Введение к работе
Актуальность проблемы. Контроль за обеспеченностью населения витаминами и уточнение рекомендуемых норм потребления этих незаменимых пищевых веществ является одной из важнейших задач современной медицинской биохимии, решение которой может быть достигнуто на основе биохимических исследований обмена витаминов, их метаболической роли и взаимодействия в процессах осуществления обмена веществ.
В настоящее время для оценки обеспеченности организма витаминами группы В используют такие биохимические показатели, как концентрация этих витаминов и их коферментных форм в плазме крови и эритроцитах, экскреция с мочой, активность витаминзависимых ферментов эритроцитов, а также степень их активации добавленными in vitro кофер-ментными формами соответствующих витаминов. Однако единого мнения о критериях нормальной обеспеченности организма рибофлавином (Bates С,1993; Ross N.S.,1992) и витамином Bg (Driskell J.А., 1994) до сих пор не существует. Продолжает дискутироваться вопрос о том, как показатели крови и мочи коррелируют между собой (Ajayi о.А. е.а., 1983; Belko к. е.а.,1983) и какому из них отдать предпочтение. Не всегда обнаруживается соответствие между показателями обеспеченности и уровнями потребления витаминов с рационом (Horwltt М.К.,1984,1986; Bates С.J.,1987; Chen H.Y.,1992). Определенный вклад в такое несоответствие может вносить использование неспецифических, морально устаревших и недостаточно надежных методов изучения обмена витаминов.
Успехи биохимии витаминов, углубление знаний об их обмене и метаболической роли открывают возможности к решению этой проблемы на новом уровне. В частности, развитие ВЭЖХ позволило селективно определять витамеры в микроколичествах крови (Lambert W., 1985; Ubbink J.В., 1985,1987; BottlcherB., Bottlcher D.,1987; Lopes-Anaya A., 1987; Speek A.J.,1989; Pingoli A.,1995). Особого внимания заслуживает аффинный метод определения рибофлавина в моче (Tillotson J., Ваз-hor М., 1980,1986) с помощью РбСБ из белка куриного яйца, принцип которого основан на способности этого апобелка с высоким сродством (К =1,5 нМ) избирательно (К. комплексов РбСБ с ФМН и ФАД на 3-4 порядка ниже, чем с рибофлавином) связывать рибофлавин в эквимолярном соотношении и полностью тушить его флуоресценцию (Becvar J., Palmer
Принятые сокращения: АсАТ - аспартатаминотрансфераза; ВЭЖХ - высо-кооффективная жидкостная хроматография; ГР - глутатионредуктаза; ИЗСД - инсулинзависимый сахарный диабет; I-MHA - І-метшіникотинамид; НАД(Ф) - никотинамидадениндинуклеотид(фосфат) окисленный; ПАЛ(Ф) -пиридоксаль(фосфат); ПФО - пиридоксамин (пиридоксин)-фосфатоксидаза; 4-ПК - 4-пирвдоксиловая кислота; РбСБ - рибофлавинсвязывающий белок; ФАД - флавинадениндинуклеотид; ФМН - флавинмононуклеотид.
2 G.,1982). В связи с этим представлялось целесообразным на основе использования РбСБ разработать метод определения рибофлавина в плазме крови. Внедрение доступного и надежного способа оценки рибофлавино-вого статуса организма имело бн исключительно важное значение в виду особой функциональной роли витамина В2 в метаболизме других витаминов группы В (Bender D.А., 1986; Shlbata К.,1990; Hercberg S., 1994).
Так, в метаболизме витамина Bg функционируют два витамин В2-зависимых фермента: ФМН-зависимая ПФО, катализирующая превращение пиридоксамин (пиридоксин)-б-фосфата в ІШІФ, и ФАД-содержащая альде-гидоксидаза, окисляющая ПАЛ до 4-ПК, экскретируемой с мочой (Букин Ю.В., 1975; Clements J.E., Anderson В.В., 1980; Donald E.S., 1986; Ebadi М., 1986; Adelekan et al., 1987).
