Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Конструирование рекомбинантных клеток E. coli - биосенсеров для анализа генотоксичности химических соединений и физических факторов 10
1.1. Клонирование фрагмента ДНК, кодирующего оперон биолюминесценции
P. leiognathi 11
1.2. Биолюминесцентный анализ SOS-ответа клеток E. coli 14
1.3. Индукция SOS-ответа под действием веществ – мутагенов (SOS lux тест) 16
1.4. Индукция SOS-ответа под действием UV или -излучений 19
1.5. Анализ генотоксического действия комплексных соединений платины и сравнительная оценка их генотоксичности в эукариотической тест-системе 19
1.6. Возможности проведения SOS lux теста в полуавтоматическом варианте в микропланшетах или использования иммобилизованных клеток в тест системе 24
Заключение 25
Глава 2. Экспрессия синтетических генов в клетках E. coli 26
2.1. Цитоплазматическая экспрессия синтетических генов в клетках E. coli .27
2.1.1. Модификации штаммов-продуцентов интерлейкина-3 и интерлейкина-4 человека. 27
2.1.2. Делеционная форма интерлейкина-4 человека -IL4-2 31
2.1.3. Интерлейкин-10 человека – hIL-10 37
2.1.4. Нейротрофин глиального происхождения человека - GDNF 40
2.1.5. Фактор роста кератиноцитов человека - hKGF 44
2.1.6. Рецепторный антагонист интерлейкина-1 человека -hlL-1ra 46
2.1.7. -интерферон быка - bIFN- 47
2.2. Экстраклеточная продукция эпидермального фактора роста человека - hEGF 49
Заключение 52
Глава 3. Оптимизация ряда биосинтетических путей в клетках E. coli c целью повышения продукции аминокислот 53
3.1 Модификация путей транспорта источников углерода с целью увеличения продукции аминокислот E.coli штаммами-продуцентами 54
3.2. Модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина 62
3.3. Идентификация генов, кодирующих ферменты пути I деградации путресцина (pathway: putrescine degradation I) 72 Заключение 85
Глава 4. Поиск новых низкомолекулярных биологически активных веществ растительного происхождения и возможность их микробиологического синтеза ... 86
4.1. Методы и тест-системы, использованные для скрининга этанольных экстрактов сухих растительных препаратов 87
4.2. Результаты скрининга этанольных экстрактов растительных препаратов 89
4.3. Идентификация новых соединений из экстрактов, активных в in vitro тестах 92
4.4. Заключение. Потенциальная возможность микробиологического синтеза идентифицированных соединений 99
Выводы 99
Список публикаций по теме диссертации
- Индукция SOS-ответа под действием веществ – мутагенов (SOS lux тест)
- Возможности проведения SOS lux теста в полуавтоматическом варианте в микропланшетах или использования иммобилизованных клеток в тест системе
- Фактор роста кератиноцитов человека - hKGF
- Модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина
Введение к работе
…………………………………..………..… 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ………………………………………………….………….. 6
ВВЕДЕНИЕ …………………………………………………………………………………. 9
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ………………………… 10
Актуальность проблемы.
Современная биотехнология, разрабатывающая и использующая генно-инженерные и клеточные методы создания генетически модифицированных биологических объектов для получения новых видов биологических и химических продуктов различного назначения и повышения эффективности их производства, возникла в 70-х гг. прошлого века. Развитие данных технологий на первых этапах было основано на манипуляциях in vitro с фрагментами ДНК из различных источников и/или синтетическими фрагментами ДНК, c последующим введением их в составе плазмид в живую клетку, где «искусственная» ДНК была способна реплицироваться, а кодируемая ею информация - экспрессироваться. В дальнейшем для повышения уровня продукции целевых соединений были разработаны методы целенаправленного и прецизионного внесения модификаций в бактериальный геном путем замены структурных и/или регуляторных областей биосинтетических генов, их внутрихромосомной амплификации и модуляции уровня экспрессии; делеции генов, контролирующих синтез нежелательных метаболических интермедиатов и побочных продуктов целевого биосинтеза; оптимизации клеточных систем потребления источников питания и систем секреции целевых продуктов и т.д.
Наглядными примерами успехов современной биотехнологии являются крупнотоннажное производство природных протеиногенных L-аминокислот, основанное на микробных продуцентах, создание новых эффективных лекарственных средств на основе низкомолекулярных биологически активных веществ и БАВ белковой природы – рекомбинантных гормонов и цитокинов.
Клетки Escherichia coli до сих пор являются одним из наиболее генетически и биохимически изученных микроорганизмов, что обусловливает их широкое применение как в биотехнологических исследованиях, так и в промышленности.
Настоящая диссертационная работа, представляемая в виде научного доклада, обобщает результаты исследований, посвященных: разработке биологических тест-систем (биосенсоров) на основе SOS-ответа клеток E. coli для оценки генотоксичности химических соединений и физических факторов; конструированию штаммов-продуцентов ряда цитокинов и факторов роста человека и других белков на основе бактерии E. coli; оптимизации ряда биосинтетических путей в клетках E. coli c целью повышения продукции аминокислот; поиску новых биологически активных низкомолекулярных веществ растительного происхождения, синтез которых может быть в будущем реализован микробиологическим путем.
Цели и задачи исследования.
Основная цель работы состояла в создании рекомбинантных штаммов E. coli, выполняющих функции биосенсоров для оценки генотоксичности, штаммов-продуцентов ряда белков (цитокинов и факторов роста) и низкомолекулярных соединений (аминокислот), и в поиске новых биологически активных низкомолекулярных веществ растительного происхождения, потенциальных объектов для микробиологического синтеза.
В соответствии с этим решались следующие задачи:
1. Конструирование рекомбинантных штаммов E. coli, несущих оперон биолюминесценции Photobacterium leiognathi под контролем индуцируемого SOS-системой E. coli промотора гена cda плазмиды ColD
2. Разработка условий проведения теста на генотоксичность химических веществ и физических факторов с использованием рекомбинантных штаммов E. coli (SOS lux тест).
3. Анализ генотоксического действия комплексных соединений платины, потенциальных противораковых препаратов, с помощью SOS lux теста и сравнительная оценка их генотоксичности в эукариотической тест-системе.
4. Синтез генов некоторых цитокинов и факторов роста [интерлейкин-3, интерлейкин-4, делеционная форма интерлейкина-4 - IL4-2, интерлейкин-10, нейротрофин глиального происхождения (GDNF), фактор роста кератиноцитов (KGF), рецепторный антагонист интерлейкина-I (hlL-1ra), эпидермальный фактора роста (EGF) человека; -интерферон быка (bIFN-)] и разработка систем их экспрессии в клетках E. coli.
5. Разработка методов выделения ряда цитокинов и факторов роста и оценка их биологической активности.
6. Оптимизация систем транспорта глюкозы в клетках E. coli путем модификации пермеазы PtsG и усиления экспрессии пермеазы EIINag с целью увеличения продукции аминокислот штаммами-продуцентами.
7. Получение штаммов Е. coli, способных использовать этанол в качестве источника углерода, и поиск необходимых модификаций путей основного метаболизма E. coli, приводящих к повышению выхода аминокислот при совместном использовании глюкозы и этанола в качестве источников углерода.
8. Модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина (N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы) для конструирования высокопродуктивных штаммов-продуцентов аминокислоты.
9. Исследование путей возможной деградации интермедиатов синтеза аргинина.
10. Поиск новых биологически активных низкомолекулярных веществ растительного происхождения, синтез которых может быть в будущем реализован микробиологическим путем.
