Содержание к диссертации
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Основные направления иммунопрофилактики инфекций. 20
1.2. Формирование новых направлений в иммунопрофилактике и диагностике инфекций в 70-х - 80-х годах 28
1.3. Современные направления в области вакцинологии 36
1.4. Молекулярные методы в диагностике инфекций 45
1.5. Структурные белки вируса осповакцииы, локализация кодирующих их генов в вирусном геноме 53
1.5.1. Структурные белки вируса осповакцины. 54
1.5.2. Картирование генов в геноме вируса осповакцины. 58
1.6. Общая характеристика стафилококковых токсинов 74
1.7. Структура и биологические свойства стафилококкового энтеротоксина типа А (СЭА). 84
1.8. Использование моноклональных антител в изучении функционально значимых участков стафилококковых токсинов и создании диагностических тест-систем. 90
1.9. Биология и эпидемиология микобактерий туберкулезного комплекса. 97
1.10. Применение методов молекулярной биологии к эпидемиологии туберкулеза 101
1.11. Современные способы обнаружения микобактерий. Недостатки и преимущества. 117
1.12. Эпидемиология клещевого боррелиоза т
1,13. Патогенез и клиника клещевого боррелиоза 120
1.14. Молекулярно-биологические характеристики спирохет В. burgdorferi sensu lato 122
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы, приборы, оборудование 148
2.1.1. Реактивы. 148
2.1.2. Приборы и оборудование 149
2.1.3. Ферменты 149
2.1.4. Использованные в работе штаммы микроорганизмов №
2.1.5. Векторные ДНК и рекомбинантные плазмиды, содержащие клонированные фрагменты ДНК 150
2.1.6. Животные ; 151
2.1.7. Клеточные линии 151
2.1.8. Сыворотки и антигены 151
2.1.9. Питательные и конденционированные среды 152
2.1.10. Буферные среды и системы 152
2.2. Молекулярно-биологические методы исследования 152 152
2.2.1. Методы работы с РНК 2.2.2. Методы выделения препаратов ДНК 155
2.2.3. Анализ и очистка ДНК методами гель-электрофореза 157
2.2.4. Амплификация ДНК и РНК в системе ПЦР или ОТ-ПЦР і 158
2.2.5. Секвенирование ДНК im
2.2.6. Филогенетический анализ геномных последовательностей 151
2.3. Иммунохимические методы исследовании 161
2.3.1. Иммунизация животных 162
2.3.2. Определение концентрации иммуноглобулинов 162
2.3.3. Получение IgG и IgM 162
2.3.4. Получение Fc-фрагментов IgG кролика 162
2.3.5. Приготовление СПА - сорбента 163
2.3.6. Иммуноферментный анализ 163
2.3.7. Радиоиммунный анализ (РИА) т
2.3.8. Иммунохимический анализ продуктов бесклеточной трансляции 165
2.3.9. Иммуноблоттинг 166
2.4. Методы гибридомной технологии т
2.4.1. Приготовление иммуногенных форм токсичных антигенов т
2.4.2. Иммунизация мышей для получения гибридом 167
2.4.3. Гибридизация клеток и клонирование гибридом №
2.4.4. Культивирование гибридом 168
2.4.5. Криоконсервация и размораживание клеток т
2.4.6. Выделение моноклональных антител (МКА) 168
2.4.7. Мечение МКА т
2.4.8. Определение изотипов тяжелых цепей МКА т
2.4.9. Определение константы связывания МКА с антигеном №
2.5. Генно-инженерные методы №
2.5.1. Методы работы с бактериями т
2.5.2. Ферментативная обработка препаратов ДНК №
2.5.3. Введение радиоактивной метки в ДНК №
2.5.4. Клонирование ДНК в составе бактериальных векторов т
2.5.5. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli 170
2.6. Методы работы с белками 170
2.6.1. Выделение рекомбинантных белков 170
2.6.2. Определение концентрации растворимого белка 170
2.6.3. Анализ белков методом электрофореза в ПААГ 171
2.7. Специальные методы анализа 171
2.7.1. Инфицирование культур клеток вирусами 171
2.7.2. Культивирование и очистка вируса осповакцины и эктромелии 172
2.7.3. Культивирование и рчистка вируса гриппа 172
2.7.4. Культивирование M.tuberculosis на твердой питательной среде 172
2.7.5. Фракционирование вирионных белков ВОВ и ВЭМ т
2.7.6. Препаративный электрофорез белков ВОВ 173
2.7.7. Дегликозилирование белков 174
2.7.8. Выделение моноцитов из крови человека и индукция синтеза интерлейкина 1 174
2.7.9. Биологическое тестирование интерлейкина 1 174
2.7.10. Контроль пролиферации спленоцитов 174
2.7.11. Приготовление комплекса СЭА-lgG 174
2.7.12. Обработка IgG лизоцимом 175
2.7.13. Обработка IgM КонА 175
2.7.14. Сбор клещей Ixodes persufcatus 175
2.7.15. Культивирование спирохет B.burgdorferi sensu lato 175
2.7.16. Генотипирование спирохет B.burgdorferi s.l. 175
2.7.17. Оценка иммуногенности препаратов индивидуальных белков ВОВ и их комплексов 175
