Введение к работе
Актуальность проблемы. Данная работа посвящена изучению механизмов, регулирующих процесс рекомбинации в клетке.
С тех пор, как Кларк и Маргулис в 1965 г. выявили абсолютную зависимость гомологичной рекомбинации от целостности гена recA (Clark and Margulies, 1965), его продукт - белок RecA -является наиболее интенсивно изучаемым ферментом гомологической рекомбинации у прокариот. Белок RecA также участвует в процессах репарации, мутагенеза, клеточного деления, регуляции экспрессии ряда репарационных генов и в других процессах жизнеобеспечения клетки (Ланцов, 2007; Galletto et al., 2007).
Несмотря на небольшой размер белка RecA (его молекулярная масса составляет -40 кДа), он обладает поразительной многосторонней функциональностью: гидролизует АТФ, взаимодействует с однонитевой ДНК (онДНК) и двунитевой ДНК (днДНК), является копротеазой при авторасщеплении репрессора SOS регулона клетки (белка LexA) и катализирует ренатурацию двунитевой ДНК (Ланцов, 2007; Сох, 2007).
Структурно-функциональный анализ белка RecA, проводимый во многих лабораториях мира, приобрел новые возможности после описания в 1992 г. его трехмерной кристаллической структуры в неактивном состоянии (Story et al., 1992) и после исследования кристаллов активных филаментов RecA (Chen et al., 2008). Эти структуры совместно с генетическими и биохимическими данными позволили авторам определить области белка, связывающиеся с ДНК и нуклеотидными кофакторами, участвующие в межпротомерном взаимодействии и связывании с репрессорами. Кроме того, полученные кристаллические структуры легли в основу интерпретации данных о биохимических свойствах мутантных белков RecA.
Несмотря на очевидные успехи в изучении механизмов функционирования белка RecA, до сих пор актуальным остается исследование его структурно-функциональной организации. Бактериальный белок RecA несет в себе огромный рекомбинационный потенциал, который клетка вынуждена ограничивать по причине его возможного вреда для стабильности генома. Во многом эти ограничения определяются оптимизированным составом аминокислотных остатков самого белка.
Исследование аминокислотных замен в области протомер-протомерного взаимодействия
белка RecA in vivo и in vitro выявило, что такие замены влияют на его рекомбинационные свойства
(Bakhlanova et al., 2001; Chervyakova et al., 2001). Чтобы определить значение ионных и полярных
взаимодействий остатков 3-30 и 111-140 для олигомерной структуры RecA и его ферментативных
функций, Найт (Knight) с сотрудниками ввели семь аминокислотных замен в положениях 6, 28,
112, 113 и 139 (Eldin et al., 2000). Ими было изучено влияния этих замен на стабильность
олигомеров свободного белка RecA, однако влияние замен, нарушающих ионные или полярные
взаимодействия в области контакта протомеров RecA, на рекомбинационные характеристики белка RecA исследовано не было.
Цель работы. Целью работы является изучение механизмов, регулирующих процесс рекомбинации в клетке, а также выявление тех биохимических особенностей белка RecA D112R, которые лежат в основе его повышенной рекомбиногенности.
Задачи исследования:
1) Проанализировать аминокислотные замены в области взаимодействия RecA-RecA,
влияющие на частоту рекомбинационных обменов (ЧРО).
2) Исследовать пути нормализации или ограничения гиперрекомбинационной активности в
клетках Е. coli, несущих гиперактивный белок RecA Dl 12R.
Выделить и очистить белок RecA D112R, сравнить его биохимические свойства с белком RecA дикого типа.
Исследовать особенности регуляции филамента RecA Dl 12R вспомогательными белками -такими, как белки SSB, F'SSB, PsiB, LexA, RecX. Провести сравнение с другими гиперактивными мутантными белками RecA.
5) Изучить связи между ДНК-синаптазной активностью белков RecAEc, RecA D112R, RecA
Е38К и RecA AC 17 in vitro и рекомбинационной активностью клеток, экспрессирующих эти белки.