В эндогенном биосинтезе никотинамидных коферментов из триптофана также принимают участие витамин В2- и В6-зависимые ферменты: ФАД-зависимая кинуренин-3-монооксигеназа и ПАЛФ-зависимая кинурениназа, лимитирующие скорость окислительного метаболизма триптофана (Charconnet-Harding ., 1953; Mason M.t 1953; Ефремов В.В., 1956; Horwltt М.К., 1956; Tryflates G.P., 1986; Bender D.A., 1986). Большая часть освобожденного в ходе катаболизма НАД и НАДФ никотинамида метилируется и выводится с мочой в виде I-MHA.
Алиментарный дефицит рибофлавина у крыс приводит к снижению на 50-85% активности ПФО во всех органах и эритроцитах (Rasmussen К.М., е.а., 1979; Sauberllch Н.Е., 1980). Активность ПФО эритроцитов и степень ее активации In vitro ФМН (ФМН-эффект) предложено использовать в качестве показателя рибофлавинового статуса (Rasmussen К.М., е.а., 1979). Недостаточность витамина В2, приводящая к снижению активности ФМН- и ФАД-зависимых ферментов, может существенным образом сказываться на обмене витамина Bg и ниацина и сопровождаться изменением концентрации этих витаминов и их коферментных форм в крови и тканях, а также экскреции их метаболитов с мочой. Данные о влиянии недостаточности рибофлавина на показатели обеспеченности организма витамином Bg и ниацином немногочисленны и противоречивы. Отмечается как уменьшение, так и возрастание концентрации ПАЛФ в печени (Chat-terjee А.К., Ghosh В.В., 1966). У людей с дефицитом витамина Во об-наружены более низкая скорость превращения пиридоксина в ІШІФ и сниженный уровень ПАЛФ в крови по сравнению с людьми, обеспеченными этим витамином (Anderson В.В. е.а., 1976; Lakshml A.V., Валізі M.S., 1974-1976). Появились сообщения об уменьшении экскреции 4-ПК при недостаточности рибофлавина (Kant А.,1988). Имеются сведения об уменьшении экскреции I-MHA при дефиците витаминов В2 (Horwltt М.К., е.а.,
1956) и Bg (Shlbata К.,1990). Все это послужило основанием для некоторых авторов ввести понятие так называемого вторичного эндогенного или сопутствующего дефицита функционально связанных витаминов группы В (Борец В.М. с соавт.,1988; Островский Ю.М.,1987; Sauberllch Н.Е., 1980). Однако на практике при использовании концентрации ПАЛФ и НАД+ НАДФ в крови и экскреции 4-ПК и I-MHA с мочой в качестве биохимических показателей, отражающих обеспеченность организма пиридоксином и ниацшюм, обеспеченность витамином В2 во внимание не принимается.
В связи с этим, представляло интерес выяснить степень влияния различной обеспеченности организма витамином Вп на метаболизм витамина Bg и ниацина, а также на параметры, используемые в качестве показателей обеспеченности этими витаминами, что имело бы как теоретическое, так и практическое значение.
Несомненным преимуществом методов оценки витаминной обеспеченности организма, основанных на определении величины суточной или часовой экскреции данного витамина или его метаболита с мочой, является их неинвазивность. Однако использование этих методов ограничивается отсутствием соответствующих критериев нормальной обеспеченности для детей различного возраста. Применение величин, принятых для взрослых, недопустимо в связи с существенными возрастными отличиями в потребностях, уровне потребления и степени утилизации витаминов у детей и взрослых. Сведения о суточной экскреции витаминов у детей различных возрастов носят фрагментарный характер (Ritchey S.W., 1966; Pearson W.N., 1966,1967; Пятницкая И.Н., Богданов Н.Г., 1985; Хмелевский Ю.В., Усатенко O.K., 1987), о нормах часовой экскреции имеются единичные данные (De Lange D., 1964; Смирнов М.И., 1966, Нийт М.И., 1974). В связи с этим установление возрастных величин экскреции, характеризующих нормальную обеспеченность организма витаминами, представлялось весьма актуальной задачей.
