Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Характеристика свойств четыреххлористого углерода, влияние на обменные процессы в организме. Биологические модели, используемые для изучения острой печеночной недостаточности 11
1.2. Биохимические критерии и лабораторная диагностика функций печени при её патологии 13
1.3. Лекарственная коррекция нарушенных функций печени 20
1.4. Получение, характеристика и биологические свойства липосом, осуществляющих направленный транспорт лекарственных средств 21
ГЛАВА 2. Постановка эксперимента и методы исследования 32
2.1. Постановка эксперимента 32
2.2. Методы исследования 33
2.2.1. Биохимические методы исследования 33
2.2.1.1. Определение продуктов перекисного окисления липидов 33
2.2.1.2. Определение суммарной пероксидазной активности 34
2.2.1.3. Определение активности каталазы 35
2.2.1.4. Определение содержания глюкозы 36
2.2.1.5. Определение содержания общего белка 36
2.2.1.6. Определение содержания мочевины 37
2.2.1 .7. Определение тимоловой пробы 38
2.2.1.8. Определение уровня общего холестерина 39
2.2.1.9. Определение уровня триглицеридов 40
2.2.1.10. Определение общего билирубина 40
2.2.1.11. Определение активности аминотрансфераз 41
2.2.1.12. Определение активности щелочной фосфатазы 42
2.2.2. Цитоэнзимохимические методы исследования 43
2.2.2.1. Определение активности миелопероксидазы 43
2.2.2.2. Определение активности кислой фосфатазы 44
2.2.3. Гистоморфологическое исследование 45
2.2.4. Получение фосфолипидов из головного мозга 45
2.2.5. Тонкослойная хроматография 47
2.2.6. Получение липосом методом «выпаривания и обращения фаз» и включения в них лекарственных средств методом «замораживания-оттаивания" 47
2.2.7. Подготовка липосомальных препаратов для электронно-микроскопического исследования 49
2.3. Статистическая обработка результатов исследования 51
ГЛАВА 3. Результаты исследования 53
3.1. Биохимические и цитохимические показатели сыворотки крови лабораторных животных при формировании острой печеночной недостаточности, вызванной введением четыреххлористого углерода , 53
3.2. Фармакологическая коррекция острой печеночной недостаточности 62
3.2.1. Биохимические критерии лабораторной диагностики в оценке эффективности использования интактных лекарственных препаратов 66
3.2.2. Коррекция экспериментальной острой печеночной недостаточности с помощью липосомальных лекарственных препаратов 74
3.3. Гистологические критерии в оценке степени тяжести экспериментальной
острой печеночной недостаточности и эффективности её лечения 88
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 96
Выводы 120
Список литературы 122
- Характеристика свойств четыреххлористого углерода, влияние на обменные процессы в организме. Биологические модели, используемые для изучения острой печеночной недостаточности
- Постановка эксперимента
- Определение тимоловой пробы
- Биохимические и цитохимические показатели сыворотки крови лабораторных животных при формировании острой печеночной недостаточности, вызванной введением четыреххлористого углерода
Введение к работе
Нарушение обменных процессов в печени наблюдается при различных заболеваниях. Так, вследствие патологических процессов может развиваться острая печеночная недостаточность в результате массивного некроза печеночных клеток, вызванного различными причинами и проявляющаяся внезапным тяжелым нарушением функции печени. Одной из этих причин является отравление гепатотропными ядами, в частности ССЦ.
В связи с особенностями молекулярных механизмов действия CCU на субклеточные мембраны гепатоцитов (микросомальная активация, перекисное окисление липидов как механизм нарушения каталитических свойств мембра-носвязанных ферментов) изучение биологического действия гепатотропного яда представляет интерес как модель молекулярной патологии мембранных структур (Губский, 1989). Вследствие этого, детальное изучение молекулярных основ химического поражения гепатоцитов приобрело общебиологическое и медицинское значение.
Развитие симптомов острой печеночной недостаточности (ОПН)) обусловлено дистрофией и распространенным некрозом гепатоцитов, а также массивным развитием портокавальных анастомозов, через которые значительная часть крови из воротной вены поступает в полые вены и затем в артериальное русло, минуя печень, что ещё более снижает её участие в дезинтоксикации вредных веществ и нарушает участие в различных видах обмена — углеводном, белковом, липидном и других. При ОПН наблюдается так же недостаток антиокси-дантов, защищающих клетки от свободно-радикального окисления (Подымова, 1993).
Для коррекции обменных процессов при этом используют различные лекарственные препараты, способствующие стабилизации клеточных мембран, снижению процессов перекисного окисления липидов и нормализации всех видов обменных процессов.