Научная новизна и практическая значимость результатов исследования.
Впервые сконструирована тест-система (SOS-lux test) для оценки генотоксичности химических веществ и физических факторов (- и UV- излучение), основанная на измерении SOS-ответа клеток E. coli на действие ДНК-повреждающих факторов, в которой в качестве гена-"репортера" использован оперон биолюминесценции P. leiognathi под контролем промотора гена cda плазмиды ColD. Тест применялся при оценке генотоксичности и общей токсичности ряда соединений платины, проявляющих противоопухолевую активность, в частности цис-ДДП и циклоплатама. Сконструированная тест-система нашла широкое применение при исследованиях общетоксических и мутантных свойств поллютантов (см. например, Масленникова (ИЭГМ, УроРАН), 2007, Кхатаб З.С. (Южный федеральный университет, г. Ростов-на-Дону), автореф. дисс., 2013; Е. П. Гуськов, и др., (НИИ биологии при ЮФУ, г. Ростов-на-Дону), 2009); при разработке следующего поколения биосенсоров для оценки генотоксичности (SOS-LUX-LAC-FLUORO test (Rabbow E. et al, 2003, Horneck G et al., 2010 (DLR, Institute of Aerospace Medicine, Cologne, Germany)). Данная часть работы частично финансировалась в 1995-1997 г.г. грантами INTAS (93-2850) и COPERNICUS (CIPA CT-94 0122, European Commission).
Сконструирован ряд E. coli штаммов-продуцентов цитокинов и факторов роста (IL-3, IL-4, IL4-2, IL-10, GDNF, KGF, hlL-1ra, EGF человека; -интерферона быка (bIFN-)) с использованием синтетических или полусинтетических генов данных белков. Высокоэффективная продукция белков достигалась с использованием следующих генно-инженерных подходов: а) оптимизация силы промоторов и использование высокоэффективных рибосом-связывающих последовательностей, б) строгая регуляция транскрипции, в) модификация первичной структуры mRNA белков для оптимизации трансляции, г) предотвращение протеолиза целевых продуктов путем использования штаммов E. coli дефектных по некоторым протеазам, д) цитоплазматическая продукция белков в виде телец включения, продукция белков в виде их гибридных вариантов, или, в случае EGF, экстраклеточная продукция целевого белка. Разработаны методы выделения и очистки некоторых субстанций белков.
Субстанции белков hIL-4 и hIL-42 использовались в Институте инженерной иммунологии для структурно-функциональных исследований рекомбинантного делеционного варианта интерлейкина-4; hIL-42 передан в Институт Цитологии Новосибирского отделения РАМН для изучения роли этого цитокина в ткане-специфической регуляции иммунных реакций на разных этапах онтогенетического развития. Штамм-продуцент рекомбинантного hGDNF передан в НПЦ «Фосфосорб» для дальнейших исследований по изучению возможности создания на его основе эффективных лекарственных биопрепаратов. Биологически активные субстанции hEGF и hKGF применялись при выращивании аллогенных эпидермальных пластов (Институт биологии развития РАН) с последующей их трансплантацией больным при глубоких ожогах и незаживающих трофических язвах. Высокоэффективные штаммы продуценты рекомбинантного hIL-lга были переданы в ГНЦ РФ ГосНИИОЧБ (СанктПетербург), где впоследствии были разработаны методы выделения и очистки целевого белка в препаративных количествах, показана биологическая активность hIL-l ra и начаты доклинические испытания препарата. Штамм E. coli BL21(DE3) (pET-22-blFN-) был передан в АО «МосАгроГен» для разработки промышленного регламента выделения и очистки рекомбинантного -интерферона быка с целью последующего создания комбинированных препаратов ветеринарного назначения на основе природных и рекомбинантных интерферонов и цитокинов.
Показана возможность усиления потребления глюкозы штаммами E. coli при экспрессии в них мутантной пермеазы PtsG или при усиленной экспрессии пермеазы EIINag. Возможность интенсивного усвоения глюкозы клетками E. coli посредством пермеазы EIINag была показана впервые.
Получены новые мутантные варианты алкоголь дегидрогеназы-альдегид дегидрогеназы E. coli (AdhE), обеспечивающие рост клеток на средах с этанолом в качестве единственного источника углерода в аэробных условиях культивирования.
Введение мутантных генов adhE под контролем сильного промотора в хромосому штаммов-продуцентов (например, треонина или глутаминовой кислоты) позволяет получить аминокислоту при росте клеток на средах с этанолом в качестве единственного источника углерода. Теоретически показаны необходимые модификации пути гликолиза для эффективной продукции аминокислоты при использовании в ростовых средах смесей глюкоза/этанол (на примере штамма-продуцента треонина).
Получены новые варианты мутантных N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы E. coli, ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина, резистентных к ретроингибированию. Гены мутантных ферментов использованы при конструировании высокопродуктивных штаммов-продуцентов аминокислоты.
Впервые идентифицированы гены (и охарактеризованы соответствующие белки) одного из путей деградации путресцина в GABA в E. coli. Данный путь в базе данных EcoCyc получил наименование пути I деградации путресцина (pathway: putrescine degradation I).
Скрининг более ста препаратов этанольных экстрактов растений, произрастающих на территории России, проведенный с использованием in vitro тестов: 1) ингибирование ангиотензинпревращающего фермента ACE I; 2) ингибирование продукции TNF- и PGE2 клетками моноцитов человека THP-1; 3) оценка антиоксидантной активности (DPPH тест); 4) ингибирование панкреатической липазы (HPL) человека; 5) активация фосфорилирования 5'-АМФ-активируемой протеинкиназы (AMPK) - выявил препараты с высокой специфической активностью в данных тестах.
Несколько экстрактов показали высокую активность в более чем одном тесте: экстракт соплодий ольхи – в DPPH и ACE I тестах, экстракт из корневищ бадана - в HPL and ACE I тестах, экстракт грушанки круглолистной – в AMPK и PGE2 тестах.
Идентифицированы индивидуальные вещества, высокоактивные в указанных выше тестах: а) из экстракта соплодий ольхи выделены глутиноин (соединение обнаружено и структура идентифицирована впервые), педункулагин и праекоксин Д, показавшие антиоксидантную активность в DPPH тесте сравнимую с активностью таких известных антиоксидантов, как галловая и аскорбиновая кислоты; б) из корневищ бадана выделены (+)-катехин 3,5-ди-O-галлат (обнаружен и структура идентифицирована впервые) и (+)-катехин 3-O-галлат, показавшие высокую антиоксидантную и HPL ингибирующую активности, сравнимые с известными препаратами антиоксидантов и липазных ингибиторов растительного происхождения; в) в экстракте грушанки круглолистной обнаружен 2-метил-7-гидроксиметил-1,4-нафтохинон, для которого впервые была показана способность индуцировать фосфорилирование АМРК в дифференцированных клетках миобластов мыши C2C12. Этот активатор AMPK сравним по активности с ресвератролом или гинзенозидом и может быть перспективен в качестве компонента функционального питания.
Возможность микробиологического синтеза идентифицированных соединений обсуждается с учетом достигнутых в последние годы успехов в метаболической инженерии путей биосинтеза метаболитов – предшественников флавононов, биосинтеза флаванонов и флавонолов в клетках E. coli.
Апробация работы.
Основные результаты работы были доложены на совместном заседании Научно-технического совета НИИ «Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ») и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика».