Многие заболевания сопровождаются нарушениями некоторых метаболических функций организма, в том числе обмена витаминов (Подорожный П.Г., Березин П.К., 1972; Мойсеенок А.Г., 1974; Борец В.М., 1988; Спиричев В.Б., Рымаренко Т.В., 1990; Rogers К., 1994). Установлено, что при ИЗСД у крыс повышается экскреция рибофлавина с мочой (Reddy A.S. е.а., 1990). Это обстоятельство, наряду с употреблением низкокалорийного рациона, который не всегда обеспечивает достаточное поступление витаминов с пищей (Srldhar G., 1994), может быть причиной повышенной частоты полигиповитаминозных состояний среди больных ИЗСД по сравнению со здоровыми (Подорожный П.Г. с соавт., 1977; Зелинский Б.А. с соавт., 1981; Чобитько И.Г., 1984; Straub R., 1993). Посколь-
4 ку дефицит витаминов может осложнять течение болезни и затруднять лечение, возникает необходимость контроля за витаминной обеспеченностью. Вместе с тем критерии оценки витаминного статуса больных ИЗСД и другими заболеваниями отсутствуют, а для оценки обеспеченности необоснованно используют критерии, принятые для здоровых людей. Подтверждение возможности их использования, а в случае необходимости установление особых критериев для разных категорий больных является одной из важных проблем клинической биохимии.
Все вышеперечисленное свидетельствует о том, что назрела необходимость разработки новых, специфичных и селективных методов оценки витаминной обеспеченности, внедрения методического подхода для изучения обмена этих нутриентов, позволяющего учесть межвитаминные взаимодействия, и на их основе уточнения или установления биохимических критериев адекватной обеспеченности организма витаминами.
Исследования проводились в соответствии с планами НИР Института питания РАМН по темам 042: Разработка унифицированной системы критериев и методов оценки витаминной обеспеченности человека для диагностики гиповитаминозных состояний и нарушений витаминного обмена (1988-92); 083: Зависимость показателей витаминного статуса от обеспеченности рибофлавином и разработка возрастных показателей обеспеченности витаминами группы В в норме и при различных заболеваниях (1993-95).
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении роли рибофлавина в обмене витаминов группы В в норме и при некоторых заболеваниях; установлении критериев адекватной обеспеченности витаминами группы В организма здоровых и больных взрослых и детей разного возраста с учетом межвитаминных взаимодействий на основе разработки новых и усовершенствования существующих методов определения витаминов и их метаболитов в крови и моче.
В соответствии с этим предполагалось решить следующие задачи:
-
Разработать высокочувствительный, специфический и точный метод определения рибофлавина в плазме крови, органах и тканях животных с использованием РбСБ, выделенного из белка куриного яйца. Провести сопоставление этого метода с методом ВЭЖХ.
-
Исследовать в эксперименте на животных зависимость между содержанием рибофлавина в крови, его экскрецией с мочой и поступлением с рационом, а также степенью насыщенности организма этим витамином. На основании анализа кривых, отражающих взаимосвязь между этими показателями, установить концентрацию рибофлавина в плазме крови, соответствующую адекватной обеспеченности витамином В9 и оценить ее
5 соответствие другим критериям оценки рибофлавинового статуса организма человека.
-
Провести сравнительный анализ методов оценки обеспеченности организма витамином Bg и ниацином.
-
На клиническом материале и в экспериментах на крысах исследовать влияние алиментарной недостаточности рибофлавина на обмен витамина В6 и ниацина и оценить возможность применения показателей, использующихся для оценки обеспеченности этими витаминами, в условиях дефицита витамина В,.
-
Разработать критерии нормальной обеспеченности витаминами группы В взрослых и детей дошкольного и школьного возраста.