Основные положения, выносимые на защиту:
Белок RecA D112R увеличивает частоту рекомбинационных обменов на единицу длины ДНК in vivo в 52 раза, являясь наиболее рекомбинационно активным из изученных на сегодняшний день мутантных белков RecA.
В популяции клеток Е. coli с аномально высокой RecAD112R-3aBHCHMoft рекомбинацией наблюдается постепенный отбор клеток со сниженной гиперрекомбинацией. Селекция приводит к снижению рекомбинационной активности до нормального уровня.
Мутантный белок RecA Dl 12R по сравнению с белком RecAEc обладает:
а) повышенной способностью расплавлять вторичные структуры на онДНК;
б) повышенной способностью смещать белок SSB с онДНК, в том числе при снижении
концентрации ионов магния в реакционной смеси;
в) повышенной способностью смещать белок F'SSB с онДНК;
г) повышенной устойчивостью к ингибирующему воздействию белков PsiB и RecX;
д) повышенной скоростью проведения реакции обмена нитей ДНК при снижении
концентрации ионов магния в реакционной смеси.
4) Устойчивость филамента RecA к ингибирующему действию белка RecX определяется не только силой межбелковых RecA-RecX взаимодействий, но и динамикой филаментации RecA на онДНК.
5) Высокая рекомбиногенность мутантного белка RecA D112R обеспечивается повышенной скоростью инициирования синаптазной реакции.
Научная новизна и практическая ценность работы. Выявлено влияние точечных аминокислотных замен в области мономер-мономерного взаимодействия белка RecA на его рекомбинационные свойства. Исследованы пути нормализации рекомбинационной активности белка RecA D112R в клетках Е. coli. Впервые охарактеризованы биохимические свойства белка RecA D112R, как наиболее рекомбиногенного из всех белков RecA, изученных к настоящему времени. Обнаружена повышенная активность белка RecA D112R в процессе вытеснения белков SSB и F'SSB с онДНК, а также в реакции расплетания вторичных структур на онДНК. Обнаружена устойчивость онДНК -зависимой АТФазной активности белка RecA D112R к действию таких негативных регуляторов рекомбинации, как белки PsiB и RecX. Предложена усовершенствованная модель регуляции филамента RecA белком RecX, в рамках которой элонгация филамента RecA вдоль онДНК блокируется белком RecX на участке онДНК, расположенном за пределами филамента. Обнаружен новый путь повышения рекомбиногенности белка RecA за счет увеличения его синаптазной активности.
Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное исследование относится к числу фундаментальных, оно расширяет наши представления о молекулярном механизме гомологической рекомбинации. Вместе с тем, подобные исследования имеют и прикладное значение: белок RecA D112R может быть использован в роли гомологичной рекомбиназы, введение которой в клетки млекопитающих может существенно активировать рекомбинацию в клетках высших и обеспечить замену участка гена при мишенной рекомбинации.
Белок RecA из Е. coli использовался в биотехнологии, однако широкое применение нашли только несколько технологий, использующих RecA, в то время как многочисленные попытки использования RecA в области генетической инженерии имели ограниченный успех. Рекомбинационная активность RecA в клетках Е. coli дикого типа может зависеть от функций множества регуляторных белков, присутствие которых, по-видимому, не слишком легко обеспечить в экспериментах, направленных на модификацию генома эукариот. Использование в биотехнологии мутантных белков RecA с точечными заменами, усиливающими одну или более функций RecA, может привести к продуктивному использованию рекомбинационного потенциала этого белка.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XI, XII и XIV Международных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2007, 2008 и 2010 гг.), на семинарах политехнического симпозиума «Молодые ученые -промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2005, 2006 и 2010 гг.), на II
научной конференции «Молекулярная генетика, биофизика и медицина» (Бреслеровские чтения-
II) (Санкт-Петербург, 2006), на Всероссийском форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и инновации в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2008) и «Russian-Swiss Workshop on Regulation of genome stability by DNA replication and repair» (Санкт-Петербург, 2010).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка литературы, содержащего 228 источников. Иллюстративный материал содержит 28 рисунков и 6 таблиц.