Результаты работы были представлены на: Всесоюзной научной конференции «Генетические последствия действия биологических и химических факторов окружающей среды по проблеме «Человек и Биосфера»» (Киев, 1988), V Конференции РФ «Новые направления биотехнологии» (Пущино, 1992), VI Конференции РФ «Новые направления биотехнологии» (Пущино, 1994), Baev International Conference of Biotechnology (Moscow, Russia, 1996), 7-th Imternational Conference on Environmental Mutagens. SOS Chromotest Workshop at the 7th ICEM Meeting (Toulouse, France, 1997), NATO Advanced Research Workshop on Fundamentals for the Assessment of Risk from Environmental Radiation (Brno, Czech Republic, 1997), 2nd Joint Meeting of the ICS and the ISICR (Jerusalem, Israel, 1998), VI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1999), 2nd International Conference on Tumor Microenvironment: Progression, Therapy and Prevention (Baden, Austria, 2002), Eighteenth UICC International Cancer Conference (Oslo, Norway, 2002), Eleventh International Cytokine Society Conference (Dublin, Ireland, 2003), 1st FEMS congress of European Microbiologists (Ljubljana, Slovenia, 2003), 30th FEBS Congress “The Protein World”, (Budapest, Hungary, 2005), 3rd Moscow International Congress “Biotechnology: state of art and prospects of development” (Moscow, Russia, 2005).
Публикации
111 работ (37 статей в научных журналах, 35 патентов, 5 статей в иностранных сборниках научных трудов, материалы конференций, конгрессов и симпозиумов – 34) были опубликованы после защиты кандидатской диссертации. По теме диссертации опубликовано 87 печатных работ (28 статей в научных журналах; часть результатов защищена 32 российскими и зарубежными патентами; 5 статей в иностранных сборниках научных трудов; 22 материала российских и международных конференций).
Бактериальные штаммы. Генотип и происхождение исходных штаммов бактерий, использованных в работе.
Штамм Photobacterium leiognathi 54D10 (из коллекции Красноярского университета);
Штаммы Escherichia coli:
C600 (F2, thi-1, thr-1, leu136, lacYI, tonA21, supE44) (Bachmann BJ, 1972);
HB101 [F-, hsdS (rb-, mb-), recA, ara-14, proA, leu, thi, lacY, galK2, str, xyl-5, mtl-1, supE44] (Sambrook et a1., 1989);
JM109 [recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relA1, (lac-pro) [F', traD36, proA+B+, lacIq, lacZMI5]; (Sambrook et a1., 1989);
AB1157 (F-, thr-1, leuB6, proA2, hisG4, argE3, lacY1, thi-1, galK2, ara-14, xyl-5, mtl-1, tsx-33, supE44, rpsL31, -s); JC9239 (производный от AB1157, recF143) (штаммы предоставлены В.А.Тарасовым, Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова, РАН, Москва).
TG1 (supE, hsd5, thi, (lac-proAB) [F,' traD36, proAB+, lacIq, lacZMI5]) (Sambrook et a1., 1989)
BL21 (F-, оmрТ, lon, hsdS, gal, rb-, mb-) (Studier FW et al., 1986);
BL21(DE3) (BL21:: lambda D69-plac uv5-T7 gene 1) (Studier FW et al., 1990);
MG1655 –штамм E. coli дикого типа с полностью установленной первичной структурой хромосомной ДНК (htpp://www.genetics.wisc.edu) из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ).
B3083 (argA, metB) и B6969(carB::Tn10) из коллекции ВКПМ;
237: штамм-продуцент аргинина B-7925(ilvA::Tn5, argR) (ВКПМ).
B3996: штамм-продуцент треонина TDH-6/pVIC40 (US Патенты 5,175,107 и 5,705,371) (ВКПМ)
Исходные плазмиды. В работе использованы следующие плазмидные векторы: pBR322, pUC18, pUC19, pUC4K (Pharmacia), ColD (Frey J et al., 1986), рАСУС177 (ВКПМ), pET22b(+) и pET15b(+) (Novagene). pMW118 и pMW119 (малокопийные векторы, Nippon Gene).
Олигонуклеотиды синтезировали на автоматическом синтезаторе ДНК фирмы Milligen/Biosearch, модель 8700, с использованием фосфоамидитного метода и очищали с помощью HPLC, или получали из фирмы «Синтол», Москва.
Манипуляции с ДНК осуществляли, используя стандартные методы (Sambrook et al., 1989) и следуя инструкциям фирм - производителей ферментов для молекулярной биологии (Pharmacia, Fermentas, New England Biolabs, Takara Shuzo и др.). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборах фирмы «Applied Biosystems». Нуклеотидные последовательности ДНК определяли по методу Сэнджера (Sanger et а1., 1977) или на автоматическом секвенаторе.
Процедура получения синтетических генов включала следующие этапы: 1) синтез набора олигонуклеотидов (длиной от 30 до 70 оснований), соответствующих последовательностям двух цепей ДНК гена; 2) фосфорилирование олигонуклеотидов с помощью Т4-полинуклеотидкиназы; 3) олигонуклеотиды (как правило, 5’-концевой олигонуклеотид обратной цепи гена был нефосфорилирован) смешивали в эквимолярных количествах (по 20 pmol каждого) в 100 мкл лигазного буфера, смесь отжигали, понижая температуру от 85C до 20C в течение 2 час, лигировали, затем синтезированную ДНК расщепляли по сайту рестрикции, введенному в 3’-концевую последовательность гена; 4) ДНК гена выделяли с помощью электрофореза в агарозном геле, клонировали в соответствующем векторе и последовательность гена анализировали секвенированием.
Гены: интерлейкина 3 (hil-3) человека и -интерферона быка синтезированы в лаборатории проф. Е.Д. Свердлова (ИБХ им. Шемякина и Овчинникова РАН Москва), рецепторного антагониста интерлейкина-1 человека (hIL-1ra) предоставлен проф. Ю.А. Берлиным (ИБХ им. Шемякина и Овчинникова РАН), интерлейкина 4 человека (hil-4) и эпидермального фактора роста человека (hegf) синтезированы в лаборатории А.В. Ажаева (ВНИИ биотехнологии). Список генов, полученных нами путем химико-ферментативного синтеза, представлен в таблице 1. Последовательности синтетических генов определялись на основании литературных данных по структуре соответствующих ДНК или аминокислотных последовательностей белков. При этом учитывалась частота встречаемости кодонов в клетках E. coli, а также необходимость наличия сайтов узнавания рестриктаз для процедуры химико-ферментативного синтеза и клонирования гена.
Таблица 1.
Расчет потенциальных вторичных структур mRNA проводили в соответствии с кинетическим алгоритмом, реализованным в пакете компъютерных программ DNA-SUN А.А.Мироновым (ГосНИИгенетика, Москва), а также с помощью Web-ресурса GeneBee – Molecular Biology Server ().
Электрофорез олигонуклеотидов, ДНК и белков в ПААГ проводили по стандартным методикам (Laemmli et al., 1970; Sambrook et al., 1989).
Концентрацию суммарных клеточных белков определяли по методу Бредфорда с использованием реактива фирмы Bio-Rad (Bradford et al., 1976). Количественное определение содержания в клетке целевых белков проводили путем сканирования прокрашенного в растворе Coomassie-blue R-250 электрофорезного геля на денситометре CSD-200 (Beckman, США).
Среды. Клетки Е. coli выращивали при 300С или 370С на среде LB или на минимальной среде М9 (Миллер, 1976), в которую вносили глюкозу (и/или этанол), необходимые добавки и антибиотики.
