Введение к работе
Актуальность темы. Последние десятилетия стали периодом интенсивного развития и внедрения иммунодиагностических тест-систем с использованием новых материалов и систем регистрации. Их явные преимущества заключаются не только в высокой чувствительности и специфичности, но и в простоте применения и учета результатов, что существенно расширяет возможности их использования. Иммунодиагностические тест-системы могут быть эффективно применены как для идентификации разнообразных биологических соединений, так и для изучения их физико-химических и биохимических свойств (Дзантиев, 2010). Как правило, биологическими компонентами, используемыми в тест-системах для специфического взаимодействия с антигенами (АГ), являются антитела (AT). Способность AT узнавать и с высокой аффинностью связываться с определенными участками АГ (антигенными детерминантами) даже в сложной смеси соединений сделала их ключевыми объектами в широком диапазоне приемов обнаружения и изучения АГ. Получение и выбор подходящих AT - необходимый этап успешного проведения иммуноанализа. Традиционно это специфические поли- и моноклональные антитела. Однако, применение как поликлональных, так и моноклональных антител сопряжено с рядом трудностей.
Существуют ситуации, когда иммунизация животных по какой-либо причине невозможна или не удается обойти их толерантность к выбранному АГ. Для разрешения этой проблемы в настоящее время предложены методы молекулярного клонирования фрагментов генов AT. Одним из таких методов является технология фагового дисплея AT. К достоинствам метода фагового дисплея можно отнести возможность отбора клонов-продуцентов мини-антител in vitro, минуя стадию иммунизации животных, возможность получения AT к аутоантигенам, токсинам и слабоиммуногенным соединениям, сокращение времени получения индивидуальных клонов до 10-14 дней по сравнению с несколькими месяцами в случае гибридомной технологии, относительную простоту получения мини-антител и их низкую себестоимость, возможность создания гибридных молекул AT с маркерными белками (McCafferty et al, 1990).
В современной литературе встречается множество работ, посвященных получение фаговых антител к различным по структуре и свойствам AT (Molloy et al., 1998; Amersdorfer et al, 1999; Liu et al, 2000; Yu et al, 2005; Smith et al., 2007 и др.). Однако количество работ по проблеме получения мини-антител против целых бактериальных клеток невелико (de Greeff et al, 2000; Naseem et al., 2009). Работ, посвященных получению мини-антител к бактериальной поверхности почвенных микроорганизмов (в частности, азоспирилл), нами обнаружено не было.
Получение AT к низкомолекулярным и слабо иммуногенным АГ (гаптенам) является ещё одной актуальной задачей современной иммунохимии. Тест-системы на основе AT являются весьма удобным (зачастую единственным) средством мониторинга таких АГ как витамины, гормоны, антибиотики, наркотики и др. Кроме того, AT к отдельным участкам биомакромолекул являются незаменимым инструментом в исследованиях их структуры и топографии. Традиционно такая задача решается с использованием химического присоединения гаптена к белковому носителю, применением адъювантов и напряженных схем иммунизации животных полученным конъюгатом. Однако при этом образуются AT как против гаптена, так и
против иммунодетерминантных участков носителя. Причем далеко не всегда при использовании подобного носителя развивается выраженный иммунный ответ на слабо иммуногенные АГ. Кроме того, последующая очистка и скрининг получаемых AT трудоемки и дороги, а их титр и аффинность зачастую оказываются низкими (Ковалев, Полевая, 1985).
В 1986 г. был описан способ получения AT к ряду гаптенов in vivo с использованием коллоидного золота (КЗ) в качестве носителя AT (Shiosaka et ah, 1986). В работах (Дыкман и др., 2004; Dykman et al., 2010) были приведены варианты получения AT in vivo к большому количеству гаптенов различной природы с использованием в качестве носителя золотых наночастиц. Было отмечено, что КЗ и его конъюгаты не обладает токсичностью в отношении перитонеальных клеток. Однако многие аспекты вопросов взаимодействия КЗ с клетками иммунной системы остаются открытыми.
Таким образом, к моменту начала исследований, представленных в данной диссертации, имелся ряд нерешенных вопросов, связанных с проблемами использования КЗ в качестве носителя для получения AT к слабо иммуногенным АГ, получения фаговых антител на целые клетки микроорганизмов, применения миниантител и биомаркеров на основе КЗ в исследованиях поверхностных структур клеток и в диагностических тест-системах. Их рассмотрение связано с изучением биохимических и иммунологических процессов, происходящих в ответ на проникновение в организм животных наноразмерных частиц золота, используемых в качестве носителей антигенов. Мы исходили из того, что уникальные свойства наноструктурированных объектов создают, кроме всего прочего, весьма благоприятную основу для конструирования новых типов диагностических систем.
Целью диссертационной работы было усовершенствование и развитие методов получения антител к разнообразным антигенам in vitro путем селекции антител из комбинаторной фаговой библиотеки и in vivo с использованием их конъюгатов с наночастицами золота и изучение механизмов взаимодействия полученных конъюгатов с фагоцитирующими клетками иммунной системы с последующим конструированием на этой основе диагностических тест-систем.