2.7.18. Испытания прототипов вакцины на животных т
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Создание молекулярно-биологической базы для исследований структурно-функциональной организации патогенных вирусов. 178
3.1.1. Метод бесклеточных белок-синтезирующих систем. т
3.1.2. Метод синтеза кДНК в системе обратной транскрипции. 185
3.1.3. Выделение и анализ индивидуальных мРНК из клеток эукариот. 191
3.2. Исследование структурно-функциональной организации геномов вирусов гриппа и разработка прототипа противогриппозной молекулярной вакцины. 205
3.2.1. Получение образца субъединичной комбинированной противогриппозной вакцины. Анализ иммуногенной активности препарата. 210
3.2.2. Анализ первичной структуры гена гемагглютинина штамма А/Алма-Ата/1417/84. 214
3.3. Иммунохимическое изучение структурных белков вируса осповакцины и картирование генов белков р11 222 и р35
3.3.1. Иммунохимическое изучение структурных белков вируса осповакцины 223
3.3.2. Картирование гена белка р11 сердцевины ВОВ 253
3.3.3 Выделение специфической мРНК, кодирующей белок р35 оболочки ВОВ и картирование гена белка р35 261
3.4. Конструирование прототипа молекулярной противооспенной вакцины 270
3.4.1 Характеристика антигенных и протективных свойств комплексов белков вируса осповакцины, 273
3.4.2. Характеристика безвредности и реактогенности препаратов вакцины против оспы. 277
3.5. Изучение иммунологических свойств стафилококкового энтеротоксина А (СЭА) 281
3.6. Получение и анализ моноклональных антител (МКА) к стафилококковому энтеротоксину А (СЭА). Конструирование иммуноферментнои тест-системы на основе МКА. 289
3.7. Получение моноклональных антител к стафилококковому альфа-токсину (CAT) методом иммунизации in vitro. 297
3.7.1 Свойства моноклональных антител к CAT
3.7.2. Разработка иммуноферментного метода определения CAT в крови больных с септическим процессом. 3.8. Разработка метода обнаружения вирусов гепатита В и С в биосубстратах методом ПЦР 303
3.8.1. Выбор праймеров и определение чувствительности метода анализа 305
3.8.2. Испытание разработанного метода детекции вирусов гепатита В и С на клинических образцах
3.9. Разработка способа дифференциального выявления геномных ДНК M.tuberculosis и M.bovis 316
3.9.1. Разработка метода дифференциальной детекции микобактерий туберкулёзного комплекса на основе двухраундовой ПЦР. 325
3.9.2. Разработка способа дифференциального выявления ДНК M.tuberculosis и M.bovis на основе многоцикловой однораундовой ПЦР. 330
3.9.3. Испытание разработанного способа выявления ДНК на клинических образцах, содержащих лекарственно-устойчивых возбудителей туберкулёза 337
3.10. Разработка иммуноферментного способа диагностики иксодового клещевого боррелиоза, основанного на рекомбинантных антигенах 339
3.10.1. Определение зараженности клещей, собранных на территории Сибири 339
3.10.2. Конструирование рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих антигены OspC и фрагмент FlaB новосибирского изолята B.garinii NT29 342
3.10.3. Разработка прототипов иммуноферментных тест-систем для диагностики начальных стадий Лайм-боррелиоза 354
3.10.4. Оптимизация наработки и выделения рекомбинантных антигенов из штаммов-продуцентов E.coli 359
3.11. Получение рекомбинантных штаммов E.coli, продуцирующих стафилококковый а-токсин 361
3.11.1. Анализ экспрессии структурной области генов а-токсина в клетках E.coli 362
3.11.2. Конструирование серии векторов для экспрессии в клетках Е со// 364
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 370
ВЫВОДЫ 377
БИБЛИОГРАФИЯ 379
Введение к работе
В настоящее время известно более тысячи видов вирусов - представителей более 20 семейств, патогенных для человека (Смородинцев, 1984). Не менее многочисленна группа болезнетворных микроорганизмов: патогенных и условнопатогенных бактерий, риккетсий, простейших паразитов, общее число которых достигает 3 тысяч. Благодаря широкому внедрению в вирусологические и микробиологические исследования современных методов молекулярной биологии и генетической инженерии в последние два десятилетия открыты новые возбудители инфекций: вирусы гепатита С (Marwick, 1984; Choo et al., 1989), ВИЧ (Broder, Gallo, 1984; Klatzm ann et al., 1984; Montagnieretal., 1984; Ratner et al., 1985a), возбудитель болезни Лайма (Burgdorfer et at, 1982), вирус губчатой болезни коров и возбудитель вспыхнувшей в конце 2002 г. в КНР эпидемии тяжелой высококонтагиозной пневмонии (Ksiazek, et al., 2003 ).