На основе исходных штаммов бактерий и плазмид были получены десятки новых шrаммов и гибридных плазмид, часть из которых приведена в таблице 7. Подробные процедуры их получения содержатся в публикациях, список которых приведен в конце днссертации.
SOS lux тест. Штамм С600 (pPLS-1) выращивали на среде LB до оптической плотности культуры равной 0,3 - 0,4 (550 нм). Аликвоты культуры (по 300 мкл) переносили в стерильные полипропиленовые пробирки (из комплекта к люминометру LKB) и добавляли в них по 10 мкл тестируемого соединения требуемой концентрации. В контрольную пробирку добавляли 10 мкл дистиллированной воды. Продолжали инкубацию в течение 1,5 часа, затем охлаждали культуры до комнатной температуры (10 мин) при их непрерывном перемешивании. Измерение интенсивности биолюминесценции культур, содержащих анализируемые вещества, и контрольных культур проводили на люминометре 1250 (LKB, Швеция) или мультифункциональном люминометре Lucy1 (Anthos Mikrosystem GmbH, Krefeld, Германия); время измерения свечения одного образца - 1сек.
Эксперименты по анализу экспрессии генов с помощью ДНК-чипов (DNA array метод) проводили с использованием Panorama E.coli OligoArray чипов (Sigma Genosys) и набора E.coli OligoArray cDNA праймеров. Для выделения mRNA применяли метод экстракции горячим фенолом, реакцию обратной транскрипции проводили с использованием HotScribe First-Strand cDNA Labeling Kit (Amersham Biosciences), процедуры гибридизации проводили в соответствии с рекомендациями фирмы - производителя чипов, чипы экспонировали в кассете Molecular Dynamics с экраном Low Energy Screen (“Kodak“) в течение 24-72 часов. Визуализацию и количественную оценку радиоактивных сигналов проводили с использованием мультифункционального сканера Typhoon 9210 (Amersham) при разрешении 50 мкм и программы ImageQuant (V 5.0).
HPLC стадии выделения и очистки веществ проводили на оборудовании фирм Amersham Biosciences и Waters.
Оптические плотности растворов и клеточных культур, а также спектры соединений в UV и видимом диапазоне определяли с помощью спектрофотометров фирм Phillips и Amersham Biosciences. При проведении реакций в микропланшетах, результаты учитывали с использованием планшетного ридера Multiscan Ascent (Thermo Electron) или планшетного флуориметра Genios FL fluorimeter (Tecan).
Масс-спектрометрический анализ образцов белков проводили в Протеомном центре института биомедицинской химии РАМН, Москва.
Масс-спектры высокого разрешения образцов химических соединений получали с использованием масс-спектрометра Synapt MS (Waters).
Bruker Avance-400 спектрометр использовали для получения 1H (400 MHz), 13C (100 MHz), HSQC и HMBC спектров ЯМР химических соединений (внутренний стандарт – TMS).
Методы культивирования эукариотических клеток и тестирования противовоспали-тельного и AMPK активирующего потенциала растительных экстрактов детально описаны в соответствующих публикациях (Kalinkevich K et al, 2013; Ptitsyn LR et al., 2011).
Метаболическая инженерия на практике подразумевает оптимизацию генетических и регуляторных процессов внутри клетки с целью увеличения продукции определенных соединений. Эти процессы представляют собой комплекс осуществляемых ферментами биохимических реакций, который позволяет клеткам конвертировать вещества – источники питания в соединения, необходимые для их жизнедеятельности, и целевые продукты.
Методология метаболической инженерии, зародившаяся в начале 1990-х годов, включает в качестве составных частей: анализ метаболических путей микроорганизмов для поиска узких мест и узловых точек метаболизма, препятствующих высокоэффективной продукции целевых веществ микроорганизмами; поиск математических моделей превращений метаболитов; расчет выхода целевых продуктов.
В 1996 г. было предложено следующее рабочее определение метаболической инженерии: “Метаболическая инженерия – целенаправленное изменение метаболических путей организма с целью лучшего понимания и использования их для химической трансформации, передачи энергии и сборки надмолекулярных комплексов. Метаболическая инженерия включает перераспределение клеточных активностей путем перестройки энзиматических, транспортных и регуляторных функций клетки через использование рекомбинантных ДНК и других технологий” (F. Heineken, 1996). С практической точки зрения были выделены восемь важнейших направлений исследований для развития метаболической инженерии: 1) обнаружение и оценка контролирующих механизмов и потоков субстратов (флаксов) плохо изученных путей биосинтеза, 2) разработка аналитического инструментария для изучения ферментативных и регуляторных процессов in vivo, 3) разработка и применение новых генетических инструментов, как то: селективные маркеры, гены-репортеры, векторы, регуляторные молекулы, для манипулирования с клетками, 4) расширение набора микроорганизмов, с которыми возможны генетическое и метаболические манипуляции, 5) развитие технологий для повышения выживаемости и генетической стабильности генетически измененных клеток, 6) создание баз данных и компьютерных программ для анализа путей метаболизма и их моделирования, 7) исследование механизмов транспорта низкомолекулярных веществ через мембраны, 8) разработка и применение систем, обеспечивающих возможность использования новых путей метаболизма (в т.ч., из растений и разнообразных микробов) для синтеза новых целевых соединений (“Metabolic engineering, NIH Guide”, 1996). Таким образом, эта мультидисциплинарная область включает в себя как биохимические, так и геномные, транскриптомные, протеомные, метаболомные исследования, анализ потоков метаболитов (flux analysis) и другие методологии системной биологии (Herrman T., 2004; Alper H. & Stephanopoulos G, 2004), необходимые для достижения практических целей биотехнологических производств.
Хотя такого рода комплексные исследования дают явные преимущества при создании штаммов-продуцентов низкомолекулярных соединений или рекомбинантных белков, при реализации каждого отдельно взятого процесса могут возникать существенные проблемы, вследствие чего на практике стратегия улучшения процесса и набор применяемых для этого методов, как правило, определяются эмпирически (Wendisch VF et al., 2006; Jana S and Deb JK, 2005).
Принципы метаболической инженерии клеток E. coli частично были применены на ранних стадиях данной работы (конструирование SOS lux теста, штаммов-продуцентов цитокинов и факторов роста) и, в большей степени, использованы при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот.
Индукция SOS-ответа под действием веществ – мутагенов (SOS lux тест)
Нами была предложена модификация вышеописанных тестов, в которой оперон биолюминесценции Photobacterium leiognathi был использован в качестве гена-"репортера" для анализа уровня SOS-ответа клеток E. coli.
Люминесценция морских фотобактерий обусловлена ферментативной реакцией, катализируемой -, - гетеродимерным ферментом - люциферазой, субстратами которой являются алифатический альдегид, молекулярный кислород и восстановленный флавинмононуклеотид: FMNH2 + O2 + RCHO FMN + H20 + RCO2H + hv
Организация оперонов биолюминесценции некоторых микроорганизмов ко времени начала данных исследований была достаточно хорошо изучена, и было показано, что, в общем виде, гены оперона располагаются в последовательности: C,D,A,B,E (Meighen EA, 1991). luxA и luxB кодируют субъединицы люциферазы, luxC, luxD и luxE - ферменты биосинтеза алифатического альдегида. Для Vibrio fisheri (Engebrecht J et al., 1984) было установлено, что эта система представлена 2-я оперонами, один из которых содержал ген регуляторного белкового фактора (luxR), а второй – гены luxI (белка, синтезирующего аутоиндуктор биолюминесценции) и lux C,D,A,B,E. Опероны ряда фотобактерий (и, в частности, P. leiognathi) включали дополнительный ген luxF, локализованный между luxB и luxE, функция кодируемого им полипептида оставалась не выясненной (Illarionov BA et al., 1990).