В ряде случаях эффективность использования данных лекарственных средств оказывается низкой из-за их неспособности эффективно преодолевать анатомические и клеточные барьеры организма, токсичности некоторых препаратов, кратковременного пребывания в организме вследствии быстрой утилизации и выведения.
В настоящее время возрос интерес к разработке получения различных ли-посомальных форм препаратов, обусловленный значительным расширением использования липосом во многих областях медицинской науки и практики.
В последнее время появляются сообщения о широком применении липосом в качестве транспортеров лекарственных препаратов (Dijrstra et al., 1998; Севастьянов, 1999; Абрамов и др., 2001, Хворостов, 2001). Используя липосо-мальные формы лекарственных препаратов, иммобилизованных во внутренний объем или мембрану липидных везикул, удается преодолеть недостатки их ин-тактных форм. Широкие возможности применения липосом в терапии различных заболеваний обусловлено совокупностью их биологических свойств: химической инертностью, биосовместимостью, биодеградируемостью, практически отсутствием токсических и антигенных свойств. Липосомы обладают возможностью направлять заключенные в них вещества в определенные органы и ткани организма, что позволяет заметно снижать дозу препарата, сохраняя эффективность биологического действия. Кроме этого, липидные везикулы способны предохранять заключенные в них вещества от действия ряда факторов, обеспечивая пролонгированный эффект фиксированных в них лекарственных препаратов.
Однако в литературе практически отсутствуют данные об изучении влияния липосомальных лекарственных препаратов, введенных разными путями, на биохимические и цитоэнзимохимические процессы организма при ОПН. С этой целью предполагается комплексно исследовать биохимические показатели углеводного, белкового, липидного обменов, показателей перекисного окисления липидов, а также ферментативной активности в сыворотке крови эксперимен-
7 тальных животных (белых мышей) с ОПН, вызванной введением им четырех-хлористого углерода.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Целью настоящей работы явилось конструирование липосомальных лекарственных препаратов и исследование их метаболических эффектов в регуляции гомеостаза у животных при острой печеночной недостаточности, вызванной отравлением четыреххлористым углеродом.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Сконструировать липосомальный лекарственный препарат, последовательно используя методы «обращения фаз» и «замораживания - оттаивания» с включением гидрофобных лекарственных средств в наружную мембрану липидных везикул, а гидрофильных - в их внутренний объем, и оценить его биологическую эффективность.
Изучить влияние интактных и липосомальных лекарственных средств на интенсивность перекисного окисления липидов по уровню малонового диальдегида, активность каталазы и суммарной пероксидазной активности в сыворотке крови белых мышей при интоксикации четыреххлористым углеродом.
Исследовать влияние интактных и липосомальных лекарственных средств на отдельные стороны углеводного обмена.
Изучить влияние интактных и липосомальных лекарственных средств на отдельные стороны белкового обмена по содержанию общего белка, мочевины и уровню тимоловой пробы.
Определить состояние липидного и пигментного обменов после введения экспериментальным животным четыреххлористого углерода и лечения интактными и липосомальными лекарственными препаратами по уровню общего холестерина, триацилглицеридов и общего билирубина.
Изучить функциональное состояние печени при лечении животных ин-тактными и липосомальными лекарственными средствами после введения четыреххлористого углерода по активности аланинаминотрансфера-зы, аспартатаминотрансферазы, гаммаглутамилтрансферазы в сыворотке крови, миелопероксидазы и кислой фосфатазы в нейтрофилах крови.
Исследовать гистологические изменения в печени, почках и селезенке у животных после введения им четыреххлористого углерода и лечения этих животных.
Сравнить действие интактных и липосомальных лекарственных форм при разных способах их введения по эффективности коррекции биохимических, цитохимических показателей и гистологических изменениях в органах у животных с острой печеночной недостаточностью.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ
Впервые создана новая липосомальная форма лекарственного препарата с иммобилизацией водорастворимых лекарственных средств во внутренний объем липидных везикул (аскорбиновой кислоты, АТФ, селенита натрия, эссен-циале), а жирорастворимых (а-токоферола) - в мембрану липосом.
Основываясь на анализе различных биохимических, цитохимических и морфологических показателей у экспериментальных животных с острой печеночной недостаточностью, доказаны преимущества использованных липосомальных форм лекарственных препаратов над их интактными формами.
Липосомальные лекарственные средства оказывают более выраженное восстановление свободнорадикальных процессов, белкового, липидного и пигментного обменов, функционального состояния печени. Эффективность терапии этими препаратами подтверждается тенденцией к нормализации показателей активности миелопероксидазы и кислой фосфатазы в нейтрофилах крови.