Природное многообразие возбудителей инфекций требует наряду с проведением санитарно-гигиенических и противоэпидемических мер создания средств их специфической профилактики и диагностики. Значение иммунопрофилактики в снижении многих болезней и даже их искоренении (в случае натуральной оспы) общеизвестно. Ведущее место в борьбе с такими инфекциями как, полиомиелит, столбняк, корь, коклюш, дифтерия, туберкулёз и др. занимает вакцинация населения.
Все вакцины, независимо от способа их применения и назначения можно разделить на три больших класса: живые, инактивированные и искусственные (Воробьёв, 1980). В арсенале отечественной иммунопрофилактики фигурируют главным образом живые и инактивированные вакцины. Однако, значительный удельный вес живых вакцин (55%), являющихся наиболее эффективным видом защитных препаратов, порождает большую проблему безопасности вакцинаций (Воробьёв, 1975; Ляшенко, Воробьёв,1982). Одним из перспективных направлений решения этой проблемы является создание молекулярных и искусственных (рекомбинантных и синтетических) вакцин. Широкие возможности для конструирования таких вакцин открылись в последние 25 лет благодаря развитию методов молекулярной биологии и биохимии белка, прогрессу в области генной инженерии и биотехнологии (Мертвецов, Беклемишев, Савич, 1987).
Вполне понятно, что реализация этих подходов требует больших усилий исследователей различных специальностей: вирусологов, микробиологов, молекулярных биологов, генных инженеров, биотехнологов и химиков. Особую важность и значение эти исследования приобрели в последние 20 лет ввиду изменения эпидемической ситуации в мире. С одной стороны, наблюдается значительное снижение, либо стабилизация ряда особо опасных инфекций, а с другой - появление и распространение ранее неизвестных инфекций (вирусные иммунодефициты и гепатиты, Лайм-боррелиоз, атипичная пневмония и др.). Растёт и заболеваемость туберкулезом, гриппом, госпитальными инфекциями, на уровень эпидемий вышли ВИЧ-инфекции и заболевания вирусными гепатитами. Ряд ведущих специалистов опасается мировой пандемии преодолевающих межвидовой барьер высоковирулентных вирусов гриппа птиц (Chen et al., 2003; Okazaki etal., 2000). Одно из ведущих мест среди возбудителей внутрибольничных инфекций продолжает занимать стафилококковая инфекция (Васильева, 1991). Пищевые отравления, вызываемые стафилококковыми энтеротоксинами, составляют большую часть пищевых отравлений бактериальной этиологии (Reiser et at., 1988; Постовит, 1987). Имевшие совсем недавно в США случаи заболеваний людей, вызванных вирусом оспы обезьян, свидетельствуют об определённой вероятности выхода из природы на «эпидемическую орбиту» высоковирулентных и контагиозных для человека мутант-ных вариантов покс-вирусов. Всё это с особой остротой ставит вопрос о необходимости разработки безопасных вакцин, высокоспецифичных и чувствительных диагностических тест-систем.