Оперон биолюминесценции P. leiognathi был клонирован нами из штамма 54D10 коллекции Красноярского университета. Высокомолекулярную ДНК, выделенную из этого штамма, частично гидролизовали рестриктазой Sau3A, фрагменты ДНК размером 10-15 т.п.о. клонировали в векторе pBR322/BamHI и трансформировали лигазной смесью клетки E. coli TG1. Среди просмотренных визуально 10 000 клонов было обнаружено 2 люминесцирующих. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид (pPL1 и pPL2) показал, что они имеют разные размеры и противоположную относительно вектора ориентацию ДНК вставки. По интенсивности биолюминесценции клоны оказались достаточно близкими, следовательно, в общем для обеих плазмид фрагменте ДНК P. leiognathi присутствовали гены всех белков, обеспечивающих биолюминесценцию.
С помощью инсерционного мутагенеза с использованием гена устойчивости к канамицину из плазмиды pUC4K было картировано положение существенных для люминесценции функций. Все полученные инсерционные мутанты плазмиды pPL1 разделились на три класса: темновые, с альдегидзависимой и неизменившейся люминесценцией. Было установлено, что темновой фенотип определяется мутациями во фрагменте ДНК размером от 3,5 до 5,1 т.п.о.; альдегидзависимый - от 1,3 до 2,5 т.п.о.; у светящихся инсерционных мутантов вставки картировались либо в векторной ДНК, либо в отсутствующем в плазмиде pPL2 фрагменте. Темновой фенотип мог быть обусловлен мутациями в генах двух субъединиц люциферазы; биосинтеза альдегидного субстрата и регуляторных генах, если все они расположены перед генами люциферазы и R транскрибируются под контролем общего промотора. Вставка Km -гена в район промотора гена устойчивости к тетрациклину в векторе не нарушала люминесценции мутанта. Следовательно, транскрипция генов люминесценции в плазмиде pPL1 осуществлялась в рекомбинантных клетках E. coli c их собственного промотора (промоторов). Размер фрагмента ДНК, кодирующий альдегидзависимую люминесценцию, был явно недостаточен для кодирования 3 ферментов биосинтеза альдегидного субстрата. С другой стороны, мутации, определяющие темновой фенотип, были локализованы на фрагменте ДНК значительно большем, чем размер двух генов люциферазы. Поэтому мы предположили, что, как и в опероне биолюминесценции V. fisheri, гены двух субъединиц люциферазы расположены между генами биосинтеза альдегида, находятся под контролем общего промотора, и размер существенной для люминесценции области ДНК составляет около 6,5-7 т.п.о.
Затем, с целью более детальной локализации генов биосинтеза альдегида и люциферазы, был проведен делеционный мутагенез фрагмента ДНК P. leiognathi из плазмиды pPL2. Плазмиды pUPL32 и pUPL22 были получены путем клонирования, соответственно, HindIII-SphI фрагмента (7,3 т.п.о.) pPL2 по сайтам HindIII и SphI плазмиды pUC19 и SphI-SphI фрагмента (6,7 т.п.о.) по сайту SphI плазмиды pUC18. Остальные рекомбинантные плазмиды были получены как делеционные производные pUPL22. Препарат ДНК плазмиды расщепляли рестриктазой BamHI и частично Sau3A, лигировали полученные фрагменты линейной ДНК и трансформировали ими клетки E. coli HB101. Клоны HB101(pUPL32) и HB101(pUPL22) люминесцировали in vivo. Клетки, несущие плазмиды pUPL-22 -2, -21, -33, -17, 15 проявляли альдегидзависимую люминесценцию; несущие плазмиду pUPL22-27 - имели темновой фенотип (рис.1).
Из сравнения клонов HB101(pUPL22) и HB101(pUPL22-2) следовало, что делеция примерно 400 п.о. в 5 -концевой области фрагмента ДНК P. leiognathi плазмиды pUPL22 приводила к альдегидзависимому фенотипу клонов, т.е. к инактивации одного из генов биосинтеза альдегидного субстрата. Из сравнения плазмид pUPL22, pUPL22-2 и pUPL22-17 видно, что гены белков биосинтеза альдегидного субстрата локализованы слева от генов люциферазы на фрагменте ДНК размером от 2,2 до 2,6 т.п.о. Как было показано ранее для V. fisheru и V. harveyi (Engebrecht J et al., 1984), гены С и D, расположенные слева от генов A и B, кодируют полипептиды, соответственно, 53 и 33 кДа, а ген Е, находящийся справа от генов люциферазы, - 42 кДа. Поэтому размеры участков ДНК, на которых они локализованы, должны составлять не менее 2,5 т.п.о. слева и не менее 1,2 т.п.о. справа от генов люциферазы. Следовательно, информационная емкость SphI-XhoI фрагмента ДНК в плазмиде pUPL22 ( 2,5 т.п.о.) достаточно близка к необходимой для кодирования двух генов белков биосинтеза альдегидного субстрата, а в 3 -концевой области фрагмента (1,3-2,5 т.п.о.) расположен третий ген, ответственный за синтез альдегида.
Таким образом, мы сделали заключение, что гены оперона биолюминесценции P. leiognathi структурно организованы аналогично оперонам V. fisheri и V .harveyi, т.е. в последовательности C, D, A, B, E. Позднее в составе оперона биолюминесценции P. leiognathi был обнаружен дополнительный ген luxF, гомолог гена luxB, локализованный между luxB и luxE (Lee CY et al., 1991; штамм P. leiognathi, ATCC-25521). Также, полученные нами данные позднее были полностью подтверждены результатами секвенирования оперона биолюминесценции P. leiognathi (В.И.Гуревич, И-т Биофизики СО РАН, г. Красноярск, неопубликованные данные).
Как отмечалось выше, клоны HB101(pUPL32) и HB101(pUPL22) люминесцировали при росте клеток in vivo. Однако характер свечения этих клонов и клона HB101(pPL2) в зависимости от плотности культуры резко различался, а именно, значительно увеличивалась интенсивность свечения и практически исчезал эффект аутоиндукции при увеличении плотности культуры, обусловленный участием регуляторных генов, которые могут быть локализованы вне оперона биолюминесценции. Следовательно, транскрипция генов оперона в плазмидах pUPL32 и pUPL22 контролировалась lac-промотором. Дополнительным подтверждением этого вывода являлось изменение характера свечения клеток JM109(pUPL22) при индукции культуры IPTG. После добавления индуктора наблюдалось резкое увеличение интенсивности люминесценции клеток JM109(pUPL22), причем в полностью индуцированном состоянии (примерно через 1 ч после добавления IPTG) свечение этих клеток было выше, чем HB101(pUPL22). Этот эффект был обусловлен незначительной репрессией lac-прмотора в HB101(pUPL22), т.к. содержание lacI репрессора в клетках HB101 недостаточно для существенного снижения транскрипции с lac-промотора, находящегося в составе мультикопийной плазмиды.