-
Охарактеризовать и выявить особенности обмена витаминов группы В и установить биохимические критерии обеспеченности ими организма при инсулинзависимом и инсулиннезависимом сахарном диабете, ишомической болезни сердца, гипертонической болезни и язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Концентрация рибофлавина в плазме крови, определенная с помощь»! разработанного метода титрования апоРбСБ, является надежным показателем, отражающим обеспеченность организма витамином В2.
-
Недостаточность витамина Во влияет на показатели обеспеченности организма витамином Bg и ниацином, сопровождаясь уменьшением экскреции метаболитов этих витаминов до уровня, сопоставимого с таковым при алиментарном дефиците витамина Bg и ниацина.
-
Предложен оригинальный методический подход к исследованию обмена водорастворимых витаминов, позволяющий характеризовать особенности метаболизма при заболеваниях и устанавливать критерии достаточной обеспеченности организма витаминами.
-
Критерии адекватной обеспеченности витаминами группы В при некоторых заболеваниях могут отличаться от критериев для здоровых людей
Научная новизна работы. Разработан новый метод быстрого опреде-лония рибофлавина в плазме крови и тканях, в основе которого лежит образование биоспецифичного аффинного комплекса с апоРбСБ, сопоставимый по специфичности и чувствительности с методом ВЭЗКХ, но более простой и производительный.
Проведено систематическое изучение влияния степени обеспеченности организма животных и людей рибофлавином на показатели пирвдокси-ноііого и ниацинового статуса. Установлено, что недостаточность витамина В,, нарушая обмен витамина Bg и ниацина, существенно изменяет показатели, используемые для оценки обеспеченности организма этими
6 витаминами, что затрудняет их применение в этих условиях для указанной цели.
Впервые предложен методический подход к исследованию обмена водорастворимых витаминов в норме и при различных патологических состояниях, основанный на изучении, с учетом межвитаминных взаимодействий, зависимости экскреции витамина или его метаболита с мочой от его содержания в крови. Это позволяет не только выявлять особенности обмена, но и устанавливать критерии обеспеченности организма исследуемым витамином. Дано биохимическое обоснование критериям нормальной обеспеченности организма витаминами группы В.
Установлены величины часовой экскреции рибофлавина, 4-ПК и I-MHA с мочой, характерные для нормальной обеспеченности соответствующими витаминами детей 5-7, 9-II и 12-14 лет.
Впервые выявлены особенности обмена рибофлавина при ИЗСД, проявляющиеся в его повышенном выведении с мочой и снижении его уровня в эритроцитах и тканях. Прослежена взаимосвязь между степенью изменения обмена рибофлавина и длительностью заболевания, а также уровнем гликемии. Установлены критерии обеспеченности витаминами группы В организма детей и взрослых, больных ИЗСД.
На основании сравнения кривых зависимости экскреция - содержание витамина в плазме и/или эритроцитах для больных и здоровых людей охарактеризован обмен витаминов В,, Bg и РР при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, ИБС, гипертонической болезни.
Научно-практическое значение работы. Высокочувствительный биоспецифичный флуоресцентный метод титрования рибофлавина в плазме крови с помощью РбСБ применяется в научных медицинских институтах России и Украины (рац. предложение "Метод количественного определения рибофлавина в плазме (сыворотке) крови с помощью РбСБ" .№64/3-90).
В ходе сравнительного анализа проведены оптимизация и усовершенствование методов определения витаминов группы В и их метаболитов в крови и моче, которые могут применяться для диагностики гиповита-минозных состояний (рац. предложение "Использование при определении концентрации никотинамидных коферментов в биологических образцах в качестве внутреннего стандарта препарата НАД" № 65/4-90).