9 Установлено, что пероральное введение липосомальных лекарственных препаратов животным с экспериментальной острой печеночной недостаточностью обеспечивает у них более быструю коррекцию гомеостаза.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
Изготовленный стабильный, комплексный липосомальный лекарственный препарат, обладающий пролонгированным действием, является более высокоэффективным, по сравнению с интактными лекарственными средствами, при лечении острой печеночной недостаточности у экспериментальных животных, вызванной четыреххлористым углеродом.
При введении экспериментальным животным четыреххлористого углерода выявлены у них нарушения органоспецифических обменных процессов и баланса про- и антиоксидантных систем.
Интактные и в более выраженной степени липосомальные лекарственные препараты, вводимые экспериментальным животным с острой печеночной недостаточностью, нормализуют биохимические и цитоэнзимохими-ческие показатели, функциональную активность печени.
Лечение острой печеночной недостаточности у экспериментальных животных комплексным липосомальным лекарственным препаратом, введенным перорально, оказалось более эффективным, по сравнению с липосомальным лекарственным препаратом, введенным внутрибрюшинно.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Результаты исследования расширяют существующие представления об использовании липосомальных лекарственных препаратов при лечении экспериментальной острой печеночной недостаточности и подтверждают их более высокую эффективность перед интактными лекарственными формами. В данной работе представлены новые данные о получении, оценке действия липосомаль-
10 ных лекарственных препаратов при различных путях введения при лечении острой печеночной недостаточности, вызванной введением экспериментальным животным четыреххлористого углерода. Критериями оценки эффективности действия липосомальных лекарственных препаратов служили многочисленные биохимические показатели крови экспериментальных животных, а также ряд цитохимических и морфологических показателей при лечении острой печеночной недостаточности, что открывает новые перспективы их практического применения в медицине.
Разработана методическая рекомендация: «Оценка эффективности лечебного действия липосомальных и интактных лекарственных препаратов у экспериментальных животных, подвергшихся воздействию токсинов различной природы», утвержденная ректором Ставропольской Государственной Медицинской Академии на основании решения Ученого совета академии (протокол от 30.03.2005, №3).
Получен патент на изобретение: «Способ оценки эффективности дезинток-сикационной терапии при воздействии токсинов различной природы» (№2334989 от 27.09.2008 г.).
Материалы работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий в Ставропольской государственной медицинской академии в курсе биологической, общей и биоорганической химии, а также при чтении базовой дисциплины «Биологической и медицинской химии» на кафедре ГОУ ВПО Ставропольского государственного университета Федерального агентства по образованию, о чем свидетельствуют акты с внедрения полученных результатов исследования.
Характеристика свойств четыреххлористого углерода, влияние на обменные процессы в организме. Биологические модели, используемые для изучения острой печеночной недостаточности
Одним из наиболее хорошо изученных гепатотропных ядов является четы-реххлористый углерод - тяжелая бесцветная летучая жидкость, специфического запаха, плохо растворимая в воде, но смешивающаяся с большинством растворителей. Антропогенными источниками поступления его в окружающую среду являются изготовление, транспортировка, хранение. В атмосферу ССЦ поступает в составе промышленных выбросов предприятий, производящих растворители, пестициды и т.д. В питьевой воде образуется совместно с другими галоге-нопроизводными метана при хлорировании (Новиков, 1984). В медицинской практике применяется как антигельминтный препарат для лечения анкилосто-мидоза. Отравление экспериментальных животных ССІ4 по биохимическим изменениям и морфологической характеристике близко к острым поражениям печени различной этиологии у человека. В связи с особенностями молекулярных механизмов действия ССЦ на субклеточные мембраны гепатоцитов (микросо-мальная активация, перекисное окисление липидов (ПОЛ) как механизм нарушения каталитических свойств мембраносвязанных ферментов) изучение биологического действия его представляет интерес как модель молекулярной патологии мембранных структур (Губский, 1989). Вследствие этого детальное изучение молекулярных основ химического поражения гепатоцитов приобрело общебиологическое и медицинское значение.
Гепатотоксический эффект ССІ4 обусловлен аутокаталитическим переокислением микросомальных липидов, возникающих вследствие воздействия свободных радикалов, образуемых при метаболизме этого соединения в эндо-плазматическом ретикулуме печени (ССЦ— СО+3 + СГ) под влиянием микросомальных ферментов, в том числе цитохрома Р-450. Процесс переокисления липидов ведет к распаду внутриклеточных мембран микросом, митохондрий и лизосом, высвобождению активных ферментов, денатурации белков с последующей гибелью клетки (Голиков, 1986; Лужников, 1989).
