Введение к работе
Актуальность темы
Культуры Escherichia coli широко используются в производстве ряда биологически активных веществ, в том числе аминокислот, применяемых в различных отраслях - пищевой, кормовой, фармацевтической промышленности. Для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов методами метаболической инженерии требуется понимание основных метаболических процессов, к которым относится и перенос веществ через цитоплазматическую мембрану.
D-глюкоза применяется в микробиологическом производстве в качестве источника углерода для накопления бактериальной биомассы и биосинтеза биологически активных соединений. Показано, что у ряда продуцентов недостаточная эффективность транспорта глюкозы в клетку является фактором, ограничивающим продуктивность.
Известно, что в клетках Е. coli основной путь утилизации D-глюкозы
начинается с ее транслокации через цитоплазматическую мембрану и
фосфорилирования (с образованием D-глюкозо-б-фосфата),
осуществляемых фосфоенолпируват:углевод фосфотрансферазной
системой (PTS) с использованием фосфоенолпирувата (PEP) в качестве
донора фосфатной группы. При этом на долю PTS приходится 50% пула
фосфоенолпирувата, в то время как на долю основных биосинтетических
ферментов, использующих PEP как субстрат,
фосфоенолпируваткарбоксилазы, пируваткиназы, уридиндифосфат-N-ацетилглюкозамин-енолпирувил-трансферазы и З-деокси-Б-арабино-гептулозонат-7-фосфатсинтазы - 16, 15, 16, 3%, соответственно (Kim, Lees etal. 1996).
К настоящему времени большинство работ, посвященных увеличению эффективности транспорта глюкозы в клетку, было связано именно с модификацией активности PTS. Однако, транспорт через эту систему не выгоден в тех случаях, когда расходующийся на перенос и фосфорилирование глюкозы фосфоенолпируват одновременно является прямым метаболическим предшественником целевого продукта (к примеру, аминокислот аспарагинового семейства). Таким образом, экономия PEP вследствие использования клетками альтернативных PTS-независимых систем транспорта глюкозы, имеет очевидные преимущества для подобных процессов.
На момент начала работы были известны две PTS-независимые системы транспорта моносахаров Е. coli, способные к переносу глюкозы. Это GalP - низкоафинный Н+-симпортер (пермеаза) D-галактозы (Hernandez-Montalvo et al., 2003), который из-за схожести пространственной структуры, субстратной специфичности и способности к ингибированию некоторыми
антибиотиками часто рассматривают в качестве бактериального аналога пассивного транспортера глюкозы млекопитающих - GLUT1, и АТФ-зависимый транспортер (ABC-транспортер) р-метилгалактозидов MglABC -высокоаффинный переносчик, активный на завершающих стадиях культивирования при малых концентрациях глюкозы (Franchini and Egli, 2006). Было показано, что использование этих транспортных систем в дополнение к активной PTS позволяет увеличить выход целевого продукта при культивировании ряда штаммов-продуцентов Е. coli на средах с глюкозой.
Цель и задачи исследования
Основной целью настоящей работы являлся поиск PTS-независимых транспортеров Сахаров Е.соН, способных к переносу глюкозы внутрь клетки Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- Разработка методического подхода к изучению процесса PTS-
независимого транспорта глюкозы (на примере пермеазы галактозы GalP)
Поиск и исследование транспортных систем Е.соН, потенциально способных к транспорту глюкозы
Исследование влияния этапа внутриклеточного фосфорилирования глюкозы на эффективность ее утилизации клеткой
Использование систем PTS-независимого транспорта глюкозы при создании штаммов-продуцентов аминокислот.
Научная новизна и практическая ценность работы
На основании разработанного методического подхода впервые продемонстирована способность ряда PTS-независимых транспортных систем (XylE, FucP, AraFGH и AlsABC) переносить D-глюкозу в клетки Е.соН. Показано, что увеличение активности глюкокиназы улучшает эффективность утилизации D-глюкозы при использования PTS-независимого пути ее транспорта; однако чрезмерное увеличение экспрессии генов, кодирующих PTS-независимый транспортер GalP и глюкокиназу Glk, приводит к ингибированию роста клеток штамма Е.соН с неактивной PTS. Наблюдаемый эффект, по-видимому, связан с накоплением токсического для клетки количества фосфорилированных производных D-глюкозы вследствие дисбаланса между стадиями их синтеза и продуктивного вовлечения в клеточный метаболизм. Использование новых PTS-независимых транспортеров D-глюкозы, дополнительно к нативной фосфотрансферазной системе, увеличивает накопление и скорость синтеза ряда аминокислот соответствующими штаммами-продуцентами Е.соН.
Результаты работы могут быть полезны при дальнейшем изучении систем транспорта углеводов, исследованных в данной работе, и процессов
утилизации D-глюкозы клетками E.coli, а также найти практическое приложение в биотехнологии.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были доложены на V Съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (ВОГиС) (Москва, 21-27 июня 2009г.) и на смотре-конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» (Москва, 16-17 июня 2010г.).
Диссертационная работа была апробирована на семинаре совместного заседания секций «Молекулярная биология» и «Генетика микроорганизмов» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» и Научно-Технического совета НИИ «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ») 20 декабря 2010 года.
Публикации
По теме диссертации опубликовано шесть печатных работ; из них одна статья в журнале, входящем в список, рекомендованный ВАК, четыре патента и одно сообщение в материалах научной конференции.
Структура работы
Диссертация изложена на /^страницах печатного текста, включая ^У рисунков и Ар таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данных, выводов и списка цитируемой литературы (^^наименований).