Для проверки предположения, что SphI- SphI фрагмент ДНК P. leiognathi плазмиды pUPL22, включающий все функции, необходимые для люминесценции, не содержит собственного промотора, была сконструирована плазмида pBRPL-1, в которой промоторы вектора не контролируют транскрипцию фрагмента ДНК P. leiognathi (рис. 2). В качестве вектора использовали плазмиду pBR322. EcoRI-SphI фрагмент (560 п.о.) pBR322, несущий tet-промотор, был заменен на EcoRI-SphI участок полилинкера плазмиды pUC18. Затем по сайту SphI полученной плазмиды pBRP был встроен SphI- SphI фрагмент ДНК P. leiognathi плазмиды pUPL22. Клоны HB101(pBRPL-1) не люминесцировали in vivo, что свидетельствовало об отсутствии промотора в SphI- SphI фрагменте ДНК P. leiognathi.
Встраивание по сайтам полилинкера каких-либо промоторов приводило к появлению люминесценции в соответствующих рекомбинантных клонах при их выращивании in vivo. Так, по сайтам EcoRI и BamHI были встроены фрагменты ДНК, несущие промотор tac (EcoRI-BamHI фрагмент плазмиды pDR540) и промотор tet (EcoRI-BamHI фрагмент pBR322). Клетки HB101, трансформированные плазмидами pBRPLac и pBRPLet, люминесцировали in vivo, причем степень свечения зависела от силы встроенного промотора, и эти данные хорошо коррелировали с известными данными по силе встроенных промоторов. Добавление миристилового альдегида в культуральную среду не приводило к существенному росту биолюминесценции культур, из чего можно
Возможности проведения SOS lux теста в полуавтоматическом варианте в микропланшетах или использования иммобилизованных клеток в тест системе
В ходе данной работы впервые была сконструирована тест-система (SOS-lux test) оценки генотоксичности химических веществ и физических факторов (- и UV-излучение), основанная на биолюминесцентном определении уровня SOS-ответа клеток E. coli. Тест применен для оценки генотоксичности и общей токсичности ряда соединений платины, проявляющих противоопухолевую активность, в частности цис-ДДП и циклоплатама.
Следует отметить: i) дальнейшие исследования подтвердили, что cda промотор является наиболее удачным выбором в тест-системе для скрининга генотоксинов с точки зрения баланса силы промотора и эффективности связывания с LexA белком (Norman A. et al., 2005); ii) использование генетически модифицированных штаммов E. coli позволяет адаптировать тест для выполнения конкретных задач, что было продемонстрировано в рамках исследования соединений платины в настоящей работе, а также при изучении процессов мутагенеза клеток E.coli сразным репарационным статусом под действием -излучения и ускоренных тяжелых ионов (Комова ОВ, автореф. дисс., 2002, ОИЯИ, Дубна). Сконструированная тест-система нашла широкое применение при исследованиях общетоксических и мутантных свойств поллютантов (см. например, Масленникова (ИЭГМ, УроРАН), 2007, Кхатаб З.С. (Южный федеральный университет, г. Ростов-на-Дону), автореф. дисс., 2013; Е. П. Гуськов, и др., (НИИ биологии при ЮФУ, г. Ростов-на-Дону), 2009); при разработке следующего поколения биосенсоров для оценки генотоксичности (SOS-LUX-LAC-FLUORO test (Rabbow E. et al, 2003, Horneck G et al., 2010 (DLR, Institute of Aerospace Medicine, Cologne, Germany)). Данная часть работы защищена 2-я патентами в Германии, частично финансировалась в 1995-1997 г.г. грантами INTAS (93-2850) и COPERNICUS (CIPA CT-94 0122, European Commission).
Развитие технологий рекомбинантных ДНК в начале 1970-х годов (Cohen SN, et al., 1973) стимулировало работы по экспрессии гетерологичных генов в клетках прокариот. Первый фармацевтический рекомбинантный продукт – инсулин человека – был разрешен к применению в 1982 г., и к 2009 г. более чем 150 рекомбинантных белков были лицензированы US Food and Drug Administration (FDA) и European Medicines Agency (EMEA) к использованию в фармацевтике (Ferrer-Miralles N, et al., 2009). В первых работах гены целевых белков обычно клонировали и экспрессировали в составе экстрахромосомных самореплицирующих ДНК-элементов – плазмид, и до настоящего времени большинство рекомбинантных белков синтезируется с использованием плазмид-содержащих штаммов-продуцентов.
E. coli до сих пор остается одним из наиболее широко применяемых микроорганизмов при создании штаммов-продуцентов рекомбинантных белков вследствие: 1) хорошо изученной генетики бактерии, ее способности быстро расти на дешевых субстратах и наличия многих молекулярно-генетических методов ее модификации; 2). возможности получения «высоко-плотных» (high cell density cultivation) культур, что повышает выход рекомбинантных белков (Lee SY, 1996); 3) наличия широкого спектра генетически измененных штаммов E. coli (несущих делеции генов протеаз, recA мутации; штаммы с пониженной продукцией ацетата, экспрессирующие tRNA для редких кодонов и т.д.), что позволяет оптимизировать процесс с точки зрения метаболической инженерии (Waegeman H and Soetaert W., 2011). Тем не менее, экспрессии белков в E. coli присущи некоторые крупные недостатки, среди них – отсутствие системы гликозилирования и секреции в культуральную среду рекомбинантных белков, недостаточно эффективная система формирования дисульфидных связей в белках (Baneyx F.,1999;. Kamionka M., 2011). Во многих случаях рекомбинантные белки формируют тельца включения (inclusion bodies), последующий рефолдинг которых тоже может представлять собой технологическую проблему (Baneyx F, and Mujacic M., 2004).
Высокий уровень синтеза рекомбинантного белка может инициировать стрессовый ответ или синтез белков теплового шока и усиление протеолиза в клетках штамма (Gill RT et al., 2000; Hoffman F and Rinas U., 2004), что приводит к метаболическому «перегрузу» клеток и снижению скорости их роста (Bentley WE et al., 1990; Kurland CG., 1996).
В большинстве случаев требуется эмпирический подбор конкретных подходов для достижения высокоэффективной продукции рекомбинантных белков (Jana S. and Deb JK, 2005). Стратегия оптимизации продукции включает ряд аспектов, таких как: дизайн экспрессионных векторов, подбор дозы генов, силы промоторов (регуляция транскрипции), обеспечение стабильности mRNA, инициации и терминации трансляции (регуляция трансляции), оптимизация состава кодонов генов, выбор клеток для штамма-продуцента и подбор условий ферментации для регулирования и оптимизации уровня экспрессии белков в процессе культивирования.
Цитокины - это родовое название специализированных растворимых белков и пептидов, которые, действуя как гуморальные иммуномодуляторы на отдельные клетки или ткани, принимают участие в регуляции таких важных биологических процессов как гемопоэз, иммунный ответ, тканеспецифическая клеточная пролиферация, апоптоз. Их действие является антиген-неспецифическим, они способны воздействовать на любые клетки, содержащие соответствующие рецепторы и находящиеся в состоянии адекватной физиологической активности. К моменту начала работ по теме диссертации во многих научно-исследовательских центрах мира проводились интенсивные исследования по изучению возможности использования цитокинов для диагностики и лечения различного рода патологий иммунной системы (Kindler V. et al., 1986; Okabe M., et al., 1992; Егорова и др., 1998; Martino et al., 2000), вирусных инфекций (Tovey et al., 1999), а также в комплексной терапии широкого спектра онкологических заболеваний (Tagawa, 2000; Bukowski, 2001). Также было показано, что экспрессия в клетках E. coli генов цитокинов (например, интерферона -2 (Nagata et al., 1980; Goeddel et. al., 1981) или GM-CSF (Burgess et. al., 1987)) позволяет выделить из бактериальных клеток биологически активные рекомбинантные белки.