В диссертации представлены результаты многолетних исследований, направленных на создание нового поколения вакцин и диагностических препаратов с использованием методов молекулярной биологии, иммунологии, вирусологии и генетической инженерии. Выбор объектов исследований и основные задачи определялись как потребностью здравоохранения, так и специальными Государственными заказами. Работа выполнялась последовательно на базе НПО «Вектор» {п.Кольцове НСО), Института молекулярной биологии и биохимии АН Каз ССР им. М.А. Айтхожина (г. Алма-Ата), НИБХ СО РАН (г.Новосибирск) и ГУ НИИ биохимии СО РАМН (г.Новосибирск).
Актуальность темы. Достижения в 80-х годах в области использования вируса осповакцины (ВОВ) в качестве эукариотического экспрессирующего вектора значительно стимулировали всестороннее исследование самого вируса осповакцины. Во-первых, представлял интерес поиск в геноме ВОВ мест, подходящих для встройки чужеродной генетической информации с целью создания поливалентных вакцин. Во-вторых, возник и вопрос о безопасности создаваемых рекомбинантных штаммов ВОВ. Никто не мог гарантировать, что при встройке чужеродной ДНК не появятся варианты высокопатогенного для человека рекомбинанта ВОВ. В третьих, не менее важной проблемой являлось установление роли собственных антигенов ортопоксвирусов в индукции иммунитета. В то время сведения такого рода были весьма ограничены. Всё это вместе взятое сдерживало практическое использование уже полученных рекомбинантных штаммов. Назрела острая необходимость выяснения роли отдельных структурных белков ВОВ в индукции иммунитета, установления их локализации в геноме и создания безопасной противооспен-ной вакцины.
По статистическим данным во время пандемии 1918-1919 гг погибло более 40 миллионов людей, а заболеваемость гриппом составила 500 млн человек. Смертность во время пандемий 1957 (вирус гриппа А подтипа H2N2) и 1968 (H3N2) г.г. была около 6 миллионов. Всё это обусловило повышенный интерес к возбудителю этого заболевания, как в научном плане, так и в плане создания эффективных противогриппозных вакцин нового поколения, которые могли бы прийти на смену живым и инактивированным цельновирионным.
Актуальными были и остаются и проблемы диагностики опасных для человека инфекций таких как вирусные гепатиты В и С, туберкулёз, клещевой иксодовый боррелиоз, госпитальные инфекции, а также пищевые токсикоин-фекции.
Цель исследования: разработать молекулярно-биологические основы для создания прототипов противооспеннои и противогриппозной субъединичных вакцин, специфичных и чувствительных методов экспресс-диагностики вирусных гепатитов В и С, туберкулёза, клещевого иксодового боррелиоза, стафилококкового сепсиса. Задачи исследования:
1. Создать методическую базу для конструирования молекулярных вакцин и диагностикумов, включающую применение и совершенствование мо-лекулярно-биологических и генно-инженерных методов, конструирование специальных векторов для экспрессии генов в клетках E.coli.
2. Исследовать физико-химические, антигенные и иммуногенные (протек-тивные) свойства белков вирусов гриппа и осповакцины и разработать эффективные способы их выделения и очистки.
3. Картировать на геноме отдельные гены, кодирующие иммуногенные белки вирусов осповакцины.
4. Сконструировать на основе очищенных протективных антигенов прототипы молекулярных вакцин для специфической профилактики инфекций, вызываемых вирусами гриппа и натуральной оспы.
5. Получить рекомбинантные формы стафилококкового а-токсина для создания на его основе иммуноферментной тест-системы для диагностики стафилококковых сепсисов, а также, в перспективе, иммунизирующих препаратов для получения противостафилококковой гипериммунной донорской лечебной плазмы.
6. Исследовать иммунобиологические свойства стафилококкового энтеро-токсина А, получить моноклональные антитела к нему и сконструировать на их основе прототип высокоспецифичной иммуноферментной тест-системы. 7. Сконструировать прототип иммуноферментной тест-системы для диагностики иксодового клещевого боррелиоза на основе рекомбинантных антигенов возбудителя.
8. Разработать высокоспецифичные и чувствительные способы обнаружения возбудителей туберкулёза, гепатитов В и С и иксодового клещевого боррелиоза в биосубстратах на основе использования методов полиме-разной цепной реакции и обратной транскрипции.
Научная новизна работы.