Свободный радикал непосредственно повреждает ферментативные системы, а также оказывает прооксидантное действие, инициируя цепную реакцию ПОЛ, что приводит к структурной и функциональной перестройке биологических мембран, повышению их проницаемости для ионов ЕҐ, Na+, Са2+, К+ с последующим пространственным разобщением окислительных цепей (Швайкова, 1975). При остром отравлении СС14 быстро развивается печеночная недостаточность (Арчаков, 1989).
В целях диагностики заболеваний, моделирования различных физиологических и патологических состояний, изучения лечебно-профилактических препаратов, химических и физических факторов используют лабораторных животных, к которым относятся животные различных систематических групп, однако, чаще всего используют позвоночных животных (Ремезов, 1960).
Интерес исследователей к белым мышам обусловлен в основном тем, что многие из них имеют малые размеры тела, высокую плодовитость и короткий период жизни; за несколько месяцев жизни белых мышей можно проследить в организме процессы, которые у человека протекают годами (Западнюк и др., 1983). Одна из первых моделей ОПН создана в 1931 году Манном с сотрудниками, которые получали её у мышей, воздействуя на них СС14. На этой модели проводилось изучение регенераторных способностей разросшейся в печени соединительной ткани и обратимости процесса (Саркисов, 1960). В настоящее время в целях создания моделей ОПН у мелких лабораторных животных (мышей, крыс) большинство исследователей применяют отравление их различными химическими веществами. Наиболее часто используют СС14. Препарат вводят внутрижелудочно, подкожно, внутримышечно или внутрибрюшинно. Стабильные результаты получены при внутрижелудочном введении (Саркисов, 1960). Характер поражения печени в этом случае зависит от количества и концентрации вводимого ССІ4 (Болотова и др., 1972). Отравление 80% масляным раство 13 ром СС14 в дозе 0,2 мл на 100 г массы животного вызывало отложение жира в печени без выраженных изменений её паренхимы. При использовании 100% раствора ССЦ в дозе 0,5 мл на 100 г массы животного появлялись некрозы ткани печени.
Существует много схем моделирования ОПН. Для этой цели одни авторы (Блюгер, 1964, Бурчинский и др., 1978) применяли 80-100% раствор СС14, другие (Бруслик и др., 1979) - 40-50% масляный раствор СС14, вводя его внутри-брюшинно однократно (Калимурзина, 1972).
Основные требования, которые должны предъявляться экспериментаторам при выборе модели для ОПН, могут быть сформулированы в виде 5 основных условий (Фабер и др., 1982): обратимость процесса, его воспроизводимость, гибель животного собственно от печеночной недостаточности, достаточно крупные размеры животного, избранного в качестве модели с достаточным объемом циркулирующей крови, минимальная опасность печеночного яда для персонала лабораторий.
Постановка эксперимента
Животных получали из питомника ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора. Эксперимент проводили в течение 30 суток на 500 белых беспородных мышах обоего пола весом 18-20г с соблюдением правил, предусмотренных Европейской комиссией по надзору за проведением лабораторных и других опытов с участием экспериментальных животных разных видов. Мыши находились в стандартных условиях с естественной сменой освещения и соблюдением общевиварийного рациона. У всех животных был свободный доступ к пище и воде (Западнюк и др., 1983; Шалимов и др., 1984). Для моделирования ОПН всем животным, кроме контрольных (20 мышей), вводили внутрибрюшинно однократно четыреххлористый углерод в дозе 0,2 мл 50% масляного раствора (0,25 ЛД5о). Контрольной группе животных не вво- і дили лекарственные средства. Лечение экспериментальных животных проводили по следующей схеме: интактной группе (120 мышей) не вводили лекарственные препараты, другой группе (120 мышей) проводили лечение интактны-ми препаратами (разовые дозы рассчитывали в соответствии с фармакопейными данными из расчета на массу тела животного) — аскорбиновая кислота (2,0 мг), АТФ (1,0 мг), а-токоферол (0,5 мкг), селенит натрия (0,00017 мг), эссен-циале (2,5 мг), которые инъецировали однократно внутрибрюшинно ежедневно в течение 6 дней, начиная через сутки после введения токсина, другим двум группам животных (240 мышей) вводили липосомальные лекарственные средства однократно внутрибрюшинно и перорально на 2, 5, 8, 11, 14, 17 сутки в тех же дозах, что и интактные препараты.
