или сахарозы в среде. Экспрессия yddG в этих условиях не зависела от as-PHK полимеразы.
С помощью сконструированных гибридных белков YddG-LacZ и YddG-ZsGreen экспериментально доказана локализация YddG в цитоплазматическои мембране Е. coli. Построена топологическая модель YddG. Экспериментально показано наличие у YddG 10 ТМ и расположение N- и С-концов в цитоплазме. С помощью флуоресцентной микроскопии установлено, что YddG локализуется на полюсах клетки.
В результате замены природной регуляторной области yddG на эффективную регуляторную область оптимизирована экспрессия гена yddG в клетках продуцентов фенилаланина. Генетические конструкции с повышенной экспрессией гена yddG введены в штаммы-продуценты ароматических аминокислот, которые используются в биотехнологическом производстве.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 патентная заявка.
Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» (июнь 2007), были представлены на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008) и Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008).
Диссертация апробирована на совместном заседании секций «Молекулярная биология» и «Генетика микроорганизмов» Ученого совета
ФГУП «ГосНИИгенетика» и Научно-технического совета НИИ «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ») 5 октября 2010 г.
Благодарности. Автор искренне признателен к.б.н. Айрих Л.Г. за сотрудничество и практическую помощь в методологии исследования YddG. Автор благодарит д.б.н., проф. Миронова А.С. (ФГУП «ГосНИИгенетика») за оказанное содействие в постановке экспериментов по определению стартовой точки транскрипции; д.б.н., доцента Феофанова А.В. и Воронцову О.В. (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова) за помощь при проведении флуоресцентной микроскопии клеток Е. coli. Автор признателен также к.б.н. Казаковой СМ. и Кулагиной Ю.В. (ЗАО «АГРИ») за содействие в проведении культивирований штаммов-продуцентов в ферментерах.
Особую благодарность автор выражает своему руководителю к.б.н., доценту Дорошенко В.Г., а также д.б.н., проф. Машко СВ., способствовавшему выполнению данной диссертационной работы.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов:
«Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и
обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на -iOf
страницах, включая рисунков и it таблиц. Список литературы
содержит 2Н0 цитируемых источников, в том числе 9 на русском языке.