1. Установлены первичные структуры З -концевой области генома вируса энцефаломиокардита мышей, полноразмерных ДНК-копий мРНК проопио-меланокортина человека, быка и крысы, а также фрагментов генома трёх штаммов вируса гриппа. Выявлено, что гемагглютинин одного из штаммов (А/Алма-Ата/1417/84) имеет 96,12% гомологии с гемагглютинином возбудителя пандемии гриппа 1918-1919.
2. Показано, что белки оболочки вириона ВОВ р12, р19, р20, р35 и р42 являются ранне-поздними, поскольку их синтез в инфицированных клетках наблюдается в условиях ингибирования репликации вирусной ДНК.
3. Установлено, что белок оболочки вируса осповакцины р20 является ди-мером белка р12, а предшественником гликопротеина р35 оболочки вириона является полипептид с молекулярной массой 27 кДа. Предшественники белков оболочки ВОВ р12 и р42, а также белка сердцевины р11 не отличаются по электрофоретической подвижности от зрелых белков вириона.
4. Методом гибридизационной селекции мРНК на фрагментах геномной ДНК ВОВ с последующим иммунохимическим анализом продуктов ее бесклеточной трансляции показано, что расположенный на стыке Hindlll Е- и F-фрагментов ген кодирует сердцевинный поздний белок р11,
6. Впервые проведено иммуноаффинное выделение специфической мРНК, кодирующей белок р35 оболочки вириона ВОВ. Показано, что кДНК, синте 15 зированная на мРНК специфически гибридизуется с геном 26К из левого Hindlll A-SalGI-фрагмента вирусной ДНК.
7. Обнаружен новый вид функциональной активности стафилококкового энтеротоксина А, характеризующийся способностью этого токсина индуцировать в условиях in vitro продукцию ИЛ-1 моноцитами периферической крови человека. Токсин проявляет выраженную ИЛ-1-индуцирующую активность в диапазоне концентраций от 100 пг/мл до 100 нг/мл.
8. Впервые обнаружено свойство стафилококкового энтеротоксина А неспецифически связываться с Fc-фрагментом иммуноглобулинов различных животных и определена локализация на нём участка связывания Fc-фрагмента. Эффективность связывания токсина с lgM намного ниже, чем с IgG.
9. Впервые при использовании метода иммунизации in vitro получены гибридомы, секретирующие моноклональные антитела lgM-класса против стафилококкового а-токсина.
10. В начале желтушного периода у больных вирусным гепатитом В с большим постоянством, наряду с HBs- и НВе-антигенами, в слюне выявляется и ДНК HBV; в период ранней реконвалесценции у 59,4% больных вирусным гепатитом В в слюне продолжает выявляться НВеАд при отрицательных результатах индикации ДНК HBV, обусловленных, по-видимому, ее низкой концентрацией в исследуемом биосубстрате. Эти данные свидетельствуют в пользу возможной длительной персистенции вируса в слюнных железах и потенциальной эпидемической значимости реконвалесцен-тов, как источников естественной передачи инфекции для контактирующих с ними лиц.
11. Иксодовые клещи Ixodes persulcatus, распространенные на территории Алтая, Новосибирской и Томской областей, заражены только двумя генови-дами Borrelia burgdorferi s.i: B.garinii и B.afzelii; уровень зараженности клещей спирохетами, определявшийся в период с 1999 по 2003 г.г., колебался в пределах 10-40% в зависимости от года наблюдения и ареала распространения,
12, Определены нуклеотидные последовательности кодирующих областей генов ospC и ftaB десяти сибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.l. и методами компьютерного анализа выявлены потенциальные антигенные детерминанты соответствующих белков.
13. На основе сравнения первичных структур липопротеидов OspC, выведенных из нуклеотидных последовательностей соответствующих генов, установлены филогенетические связи сибирских изолятов боррелий с другими представителями этого вида спирохет.
Практическая значимость работы:
1. Разработан оригинальный и простой способ разделения белков оболочки и
сердцевины вируса гриппа, а также щадящий метод разделения гемагг-лютинина и нейраминидазы, который может быть использован как в научных исследованиях, так и в конструировании молекулярных противогриппозных вакцин.
2. Получен образец комбинированной молекулярной вакцины против двух се ротипов вируса гриппа (H1N1 и H3N2), обладающий выраженной протективной активностью, который после проведения полных доклинических и клинических испытаний может быть использован для иммунопрофилактики гриппа.