Для достижения данной цели в работе решались следующие задачи:
Получить антитела к туберкулину и вирусу трансмиссивного гастроэнтерита с использованием наночастиц золота в качестве носителя антигена и адъюванта.
Исследовать влияние золотых наночастиц и их конъюгатов с антигенами на показатели клеточного и гуморального иммунитета лабораторных животных.
Провести селекцию мини-антител к туберкулину, целым животным и бактериальным клеткам (СПЭВ, A. brasilense) с использованием овечьей фаговой библиотеки.
Оценить эффективность использования в иммуноанализе конъюгатов антител, полученных in vivo и in vitro, с частицами коллоидного золота микроскопическими и твердофазными методами.
Научная новизна работы:
впервые получены поликлональные антитела на туберкулин и вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней с использованием в качестве носителя наночастиц коллоидного золота;
получены данные о влиянии коллоидного золота и его конъюгатов с вирусом и туберкулином на дыхательную активность перитонеальных макрофагов и выработку интерферона;
впервые получены мини-антитела на целые клетки Azospirillum brasilense Sp245 с использованием овечьей фаговой библиотеки;
разработаны методики экспресс-диагностики возбудителя туберкулёза, биоимиджинга опухолевых клеток и детекции A. brasilense Sp245.
Практическая значимость работы определяется усовершенствованием технологии получения антител к низкоиммуногенным антигенам с использованием адьювантных свойств наночастиц КЗ, получением экспериментальных свидетельств эффективности применения конъюгатов золотых наночастиц при вакцинации животных; разработкой иммунологических тест-систем для обнаружения, идентификации и изучения микроорганизмов, количественного биоимиджинга опухолевых клеток.
На защиту выносятся следующие основные положения:
Использование коллоидного золота в качестве носителя антигенов и адъюванта обеспечивает получение in vivo поликлональных антител против туберкулина и вируса трансмиссивного гастроэнтерита; полученные антитела могут быть использованы в диагностических целях.
Взаимодействие функционализованных золотых наночастиц с клетками ретикулоэндотелиальной системы приводит к их проникновению в фагоцитирующие клетки, вызывает стимулирование дыхательной активности макрофагов и усиливает выработку цитокинов.
Полученные при помощи фаговой библиотеки мини-антитела к растворимым (туберкулин) и корпускулярным (СПЭВ, A. brasilense) антигенам обладают высокой специфичностью и чувствительностью и могут быть использованы для создания иммунологических тест-систем.
Работа выполнена в лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: «Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями» (№ гос. регистрации 01200606177, научный руководитель - д.х.н. проф. СЮ. Щеголев) и «Комплексный иммунохимический анализ эктосимбиотических растительно-микробных систем» (№ гос. регистрации 01200904388, научный руководитель - д.х.н. проф. СЮ. Щеголев).
Частично данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (гранты №№ 07-04-00301-а и 09-02-12442-офим) и программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».
Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с д.б.н. С.А. Староверовым. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.
Эксперименты по оценке эффективности мечения клеток конъюгатами наночастиц золота были выполнены совместно с к.ф.-м.н. В.А. Ханадеевым.
Эксперименты по изучение поверхностных антигенов азоспирилл - совместно с д.б.н. О.И. Гулий. Препараты флагеллина и липополисахарида азоспирилл были получены и любезно предоставлены к.б.н. Г.Л. Бурыгиным.
Апробация результатов. Основные результаты диссертации представлялись автором на следующих научных конференциях: Int. School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics and Biophysics (Saratov, Russia, Sept. 23-26, 2008, Sept. 21-24, 2009); 5-й Московский межд. конгр. "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 16-20 марта 2009); межд. конф., посвященная 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии "Актуальные проблемы ветеринарной науки в агропромышленном комплексе" (Самара, Россия, 16-17 сент. 2009); 2-я всеросс. научн. конф. с межд. участием "Нанотехнологии в онкологии 2009" (Москва, Россия, 9-10 окт. 2009); межд. раб. совещ. "Инновационные подходы в профилактике, диагностике и лечении зооантропонозных и метаболических болезней животных и человека в Саратовской области" (Саратов, Россия, 16-17 нояб. 2009); межд. научн.-практ. конф. "Вавиловские чтения - 2009" (Саратов, Россия, 25-26 нояб. 2009); 14-я Пущинская межд. школа-конф. молодых ученых: "Биология - наука XXI века" (Пущино, Россия, 19-23 апр. 2010); межд. научн. конф. "Биотехнология начала III тысячелетия" (Саранск, Россия, 26-28 мая 2010); научн.-практ. конф. "Инновации РАН - 2010" (Казань, Россия, 1-4 июня 2010); XII Intern. Conf. on Laser Applications in Life Sciences (Oulu, Finland, June 9-11 2010); V всеросс. конф. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, Россия, 28 сент. - 1 окт. 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 6 статей, три из которых - в рецензируемых журналах из списка ВАК.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 3 главы, заключения и списка использованных литературных источников (275 наименований). Работа изложена на 159 страницах, иллюстрирована 42 рисунками и включает 2 таблицы.