Животных декапитировали и определяли на 3, 10, 20 и 30 сутки в сыворотке крови следующие биохимические показатели: содержание глюкозы, общего белка, мочевины, тимоловой пробы, ХС, билирубина, ТАГ, МДА, актив 33 ности АлАТ, ЩФ, АсАТ, ГТТ, каталазы, СПА, а также регистрировали изменение цитоэнзимохимических показателей нейтрофилов крови: МПО и КФ. Лекарственные средства. Аскорбиновая кислота - в ампулах 5% раствор, АТФ - в ампулах 1% рас- твор, а-токоферол - масляный раствор во флаконах, селенит натрия — порошок во флаконах, эссенциале - в ампулах по 5 мл отечественного производства (производитель НПО «Биомед»). Содержание МДА в сыворотке крови определяли по методу Гаврилова (1987). Метод основан на том, что при нагревании в кислой среде часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу эндоперекисей, разлагается с образованием МДА, связывание молекулы которого с двумя молекулами тиобарбитуровай кислоты приводит к формированию окрашенного комплекса. Смесь инкубировали 45 минут на кипящей водяной бане и охлаждали до комнатной температуры. Окрашенный продукт экстрагировали в 5 мл н-бутанола. В бутанольной фазе регистрировали оптическое поглощение при Д Д - 535 нм.
Для повышения точности измерения для продуктов ТБК — реакции принято учитывать вклад не только специфического поглощения, который оценивают по величине оптической плотности в области коротковолновой и длинноволновой границы поглощения ТБК - МДА - комплекса (АД 535-510 и АД 535-580), но и также степень мутности для водных проб и их бутанольных экстрактов (АД-620), так как бутанольная экстракция приводит к многократному снижению мутности образцов. Другой показатель - АД 535-510 чаще всего бывает чуть выше или ниже нуля и может не учитываться.
Значительно лучше использовать показатель АД 535-580, он минимально искажает истинное поглощение определенных продуктов (превышает его на 20-30%). Численное значение коэффициента в уравнении регрессии справедливо только для конкретных условий проведения ТБК — реакции, при соблюдении всех концентрации и объемов вводимых реагентов. Содержание МДА выражали в мкмоль/л. Определение суммарной пероксидазной активности (СПА) Суммарную пероксидазную активность (СПА) в плазме крови определяли по методу Покровского (1977). В основе метода лежит реакция окисления бен-зидина перекисью водорода с образованием окрашенных продуктов, катализируемая белками, обладающими пероксидазной активностью.
Пробы для определения СПА содержали 4 мл ацетатного буфера рН 4,6; 2 мл 0,1% раствора бензилхлорида, приготовленного на ацетатном буфере рН 4,6; 2 мл 0,3% раствора перекиси водорода и 0,04 мл сыворотки крови. Содержимое проб перемешивали и колориметрировали при длине волны 600 нм на спектро 35 фотометре Beckman DU-7 (США). Величину оптической плотности определяли в течение 3-4 минут до стабилизации голубой окраски. Результат выражали в единицах оптической плотности на 1 мл сыворотки крови. Определение активности каталазы
Количественное определение активности каталазы проводили по методу СИ. Крайнева (1974). Об активности каталазы можно судить либо по количеству перекиси водорода, разложившейся под влиянием этого фермента, либо по количеству выделившегося при этом кислорода. 1. Приготовление суспензии эритроцитов. Отмеряли в пробирку 5 мл 0,85% раствора хлористого натрия и добавляли 0,1 мл крови, полученную суспензию тщательно перемешивали; 2. Отмеривали в 2 пробирки по 5 мл 10% раствора серной кислоты; 3. В 2 тигля добавляли по 2 мл 0,5м раствора Н2Ог; 4. Отмеривали в 2 стакана по 6 мл 0,85% раствора хлористого натрия и по 2 мл заранее приготовленной суспензии эритроцитов; 5. С помощью пинцета помещали на дно каждого стакана тигель с перекисью водорода; 6. В первый стакан /контроль/ вливали из пробирки 5 мл 10% серной кислоты и перемешивали содержимое (при этом каталаза инактивируется); 7. Во второй стакан /опыт/ опрокидывали тигель, при этом каталаза эритроцитов начинается разлагать перекись водорода. Перемешивание содержимого второго стакана продолжали в течение 30 секунд, после чего вливали в него 5 мл 10% раствора серной кислоты из пробирки для остановки реакции. Избыток перекиси водорода в обоих стаканах /контроль и опыт/ титровали ОД н раствором перманганата калия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.