3. Разработан новый эффективный способ получения моноспецифических ан тисывороток, включающий в себя как модифицированный метод препаративного электрофореза белков, так и особую схему иммунизации животных. Разработанная технология может быть использована в научных исследованиях. Получена коллекция специфических антисывороток ко всем мажорным белкам оболочки вириона, а также к некоторым белкам его сердцевины.
4. Прототип противооспенной вакцины, сконструированной на основе белков оболочки вируса осповакцины, по данным доклинических испытаний может применяться в качестве превакцины.
5. Иммуноферментная тест-система для определения стафилококкового энтеротоксина А может использоваться в пищевой промышленности, санитарно-эпидемиологической службе и клинике токсикоинфекций.
6. Разработан высокочувствительный и специфичный метод дифференциального выявления микобактерии туберкулезного комплекса, исключающий получение ложноположительных результатов анализа у недавно вакцинированных BCG людей и животных. Метод может быть применен в практическом здравоохранении для быстрой диагностики туберкулеза и контроля над эффективностью противотуберкулёзной терапии.
7. Разработан прототип иммуноферментной тест-системы для выявления начальных стадий заболевания иксодовым клещевым боррелиозом, который может быть использован в практическом здравоохранении.
8. Разработаны способы выявления геномных нуклеиновых кислот возбудителей гепатитов В, С и иксодового клещевого боррелиоза, которые могут быть использованы в эпидемиологических и диагностических исследованиях.
9. Предложен оптимальный метод выделения ДНК микобактерии, являющийся быстрым, простым в исполнении и обеспечивающим наибольший выход ДНК. Метод может быть использован в эпидемиологических исследованиях и в ДНК-диагностике туберкулёза.
10. На основе исходной плазмиды plL-2/21 (SU1761805 А1) сконструирована серия экспрессирующих векторов, обеспечивающих эффективную индуцируемую экспрессию встраиваемых генов под контролем регуляторной области гена гее A Proteus mirabilis.
11. Разработана технология получения рекомбинантных белков в клетках E.coli с использованием сконструированных в данной работе векторов. 12. Получены рекомбинантные штаммы E.coli, обеспечивающие сверхсинтез стафилококкового а-токсина. Рекомбинантныи токсин можно использовать как для разработки ингибиторнои иммуноферментнои тест-системы диагностики стафилококковых сепсисов, так и для получения иммунизирующего препарата в производстве лечебной противостафилококковой гипериммунной сыворотки.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработанный и усовершенствованный комплекс молекулярно-биологических и иммунохимических методов, обеспечивает решение задач, связанных с конструированием молекулярных вакцин, созданием диагностических тест-систем, исследованием первичных структур РНК- и ДНК-содержащих геномов возбудителей инфекций и картированием генов специфических антигенов.
2. Прототипы молекулярных вакцин (противооспенной и противогриппозной), обеспечивают индукцию защитного иммунного ответа у вакцинируемых животных.
3. Белки оболочки вириона ВОВ р12, р19, р20, р35 и р42 являются ранне поздними, причём белок р20 является димером белка р12, а предшественником гликопротеина р35 оболочки вириона является полипептид с мол. массой 27 кДа,
4. Ген, кодирующий сердцевинный белок вириона р11 локализован на стыке Hindlll Е- и F-фрагментов геномной ДНК.
5. Разработана высокоспецифичная иммуноферментная тест-система определения стафилококкового энтеротоксина А в пищевых продуктах.
6. Разработанные методы выявления геномных нуклеиновых кислот возбудителей туберкулёза, гепатитов В, С и иксодового клещевого боррелио-за, характеризуются высокой чувствительностью, специфичностью и простотой исполнения.
7. Слюнные железы больных вирусным гепатитом В, как в начале желтуш ного периода, так и в стадии реконвалесценции, могут служить местом персистенции вируса, а сами больные могут являться потенциальными источниками естественной передачи инфекции для контактирующих с ними лиц
8. Способ иммуноферментного выявления в крови пациентов антител к двум антигенам (OspC и FlaB) Borrelia garinii NT 29 позволяет диагностировать начальные стадии заболевания иксодовым клещевым боррелио-зом
9. Спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi s.l., циркулирующие в популя циях иксодовых клещей Ixodes persulcatus, распространенных на территории Сибири, представлены только двумя геновидами: Borrelia garinii и Borrelia afzelii,- и составляют отдельную группу, родственную изолятам боррелий, выделенных в Японии и Корее. Заражённость взрослых клещей колеблется в пределах 10-40% в зависимости от года наблюдения и ареала распространения.
