Введение к работе
Актуальность темы. Интерес к исследованию обменных процессов коллагенов закономерен и связан с черезвычайно пирокой распространенностью, важностью выполняемых функций и участием этих белков во многих нормальных физиологических, защитно-репаративішх и патологических процессах. Сдвиги в синтеза и/или распаде коллагенов сопровождают многие распространенные заболевания, такие как: атеросклероз, гипертония, диабет, злокачественные опухоли, коллагенози. Изменения в обмене коллагенов наступают на раннем этапе, еще до появления клинических признаков заболеваний, а независимое прослеживание обмена отдельных типов коллагенов может дать информацию об эффективности лечения и благоприятном или неблагоприятном прогнозе развития заболевания, например о необратимом фиброзном перерождении ткани.
Возможное диагностическое и прогностическое значение информации об обмене коллагенов ставит вопрос о методических возможностях его исследования. Существуют два альтернативных направления:
- биопсия и гистологическое исследование бноптатов. Хотя это исследование информативно, видна лишь статическая морфологическая картина уже произошедших изменений. Иногда биопсии проти-вопоказно делать, а также их невозможно часто повторять; - поиск специфических маркеров в биологических жидкостях, отражающих обменные процессы коллагенов. Это либо ферменты, специфические для метаболизма коллагенов, либо сами коллагены и их фрагменты (пропептиды проколлагенов, фрагменты трехспиральноЯ структуры коллагенов). Высокая информативность этого направления исследования состоит в возможности прослеживания обмена коллаге-
нов в динамике. Однако здесь существуют методические проблемы, касающиеся чувствительности тестов и возможности оценить в отдельности синтез либо распад отдельных типов коллагенов.
Исследование, активности или иммунореактивности ферментов, участвующих в метаболизме коллагенов, дает информацию в отдельности как о синтезе, так и о распаде, однако не касается обмена конкретных типов коллагенов. Биохимическое определение белок-связанного гидроксипролина - специфической модифицированной аминокислоты коллагенов и других белков с трехспиральной структурой - мало информативно из-за невозможности дифференциации отдельных типов коллагенов; кроме того, сказывается интерференция со стороны других белков плазмы, содержащих трехспиральную структуру (clq комплемента и маннозосвязывающий белок). Иашунохимическое определение коллагенов позволяет-избежать эту интерференцию. Тест-системы для определения пропептидов проколлагенов обладают высокой чувствительностью и типоспецифичностью, но неоднозначно отражают синтез либо распад коллагенов. Фрагменты трехспиральной структуры коллагенов отражают прежде всего процесс распада. Учитывая, что механизмы клиренса пропептидов проколлагенов и фрагментов коллагенов независимые, имеет смысл разработать тест-системы для определения фрагментов трехспиральной структуры коллагенов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось конструирование иммунофермєнтішх тес г-систем на основе моноклональных антител к коллагенам человека для определения различных типов коллагенов в растворе и применение разработанных тестой к сыверотке и плазме крови.
Для достижения поставленной цели предстояло последовательно решить нескольких задач:
-
Получить инструмент иммунохимического анализа - монокло-нальные антитела к коллагенам человека, обладающие типовой специфичностью для коллагенов II, III и IV типов.
-
Накопить из асцитов антитела в необходимом для дальнейшей работы количестве. Аффично очистить из антисывороток кроличьи по-ликлональные антитела с типовой специфичностью для коллагенов человека.
-
Охарактеризовать полученные и ухе имеющиеся антитела к коллагенам человека применительно к их использованию в иммунофер-ментном анализе (специфичность, аффинность).
-
Сконструировать иммуноферментные тест-системы в ингибитор-ном и сэндвич вариантах для определения коллагеновых белков в растворе. Оптимизировать тесты по чувствительности.
5. Исследовать биораспределение коллагенов в крови in vitro, учитывая их взаимодействие с форменными элементами и с белками крови, в свою очередь имеющими сродство к коллагенам (фибронек-тин, clq системы комплемента).
Научная новизна работы. Нами впервые исследованы особености гуморального иммунного ответа к разным типам коллагенов человека у Balb/c линии мышей, рутинно используемой для получения гибридом Выявлены ограничения в применении этой линии для получения типо-специфических моноклональных антител к коллагенам человека, обладающих высокой аффинностью. При этом впервые получек штамм гибри-домных клеток - продуцентов антител, узнающих центральную детерминанту (только в денатурированной форме) коллагена человека IV типа. Впервые исследовано биораспределение коллагена в цельной крови in vitro и поведение коллагенов как крио- и эуглобулинов
плазмы. Показано, что взаимодействие с фибронектином плазмы не является помехой для определения коллагена с помещью высокочувствительных тест-систем.
Практическая значимость работы. Результаты исследований могут послужить основой для дальнейших разработок е направлении мониторинга обменных процессов коллагенов путем анализа биологических жидкостей. Получены типоспецифические моноклоналыше антитела к коллагенам человека, которые могут быть использованы для решения задач, где первостепенной является типоспецифичность - иммуногис-тохимия, аффинная очистка отдельных типов холлагенов, структурные исследования. Антитела к денатурированной форме коллагена IV типа могут быть полезными для выяснения локализации в тканях областей деградации этого типа коллагена. Тесттсистема в сэндвич-варианте для определения коллагена I типа может быть использована при оценке его синтеза в культуре клеток.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на XII научной конференции болгарских аспирантов с международным участием (Москва,1990г. ), на II всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1990г.) и на межлаборатерной конференции Института экспериментальной кардиологии КНЦ РАМН.
Публикации. По теме диссертации имеются 2 публикации.
Обьрм и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, заклвчения, вызодов и списка литературы (264 ссылок, из которых 243 зарубежных). Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 2 3 рисунками и 10 таблицами.