Определение тимоловой пробы
Тимоловую пробу определяли по методу Маклагана в модификации Хуэр-го и Поппера, в описании B.C. Камышниковой (2003), с использованием стандартного набора реагентов «Био-Лахема-Тест» (Чехословакия). В зависимости от количества и взаимного соотношения отдельных белковых фракций при реакции осаждения тимоловым реактивом возникает помутнение, интенсивность которого измеряют на ФЭК при длине волны (620-660) нм в кювете с толщиной слоя 1см. 1. Концентрированный раствор тимола - (17 мл) буфер ТРИС 11 ммоль/л, малеиновая кислота 3,36 ммоль/л, тимол 6,66 ммоль/л 2. Калибровочный раствор 1 - (11 мл) серная кислота 2,5 моль/л 3. Калибровочный раствор 2 - (5 мл) барий хлористый 48 ммоль/л Состав реакционной смеси: Буфер ТРИС, рН 7,55 - 0,160 ммоль/л Тимол - 0,098 ммоль/л Соотношение сыворотки и реакционной смеси -1/61 Раствор 1. В мерную колбу вместимостью 1000 мл наливали 900 мл дистиллированной воды и при постоянном перемешивании магнитной мешалкой пипеткой постепенно добавляли 15,0 мл Реактива 1. Раствор доводили дистиллированной водой до метки и перемешивали 10 минут. Раствор 2. В мерную колбу вместимостью 250 мл пипеткой помещали 10 мл Реактива 2, доливали охлажденной дистиллированной водой до метки и перемешивали. Раствор 3. В мерную колбу вместимостью 50 мл пипеткой помещали 1,5 мл реактива 3 и доливали до метки раствором 2, охлажденным точно до +10 С. Содержимое колбы тщательно перемешивали. В одной пробирке смешивали 3,0 мл раствора 1 и 0,05 мл сыворотки (проба). Во второй пробирке (контрольный раствор 1) смешивали 0,05 мл физиологического раствора и 3,0 мл раствора 2 после чего смесь перемешивали и оставляли стоять точно 30 минут. Потом снова перемешивали и измеряли оптическую плотность пробы против контрольного раствора 1. Расчет содержания и соотношения отдельных белковых фракций осуществляли по калибровочной кривой, которую строили следующим образом: из раствора 2 и 3 разбавлением готовили растворы с помутнением, соответствующим (5-20) единицам помутнения. Через 30 минут содержимое пробирок тщательно перемешивали и измеряли оптическую плотность против дистиллированной воды. Содержание тимоловой пробы измеряли в единицах. 2.2.1.8. Определение содержания общего холестерина Уровень холестерина определяли унифицированным методом Илька, в описании В.Н. Ореховича (1977), с использованием стандартного набора реагентов «Био-Лахема-Тест» (Чехословакия). Холестерин и его эфиры дают цветное окрашивание при обработке смесью уксусного ангидрида, серной и уксусной кислот. К 2,1 мл кислотной смеси медленно по стенкам добавляли 0,1 мл сыворотки, перемешивали и ставили на 20 минут в термостат при 37. Затем фотомет-рировали в кювете с длинной оптического пути 0,5 см против кислотного реактива при длине волны 625 нм. Расчет концентрации холестерина проводили по калибровочной кривой. Результаты выражали в ммоль/л. 2.2.1.9. Определение количества триглицеридов Уровень триглицеридов определяли спектрофотометрическим методом, с использованием стандартного набора реагентов «Био-Лахема-Тест» (Чехословакия). Освобожденный в результате щелочного гидролиза глицерин окисляли до формальдегида с помощью метаперйодата натрия. Образовавшийся при этом формальдегид соединяется с ацетилацетоном и дает интенсивную окраску, которая пропорциональна содержанию триглицеридов в сыворотке крови. В опытной пробе к 0,5 мл сыворотки крови добавляли 2 мл рабочего раствора, включающего гептан, изопропиловый спирт и раствор серной кислоты (в одинаковых соотношениях). Содержимое пробирки перемешивали и центрифугировали 10 минут. К 0,4 мл верхнего слоя жидкости приливали 2 мл изопропи-лового спирта и одну каплю раствора едкого калия, перемешивали и нагревали на водяной бане 10 минут при 70 С. После охлаждения добавляли по 0,2 мл перйодатного и 1 мл ацетилацетонового реактивов. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Измеряли оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм при длине волны 540 нм. Единица измерения ТАГ - г/л.. Определение содержания общего билирубина Содержание общего билирубина определяли по методу Ендрассика-Клеггорна-Грофа, в описании B.C. Камышниковой (2003), с использованием стандартного набора реагентов «Диахем-Абрес» (г. Санкт-Петербург). Билирубин вступает в реакцию азосочетания с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием раствора азокрасителя, который фотометрируют. Определение общего билирубина проводили в растворе акцелератора. 