В процессе настоящей работы был получен ряд плазмид-содержащих штаммов-продуцентов E. coli, обеспечивающих продукцию некоторых цитокинов и факторов роста. Для этой цели были сконструированы различные варианты экспрессионных плазмид, обеспечивающих как цитоплазматическую локализацию целевых продуктов, так и, в случае hEGF, секрецию продукта (экскрецию) в культуральную среду.
Основные структурные характеристики полученных в работе плазмид и уровни продуктивности штаммов представлены в сводной таблице 7.
Как видно из таблицы, в работе было использовано большинство из имеющихся на время выполнения работы методов оптимизации транскрипции и трансляции гетерологичных генов в клетках E.coli. Так, в частности, транскрипция клонированных генов обеспечивалась с высокоэффективных прокариотических промоторов, узнаваемых как РНК полимеразой E.coli, так и РНК полимеразой фага Т7. Для оптимизации трансляции использованы как метод организации искусственных сайтов связывания рибосом (RBS) (в ряде случаев с предварительным компьютерным расчетом потенциальной вторичной структуры 5 -концевых участков соответствующих mRNA), так и конструирование генов “гибридных белков” и гибридных оперонов с частично перекрывающимися генами (“TGATG-оверлаппонов”). Повышение уровня продукции целевых белков достигалось также путем изменения копийности рекомбинантных плазмид.
Все это позволяло предполагать, что полученные рекомбинантные плазмиды позволят обеспечить высокоэффективную экспрессию клонированных генов цитокинов и факторов роста, а также накопление значительных количеств целевых белковых продуктов в ходе культивирования соответствующих бактериальных штаммов-продуцентов. Описанию исследований экспрессии полученных рекомбинантных плазмид посвящены следующие разделы данной главы.
Фактор роста кератиноцитов человека - hKGF
Экспрессионные кассеты с мутантными вариантами гена adhE были интегрированы в хромосому штамма-продуцента треонина MG1655tdh::rhtA(pVIC40) и полученные штаммы ферментировали в средах, содержащих этанол в качестве единственного источника углерода. Результаты продолжительной (72 час) ферментации штаммов на минимальной среде с 2% этанолом показали, что как рост культур, так и продукция треонина выше при наличии в хромосоме экспрессионной кассеты с мутантным геном аdhE-м2 (таблица 18). Можно полагать, что множественные мутации обеспечивают более высокую активность и/или стабильность белка AdhE в процессе ферментации.
Продолжительность ферментации является важным технологическим параметром. Поэтому для ускорения процесса синтеза треонина были проведены ферментации на средах, содержащих смеси глюкозы и этанола (таблица 19).
Как следует из данных таблицы 19, при ферментации на средах, содержащих смесь глюкозы и этанола в разном соотношении, штамм MG1655 tdh,rhtA ,PLtacadhE-m2 (pVIC40) не может использовать эффективно этанол как источник углерода (биомасса клеток и продукция Thr уменьшаются на среде глюкоза/этанол = 4%/1,5% по сравнению с контролем), а небольшое возрастание продукции при росте на среде глюкоза/этанол = 4%/0,5% связано, по-видимому, с компенсацией недостатка NADPH, возникающего при биосинтезе треонина в данном штамме, за счет утилизации части этанола.
Результаты легко объяснимы из общих соображений: штаммы-продуценты треонина нуждаются в восстановленных эквивалентах, необходимых для эффективного функционирования пути биосинтеза треонина, но в тоже время избыточный синтез AcCoA негативно сказывается как на росте клеток, так и на продукции треонина.
Следовательно, для эффективной утилизации этанола необходимо перераспределение и согласование потоков метаболитов, образующихся при утилизации двух субстратов, глюкозы и этанола, клетками E. coli.
Оптимальным, как будет показано ниже, является направление интермедиатов, образующихся из глюкозы в гликолитическом пути, в цикл трикарбоновых кислот через анаплеротический путь (посредством карбоксилирования фосфоенолпирувата ферментом Ppc). При этом возможна оптимизация соотношения оксалоацетата (ОАА), образующегося из глюкозы, и AcCoA - из этанола, на стадии синтеза цитрата в цикле трикарбоновых кислот. Такая возможность была нами показана на примере синтеза глутамата (Glu) штаммами MG1655tdh,rhtA,PLtacadhE-m2 и MG1655tdh,rhtA, pykF,PLtacadhE-m2 (таблица 20). Во первых, штамм MG1655tdh,rhtA,PLtacadhE-m2 способен синтезировать Glu при росте на среде, содержащей смесь: 2% глюкоза/1.3% этанол; но при этом количество образующейся клеточной биомассы резко снижается (более чем в два раза) по сравнению с ферментацией на среде с эквимолярным (по углероду) количеством глюкозы (таблица 20). При введении делеции по гену pykF (пируват киназа I) синтез пирувата из фосфоенолпирувата должен резко снижаться (т.к. PykF – основная пируват киназа в клетках E. coli) и, как следствие, поток метаболитов через анаплеротический Ppc-опосредованный путь должен возрастать и количество синтезируемого Glu увеличиваться. Приведенные в таблице 20 данные подтверждают это предположение: штамм MG1655tdh,rhtA, pykF,PLtacadhE-m2 синтезирует на 35% больше Glu, чем штамм MG1655tdh,rhtA,PLtac-adhE-m2 при ферментации на среде, содержащей смесь глюкоза/этанол.
При теоретическом рассмотрении возможности эффективного синтеза треонина с использованием смешанных сред становится ясной необходимость введения дополнительных, к описанным выше, модификаций метаболических потоков, а именно: 1) Общий путь биосинтеза треонина условно можно разделить на две части: от глюкозы до ОАА, или от этанола до ОАА, и, далее, от ОАА до треонина. 2) Потребление глюкозы может быть реализовано двумя путями: через PTS- систему (первый вариант) или non-PTS систему (второй вариант). Общее уравнение для синтеза OAA через PTS-зависимый путь усвоения глюкозы: Глюкоза +4NAD+ +ADP + 3/2H2O = 3/2OAA +4NADH +ATP (выход (г/г, %) = 110%) (A) Потребление глюкозы через non-PTS систему может быть достигнуто путем усиления экспрессии генов ферментов, обеспечивающих транспорт и ATP-зависимое фосфорилирование глюкозы, например, galP, xylE и glk; инактивацией PTS системы; инактивацией пируваткиназы(-з). В результате вся глюкоза теоретически может превратиться в OAA через анаплеротический путь (реакцию карбоксилирования фосфоенолпирувата ферментом Ppc). Суммарная реакция для синтеза OAA в этом случае: Глюкоза + 2 NAD+ + 2 CO2 = 2 OAA + 2 NADH
Следовательно, оптимальное соотношение OAA (из глюкозы) и AcCoA (из этанола) для удвоения OAA путем синтеза через глиоксилатный шунт – 1/2 (моль/моль). Таким образом, мы получаем следующее уравнение синтеза OAA при усвоении смеси глюкозы и этанола:
Глюкоза + 4 Этанол + 2 CO2+ 14 NAD++ 6 H2O = 4 OAA +14 NADH (выход 145%) (B) 3) Сравнение уравнений (A) и (B) ясно показывает: усиление PTS независимого транспорта глюкозы в штаммах-продуцентах, культивируемых на смеси глюкозы и этанола, и направление интермедиатов, образующихся из глюкозы, через анаплеротический путь в цикл трикарбоновых кислот, дает более высокий выход ОАА – предшественника многих L-аминокислот, таких как глутамат, пролин, треонин, лизин, аспартат, аспарагин, метионин, серин, валин, лейцин, изолейцин, цистеин, аргинин, и пиримидинов. Оптимальное молярное соотношение глюкозы и этанола для вышеупомянутого процесса - 1/4.