Разработанный методический подход (изучение кривых зависимости кровь-моча) был успешно применен для установления критериев обеспеченности витаминами С (Коденцова В.М. с соавт.,Вопр.мед.химии. 1995, Т.41,Ж,С.53-57) и Bj (Коденцова В.М. с соавт.,Вопр.мед.химии. 1994, Т.40,ХЄ,С.45-48) организма здоровых людей и детей, больных целиакией (Коденцова В.М. с соавт.,Вопр.мед.химии. 1995,Т.41,JW.C.41-45), под-
7 ход может быть рекомендован для установления критериев и выявления особенностей обмена водорастворимых витаминов при других заболеваниях
Установлены величины часовой экскреции витаминов группы В, характерные для нормальной обеспеченности детей разного возраста соответствующими витаминами, что позволяет рекомендовать эти удобные и неннвазивные методы для оценки витаминного статуса детей.
Выявлены особенности обмена рибофлавина при ИЗСД. Установленные критерии обеспеченности организма при этом и других заболеваниях позволят проводить правильную оценку обеспеченности витаминами и корректировку рационов.
Полученная информация может быть использована в научно-исследовательской работе, медицинской и педагогической практике.
Разработанные методы и критерии использованы в массовых обследованиях витаминной обеспеченности различных групп взрослого и детского населения РФ, осуществлении и оценке эффективности мероприя-тий, направленных на коррекцию имеющихся витаминных дефицитов (поли-гшювитаминозов), оптимизацию витаминного статуса.
Совместно с кафедрой питания детей и подростков РМА ПО разработан и апробирован способ использования поливитаминных премиксов для обогащения готовых блюд с целью улучшения витаминного статуса детей, страдающих ИЗСД. Полученные результаты послужили основанием для разработки Информационного письма и инструкции "Профилактическая витаминизация детей в дошкольных, школьных, лечебно-профилактических учреждениях и домашних условиях" (Минздрав РФ, Москва,1994). .
Апробация диссертации. Результаты исследований доложены на 8 и
9 Международных симпозиумах "Vitamin В& and carbonyl catalysis"
(Япония, 1990; Кипр, 1994); Всесоюзной конференции "Клиническая витаминология" (Москва, 1991); республиканской научной конференции "Питание и здоровье" (Таллинн, 1991); I Конгрессе "Vitamins and Bio-factors in Life Science" (Japan, 1991); V Национальном Конгрессе по питанию (Болгария, 1993); заседании секции "Витаминологии" МОИП (1992, 1993); конференции "Проблемы рационального питания детского и взрослого населения, проживающего на территориях, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской АЭС" (Брянск, 1993); научно-практической конференции "Радиационно-экологические и медицинские аспекты последствии аварии на Чернобыльской АЭС" (Киев, 1993); симпозиуме "Витамины и здоровье" (Москва, 1994); международном конгрессе "Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты" (Москва, 1994); научно-практической межреспубликанской конференции "Проблемы детского питания в условиях формирования рыночных отношений" (Екатеринбург, 1994); секции питания Московского городского общества детских врачей (Москва, 1995); выставке-семинаре диа-бетологического общества "Диабет: новые подходы к лечению" (С.-Петербург, 1995); 7 Европейской конференции "Over- and Undernutrition" (Австрия, 1995); международном симпозиуме "Витамины и здоровье населения Беларуси и смежных регионов (Гродно, 1995); 2 Симпозиуме "Неннвазивные методы диагностики" (Москва, 1995); 2 Конгрессе педиатров
России "Болезни органов пищеварения у детей. Питание здоровых и больных детей" (Н.Новгород, 1996); на заседании ученого совета Института питания РАМН (1993, 1996); 2 международном симпозиуме "Питание и здоровье: биологически активные добавки к пище" (Москва,1996); международной конференции "Лечебно-профилактическое и детское питание" (С.-Петербург, 1996); международном симпозиуме "Клиническая лабораторная диагностика - состояние и перспективы" (С.-Петербург,1996)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 43 работы.
Объем и структура работы. Диссертационная работа, общим объемом Д95~стр., состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического указателя (383 источника), содержит 35 таблиц и 52 рисунка.