1. Сульфаниловая кислота (60 мл): сульфаниловая кислота 30 ммоль/л; хлористоводородная кислота 0,15 моль/л 2. Буферный раствор (120 мл)6 натрий-калий виннокислый 0,93 моль/л; натрия гидроокись 1,9 моль/л 3. Акцелератор (120 мл)6 раствор кофеина в натрии бензойнокислом, 4. Натрий азотистокислый (10 мл) 0,025 моль/л В опытной пробе к 0,2 мл сыворотки крови добавляли 1 мл Реактива 3, 1 каплю Реактива 4 и 0,2 мл Реактива 1. В контрольный раствор 1 добавляли 0,2 мл физиологического раствора, 1 мл Реактива 3, 1 каплю Реактива 4 и 0,2 мл Реактива 1. В контрольный раствор 2 вносили 0,2 мл сыворотки крови, 1 мл Реактива 3 и 0,2 мл Реактива 1. Все пробирки перемешивали и в течение (10-15 минут) добавляли в них по одному мл Реактива 2. Перемешивание осуществляли в течение 60 минут, затем измеряли оптическую плотность пробы (АО и контрольного раствора 2 (А2) против контрольного раствора 1. Расчет содержание билирубина в пробе осуществляли по калибровочным графикам. Для расчета брали разность оптических плотностей пробы и контрольного раствора 2 (Аі — Аг).
Биохимические и цитохимические показатели сыворотки крови лабораторных животных при формировании острой печеночной недостаточности, вызванной введением четыреххлористого углерода
Интенсивность процессов свободнорадикального окисления зависит от состояния антиоксидантных систем, которая может быть изменена в результате действия различных веществ, в том числе и ССІ4- Продукты расщепления CCLj - свободные радикалы (ССЦ— СС1+з + СГ), которые непосредственно действуют на функциональные группы микросомных ферментов и ускоряют перекис-ное окисление липидов в мембранах (Владимиров и др., 1972; Алматов, 1989). Образующиеся при этом перекиси вызывают необратимые изменения в клетках печени (Мелихов, 1990). Обезвреживание перекиси водорода осуществляется с помощью гемсодержащих ферментов - каталазы и пероксидазы.
В данной работе были проведены исследования этих показателей, а также осуществлялась коррекция их изменений интактными и липосомальными лекарственными препаратами, обладающими антиоксидантными свойствами (Мазутов и др., 1979). У животных после введения ССЦ на 3 сутки наблюдалось повышение содержания МДА до 6,60 ± 0,43 мкмоль/л (р 0,05). К 10, 20, 30 суткам отмечалось снижение величин исследуемого показателя до 5,80 ± 0,19; 5,30 ± 0,20 и 5,10 ± 0,44 мкмоль/л (р 0,05), соответственно, что к концу эксперимента превышало значение нормы на 41,7%. Активность каталазы снизилась до 9,00 ± 0,83 ммоль/мл/ мин (р 0,05) на 3 сутки, на 10 и 20 сутки показатель стал повышаться до 9,80 ± 0,92 ммоль/мл/мин и 11,30 ± 2,81 ммоль/мл/мин (р 0,05), соответственно. К концу эксперимента активность каталазы повысилась до 12,60 ± 0,77 ммоль/мл/мин (р 0,05), но осталась ниже нормы на 47,5%. В начале эксперимента у лабораторных животных отмечалось повышение СПА до 0,55 ± 0,04 ед. опт.пл/мл (р 0,05). На 10-20 сутки уровень СПА увеличился до 1,00 ± 0,038 ед. опт плот/мл и 1,375 ± 0,092 ед. опт плот/мл, соответственно. К концу эксперимента (на 30 сутки) содержание уровня СПА снизилось до 1,00 ± 0,082 ед. опт плот/мл (р 0,05), но превышало норму в 8 раз (табл. 1).
Увеличение МДА в сыворотке крови может быть обусловлено тем, что в эритроцитах процессы протекают более специфично, по сравнению с другими тканями в связи с большей скоростью обновления этих клеток, а также за счет активации пентозофосфатного пути окисления глюкозы. При интоксикации СС14 наблюдалась низкая активность каталазы, так как она начинает активно разрушать возрастающие концентрации перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. Одним из показателей, отражающих функциональное состояние клеток крови, является СПА. СПА включает в себя внеэритроцитар-ный гемоглобин и миелопероксидазу нейтрофилов, которые высвобождаются при повреждении мембран эритроцитов и нейтрофилов крови. Воздействие ССЦ приводило к достоверному увеличению СПА, что свидетельствует о нарушении структуры и проницаемости мембран эритроцитов у экспериментальных животных в результате активизации свободнорадикальных процессов.