Теоретический выход Thr в данном процессе равен 131%, из чего можно заключить, что использование смеси глюкозы и этанола в качестве источников углерода в ферментационных средах может заметно увеличить выход целевого продукта (Thr) при использовании штаммов с метаболически модифицированными путями усвоения субстратов (рис. 29). Рис. 29. Метаболические пути усвоения источников углерода в продуценте треонина. (А) – при ферментации на глюкозе; (B) - при оптимизации путей совместного потребления глюкозы и этанола; (C) - при ферментации на этаноле.
Еще одна важная особенность заключается в том, что использование смеси глюкоза/этанол для продукции треонина приводит к фиксации 2-х молекул CO2 из окружающей среды на 4 молекулы синтезируемого треонина, т.е. процесс имеет экологические преимущества.
Одним из важнейших аспектов общей стратегии создания штаммов-продуцентов аминокислот и других биогенных молекул является модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов их биосинтеза. Частный случай аллостерической регуляции, ретроингибирование, является одним из основных способов контроля скорости биосинтеза аминокислот и других биогенных молекул. Очевидно, что для создания высокоэффективных
Модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина
Препарат очищенного белка ABALDH был экстрагирован из акриламидного геля и обработан трипсином. Масс-спектрометрический анализ полученной смеси пептидов проводили с использованием MALDIOF масс-спектрометра, набор полученных 19-и масс-пиков был подвергнут дальнейшему анализу и сравнению полученных последовательностей с последовательностями предполагаемых ABALDH с использованием базы данных MG1655 (рис 38). Было показано хорошее совпадение идентифицированных пептидов с последовательностью YdcW (SWISS-PROT Database, P77674) (score parameter 204). Таким образом, выделенный белок бал идентифицирован как YdcW. Этот результат был ожидаемым, т.к. YdcW имеет высокую степень гомологии с ABALDH человека и его ген локализован на 32,63 мин хромосомы E.coli. Ранее, Hisag-слитый белок YdcW был очищен и охарактеризован как альдегид дегидрогеназа со специфичностью к среднецепочечным альдегидам (Gruez A et al., 2004), причем фермент проявлял активность в форме тетрамера. Мы определили кинетические характеристики нативного YdcW в реакции окисления ABAL (таблица 32). Значения KM для ABAL, NAD+ and NADP+ составили 41±7, 54±10 и 484±2 M, соответственно. Эти значения сравнимы с приведенными ранее Prieto MI (Prieto MI et al., 1987), для ABALDH, выделенной из мутантных клеток E. coli K12. Из наших данных следует, что для белка YdcW каталитическая эффективность (kcat/KM) для NAD+ как субстрата более чем на порядок выше, чем для NADP+, что соответствует данным Gruez et al., что аффинность YdcW к NAD+ значительно выше, чем к NADP+. Определенное нами значение KM для субстрата ABAL для выделенного белка YdcW было значительно ниже значений KM для 14-и альдегидов, анализированных в работе Gruez et al. Более того, kcat/KM параметр для ABAL на два порядка выше аналогичного для бутиральдегида, который обеспечивал самую высокую каталитическую эффективность среди использованных Gruez et al. альдегидов. Суммируя эти данные мы можем утверждать, что -аминобутиратальдегид (ABAL) является природным субстратом для YdcW, и природная
Изучение индукции синтеза ABALDH клетками MG1655 показало, что процесс находится под контролем механизмов как катаболитной репрессии, так и азотной лимитации (таблица 30). Инактивация гена ydcW в хромосоме клеток MG1655 приводла к исчезновению ABALDH активности в клеточных экстрактах белка. При этом, в условиях азотного голодания, в культуральной среде клеток MG1655ydcW::kan накапливался ABAL (до 0,76 mM) (данные не показаны), хотя при аналогичных условиях культивирования в среде штамма MG1655 альдегид отсутствовал. Исходя из этих данных, мы можем полагать, что в клетках E. coli K12 белок YdcW является единственной ABAL дегидрогеназой.
Возможность конверсии путресцина в -аминобутират (GABA) при совместном действии путресцин аминотрансферазы и ABALDH была продемонстрирована в модельном эксперименте in vitro (рис 39). Эксперимент показал, что при инкубации смеси путресцина и -KG в присутствии NAD+, PLP и препаратов YgjG и YdcW белков имеет место накопление GABA через интермедиат ABAL.
Следовательно, в клетках E. coli K12 совместное действие YgjG и YdcW может быть существенным для поддержания внутриклеточного баланса путресцина in vivo. Идентифицированный нами путь деградации путресцина в GABA в базе данных EcoCyc получил наименование пути I деградации путресцина (pathway: putrescine degradation I). Позднее, еще один: путь II деградации путресцина в клетках E.coli (pathway: putrescine degradation II) был обнаружен Kurihara S, et al. , 2005.
HPLC-мониторинг компонентов реакции. (A) энзиматическая реакция образования ABAL и L-Glu: (1) начальная реакционная смесь, содержащая путресцин (Putr) и -KG; (2) реакционная смесь после инкубации с YgjG трансаминазой. (B) Энзиматическое окисление ABAL в GABA: (1) начальная реакционная смесь, содержащая ABAL и NAD+; (2) реакционная смесь после инкубации с YdcW дегидрогеназой. (C) Энзиматическая конверсия путресцина в GABA: (1) начальная реакционная смесь, содержащая путресцин, -KG и NAD+; (2) реакционная смесь после инкубации с YgjG и YdcW.
В данной части работы показаны возможности модификации метаболических путей штаммов E. coli сцелью повышения продуктивности аминокислот. Так, потребление глюкозы штаммами может быть усилено при использовании мутантных генов пермеазы PtsG или усиленной экспрессии пермеазы EIINag.
Возможность интенсивного усвоения глюкозы клетками E. coli посредством пермеазы EIINag была показана впервые.
Интеграция в хромосому клеток E. coli мутантных вариантов алкоголь дегидрогеназы-альдегид дегидрогеназы E. coli (AdhE), обеспечивает рост клеток на средах с этанолом в качестве единственного источника углерода в аэробных условиях культивирования.
Введение в хромосому штаммов-продуцентов (например, треонина или глутаминовой кислоты) мутантных генов adhE под контролем сильного промотора позволяет получить продукцию аминокислоты при росте клеток на средах с этанолом в качестве единственного источника углерода и на глюкоза/этанол - содержащих средах.
Теоретически показаны необходимые модификации путей усвоения источников углерода (усиление non-PTS транспорта глюкозы, введение делеций по генам пируват киназ, усиление экспрессии фосфоенолпируват карбоксилазы, экспрессия мутантной алкоголь дегидрогеназы-альдегид дегидрогеназы) для эффективной продукции аминокислот при использовании в ростовых средах смесей глюкоза/этанол (на примере штамма-продуцента треонина).
На примерах N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы E. coli, ключевых ферментов пути биосинтеза аргинина, показана возможность получения высокоактивных ферментов, не подверженных ретроингибированию, при случайном множественном мутагенезе коротких фрагментов их последовательностей. Экспрессия этих мутантных ферментов приводит к существенному увеличению продукции аминокислоты. Гены этих мутантных белков были использованы при конструировании высокопродуктивных промышленных штаммов-продуцентов.