Исследуемый показатель Контрольное значение показателя Сроки наблюдения (сутки) 10 20 30 В ответ на введение ССЦ у белых мышей изменялись показатели белкового обмена следующим образом: на 3 сутки в сыворотке крови наблюдалось резкое снижение содержания общего белка до 20,00 ± 3,1 г/л, на 10 сутки содержание общего белка практически не изменилось, а на 20 сутки содержание общего белка увеличилось до 31,00 ± 2,9 г/л, по сравнению с 3 сутками. К концу эксперимента (на 30 сутки) уровень общего белка составлял - 45,00 ± 3,0 г/л, но оставался ниже нормы на 54,1%. Содержание мочевины на 3 сутки снизилось до 1,20 ± 0,27 ммоль/л, на 10-20 сутки шло увеличение этого показателя до 1,80 ± 0,16 ммоль/л, 2,70 ±0,19 мл/л, соответственно (р 0,05), по сравнению с началом опыта. К концу эксперимента содержание мочевины увеличилось до 3,90 ± 0,17 ммоль/л (р 0,05), что ниже нормы на 58,1% (р 0,05). На 3 сутки происходило повышение величины тимоловой пробы до 10,00 ± 0,74 ед., на 10-20 сутки наблюдалось её снижение до 7,00 ± 0,67 ед., 6,00 ± 0,69 ед., соответственно (р 0,05), по сравнению с 3 сутками. К концу эксперимента уровень тимоловой пробы снизился до 5,00 ± 0,41 ед., превышая норму на 150% (табл. 2).
Таким образом, при ОПН происходит прогрессирующее снижение количества общего белка в сосудистом русле, очевидно связанным с изменением процессов ресинтеза протеинов. Наблюдаемое снижение уровня мочевины в крови при тяжелых поражениях печени и повышение показателей тимоловой пробы является доказательством поражения печени ССЦ. Таблица 2. Изменение биохимических показателей белкового обмена в сыворотке крови белых мышей при острой печеночной недостаточности, в ответ на введение четыреххлористого углерода. Исследуемый показатель Контрольное значение показателя Сроки наблюдения (сутки) 10 20 30 На третьи сутки после введения белым мышам ССІ4 изменялись показатели липидного обмена в сравнении с контрольной группой. В сыворотке крови животных экспериментальной группы отмечалось понижение уровня ХС до 1,20 ± 0,19 ммоль/л (р 0,05), На 10-20 сутки наблюдалось незначительное повышение уровня ХС до 1,40 ± 0,43 ммоль/л и 1,60 ± 0,41 ммоль/л по сравнению с началом эксперимента, соответственно. На 30 сутки уровень ХС повысился до 1,90 ± 0,34 ммоль/л (р 0,05), его содержание оставалось ниже нормы на 40,6%. В начале эксперимента наблюдалось повышение уровня ТАГ до 3,30 ± 0,31 г/л (р 0,05). На 10-20 сутки наблюдалось его незначительное снижение до 3,00 ± 0,31 г/л и 2,60 ± 0,22 г/л, по сравнению с 3 сутками, соответственно. К концу эксперимента уровень ТАГ достоверно снизился до 2,10 ± 0,21 г/л, но этот показатель превышал норму на 75%. В начале опыта уровень общего билирубина достоверно повышался до 22,20 ±1,5 мкмоль/л (р 0,05). На 10-20 сутки наблюдалось незначительное снижение уровня общего билирубина до 19,60 ±1,6 мкмоль/л и 17,80 ± 1,9 мкмоль/л в сравнении с началом эксперимента, соответственно. На 30 сутки уровень общего билирубина уменьшился до 16,40 ±1,4 мкмоль/л (р 0,05), что превысило норму на 51,2%.
Определяемое при ОПН, вызванной ССЦ, уменьшение уровня ХС связано, видимо, с нарушением гидролитической, всасывательной и моторно-эвакуаторной функций кишечника. В тоже время, в этих же условиях увеличение уровня ТАГ можно объяснить тем, что при отравлении СС14 интенсивность анаэробного гликолиза, а следовательно, и содержание фосфодиоксиацетона — источника синтеза ТАГ в печени — повышено. Повышено и содержание в сыворотке крови количество общего билирубина, что очевидно связано с тем, что вследствие холестаза, нарушено поступление желчи в двенадцатиперстную кишку (табл. 3).
